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无需标记的免疫沉淀质谱工作流程用于大规模核相互作用组分析

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DOI：

10.3791/60432

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2019年11月17日

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1Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, University of Colorado, 2Linda Crnic Institute for Down Syndrome, University of Colorado School of Medicine

本文内容

摘要

本文描述了一种蛋白质组学工作流程，用于从细胞核亚细胞组分中鉴定特定目标蛋白的相互作用蛋白伙伴。该流程采用免疫亲和富集结合无标记质谱分析技术，包括亚细胞分级分离、免疫沉淀、滤膜辅助样品制备、离线纯化、质谱分析以及后续的生物信息学分析流程。

摘要

免疫亲和纯化质谱法（IP-MS）已成为一种强大的定量方法，用于鉴定蛋白质-蛋白质相互作用。本文介绍了一种完整的相互作用蛋白质组学工作流程，旨在从细胞核中鉴定低丰度的蛋白质-蛋白质相互作用，该流程也可应用于其他亚细胞区室。该工作流程包括亚细胞分级分离、免疫沉淀、样品制备、离线纯化、单次无标记质谱分析以及下游的计算分析和数据可视化。我们的方案经过优化，可通过从分级分离的亚细胞区室中对内源性蛋白质进行免疫沉淀，检测那些在全细胞裂解液中难以鉴定的区室化、低丰度相互作用（例如细胞核中的转录因子相互作用）。本文所述的样品制备流程提供了详细的HeLa细胞核提取物制备、内源性诱饵蛋白的免疫亲和纯化以及定量质谱分析的操作说明。我们还讨论了在基于质谱的相互作用谱型分析实验中进行大规模免疫沉淀的方法学考量，并提供了评估数据质量的指南，以区分真实的蛋白质相互作用与非特异性结合。本文以研究CMGC激酶DYRK1A的细胞核相互作用组为例展示了该方法的应用，DYRK1A是一种在细胞核内相互作用尚不明确的低丰度蛋白激酶。

引言

人类蛋白质组通过形成稳定的多亚基复合物和瞬时的蛋白质-蛋白质相互作用，展现出广泛的结构和生化多样性。因此，在研究中为了揭示分子机制，通常需要鉴定目标蛋白质的相互作用伙伴。近年来亲和纯化方案的进步以及高分辨率快速扫描质谱仪器的出现，使得仅通过一次无偏倚实验即可轻松绘制出蛋白质相互作用图谱。

蛋白质相互作用实验方案通常采用带有亲和标签的融合构建体的异源表达系统，以鉴定蛋白质相互作用，而无需依赖能够识别目标蛋白的高质量抗体1,2。然而，基于表位标签的方法存在若干缺点。表位标签可能产生物理性相互作用，导致非特异性共纯化蛋白被检测到3。此外，将这些表位标签融合至蛋白的N端或C端可能阻碍天然的蛋白质-蛋白质相互作用，或干扰蛋白折叠，从而诱导非生理性的构象4。再者，异源表达系统通常使诱饵蛋白在超生理浓度下过表达，可能导致虚假蛋白质相互作用的鉴定，尤其对于剂量敏感型基因而言更为显著5。为避免上述问题，可在具备识别天然蛋白的高质量抗体的前提下，对内源性诱饵蛋白及其相互作用的猎物蛋白进行免疫共沉淀。

本文提供了一种相互作用蛋白质组学的工作流程，以CMGC蛋白激酶DYRK1A为例，用于检测内源性蛋白的细胞核相互作用组。DYRK1A的拷贝数、活性水平或表达水平的紊乱可导致人类严重的智力障碍，并在小鼠中引起胚胎致死性6,7,8,9。DYRK1A表现出动态的时空调控特性10，以及区室化的蛋白质相互作用11,12，因此需要能够检测在不同亚细胞区室中特异存在的低丰度相互作用蛋白的技术方法。

本方案采用人源HeLa细胞的细胞质与核质组分分离、免疫沉淀、质谱样品制备，以及生物信息学分析流程的概述，用于评估数据质量并可视化结果，同时提供R语言脚本用于数据分析与可视化图1). 本工作流程中使用的蛋白质组学软件包均可免费下载，或可通过网络界面访问。有关软件和计算方法的更多详细信息，可通过提供的链接获取深入的教程和操作指南。

方案

注意：所有缓冲液成分和蛋白酶混合物的配方均列于表1中。

1. 细胞的制备

注意：本免疫沉淀质谱法（IP-MS）实验建议每份重复样品使用1−10 mg核裂解物作为起始材料。以下细胞用量以进行三份核免疫沉淀实验及三份对照实验（每份使用1 mg核裂解物）为例给出。

  1. 若使用贴壁细胞系，每组实验在3个15 cm培养皿中将细胞培养至90%融合度后再进行收集。
    注意：建议对诱饵组和对照组至少进行三次重复免疫沉淀实验。本方案假设使用“仅 beads”对照（从第4节开始），以排除beads的非特异性结合干扰。其他类型的对照也可能有用，相关内容在讨论部分有详细说明。
    1. 用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤培养皿两次，每15 cm培养皿加入3 mL 0.25%胰蛋白酶进行消化。在1,200 × g 条件下离心5分钟，弃去胰蛋白酶。
  2. 对于悬浮细胞，培养至相近规模/密度，以获得总量为70−80 mg的总蛋白。
    1. 在4 °C、1,200 × g 条件下离心5分钟收集细胞，小心弃去培养基。
      注意：此步骤中可合并多个细胞沉淀，以便高效进行第2节所述的大规模亚细胞分级分离。
  3. 用含蛋白酶抑制剂（PIs）和磷酸酶抑制剂（PhIs）的PBS + 5 mM MgCl2 溶液洗涤细胞沉淀两次（见表1）。
    注意：细胞沉淀可用液氮速冻，并在-80 °C保存，待进行分级分离时使用。

2. 核提取物的制备

注意：蛋白酶和磷酸酶抑制剂应在使用前30分钟内加入到分级缓冲液中。

  1. 如果细胞沉淀为冷冻状态，加入相当于1倍沉淀体积的预冷Buffer A + PIs/PhIs，在15分钟内解冻。将细胞沉淀置于4 °C的旋转混合仪上，以助于解冻过程中重悬。若非冷冻样品，则将步骤1.3获得的细胞沉淀用相当于1倍沉淀体积的Buffer A + PIs/PhIs重悬。
    1. 在4 °C下以2,000 × g离心10分钟，弃去上清液。
  2. 用相当于5倍压紧细胞体积的Buffer A重悬细胞，并在冰上孵育20分钟。
  3. 在4 °C下以2,000 × g离心10分钟，弃去上清液，然后用相当于2倍原始压紧细胞体积的Buffer A + PIs/PhIs重悬沉淀，使用“A”型松散研杵上下研磨约7次。
  4. 将裂解物在4 °C下以2,000 × g离心10分钟。
  5. 小心吸取上清液，并用液氮速冻，于-80 °C保存。此步骤所得上清液即为细胞质亚细胞组分。
    注意：此步骤中的核沉淀可通过液氮速冻并储存于-80 °C予以保留。
  6. 用相当于0.9倍沉淀体积的Buffer B + PIs/PhIs重悬沉淀，并在4 °C下于旋转混合仪上混合5分钟。
  7. 为裂解细胞核，使用更紧密的“B”型研杵研磨20次。
  8. 将核裂解物在4 °C下于旋转混合仪上混合30分钟，使其均匀。
  9. 将核裂解物在4 °C下以21,000 × g离心30分钟，吸走上清液，保存为可溶性核蛋白提取物。
    注意：对所得核沉淀进行核酸酶处理，可回收染色质结合蛋白组分。
  10. 将可溶性核提取物在4 °C下用Buffer C + PIs透析3小时。
    1. 取一段适当长度的24 mm宽、截留分子量为8 kDa的透析管，夹闭一端，将核质成分装入管内。装样后夹闭另一端，浸入盛有Buffer C + PIs的洁净玻璃容器中。
  11. 将透析后的核提取物/核质在4 °C下以21,000 × g离心30分钟。分装3份各20 µL的核提取物样品，用于后续Western blot分析以验证组分分离效果。用于IP-MS分析的核提取物可根据需要进行分装，用液氮速冻后于-80 °C保存。

3. 细胞组分分离的验证

  1. 进行蛋白质定量分析以确定核裂解液的蛋白质浓度。双辛可宁酸（bicinchoninic acid）蛋白质定量法对后续应用具有足够的灵敏度。
  2. 按照先前所述方法13，在SDS-PAGE凝胶上分别加载20 µg的细胞质组分和核组分用于Western印迹分析。加样时应跳过泳道，以避免样品误判。
  3. 使用p84（THOC1）作为核标志物、GAPDH作为细胞质标志物进行Western印迹检测。通过核组分中细胞质标志物的比例以及细胞质组分中核标志物的比例来评估分馏效果。
    注意：也可使用其他核和细胞质标志物的抗体。

4. 内源性核诱饵蛋白的免疫沉淀

注意：建议从此步骤开始使用低吸附离心管。这将减少样品处理过程中样品与管壁的非特异性结合，避免样品不必要的损失。此外，确保使用液相色谱-质谱级水（LCMS grade H2O）配制后续步骤所需的缓冲液。

  1. 为每个重复组准备蛋白A/G磁珠混合物：在微量离心管中分别加入12.5 µL的蛋白A和蛋白G磁珠体积。将磁珠储存液以含20%乙醇的悬液形式保存。测定悬液中磁珠的浓度 %(v/v)，并使用尖端已被剪切的移液枪头吸取所需体积，以确保磁珠能够进入枪头。
  2. 用300 µL的IP缓冲液1洗涤蛋白A/G磁珠混合物2次。在4 °C下以1,500 × g离心1分钟，弃去上清液。
  3. 制备抗体-蛋白A/G磁珠：为使抗体与磁珠结合，加入300 µL IP缓冲液1和10 µg目标抗体。将磁珠/抗体混合物置于4 °C旋转仪上轻轻摇动过夜。对于仅含磁珠的对照组，不添加任何抗体。
    注意：每份重复组使用10 µg抗体可作为起始量，但具体用量需根据所用抗体种类及裂解液规模进行优化。
  4. 将步骤2.10中的核裂解液在水浴中解冻，并分装适当体积至低吸附微量离心管中，每份重复组加入1 mg蛋白量。
    1. 在16,000 × g、4 °C条件下离心裂解液30分钟，将上清液转移至新管中。
    2. 每1 mg核裂解液中加入1 µL苯并核酸酶（250单位/µL），在4 °C旋转仪上轻轻摇动10–15分钟。
  5. 准备用于预清除裂解液的磁珠。参照步骤4.1，在1.5 mL低吸附微量离心管中分别加入12.5 µL蛋白A和蛋白G磁珠。用IP洗涤缓冲液1 + 蛋白酶抑制剂（PIs）洗涤2次，离心后弃去上清液。
  6. 将1 mg核裂解液加入步骤4.5所得磁珠中。在4 °C旋转仪上轻轻摇动孵育1小时。
    1. 在1,500 × g、4 °C条件下离心预清除后的裂解液1分钟。
    2. 在核裂解液与磁珠孵育的同时（步骤4.6.1），用IP缓冲液1 + 蛋白酶抑制剂（PIs）洗涤抗体-蛋白A/G磁珠2次。每次在1,500 × g、4 °C条件下离心1分钟，弃去上清液。
  7. 将步骤4.6.1中获得的预清除核裂解液转移至抗体-蛋白A/G磁珠中。在4 °C旋转仪上轻轻摇动孵育4小时。孵育结束后在1,500 × g、4 °C条件下离心1分钟。
  8. 将上清液转移至标记为“流穿液”的对应重复组收集管中。
  9. 用1 mL IP缓冲液2 + 蛋白酶抑制剂（PIs）洗涤抗体-蛋白A/G磁珠。在1,500 × g、4 °C条件下离心1分钟，弃去上清液，重复洗涤共3次。
  10. 用1 mL IP缓冲液1 + 蛋白酶抑制剂（PIs）洗涤磁珠2次，离心条件同前一步。确保最后一次洗涤后彻底去除所有缓冲液。
  11. 每次加入20 µL 0.1 M甘氨酸洗脱液（pH 2.75），共洗脱2次，每次30分钟。确保孵育过程中管子持续轻轻摇动。每次孵育后在750 × g、4 °C条件下离心1分钟，并用移液器小心移出上清液。
    注意：尽管此处描述的低pH甘氨酸法可洗脱大多数目标蛋白，但某些抗体-抗原相互作用需要更严格的缓冲条件。
  12. 将洗脱液迅速在液氮中冷冻，随后于-80 °C保存。

5. 样品制备

注意：在三氯乙酸（TCA）沉淀及样品处理过程中，向免疫沉淀洗脱样品中添加胰岛素有助于蛋白质的回收，这对于丰度较低的内源性诱饵蛋白尤为重要。

  1. 如果洗脱液已冷冻，则在室温下解冻。
    1. 将样品置于冰上，每100 µL洗脱液加入10 µL浓度为1.0 mg/mL的胰岛素。涡旋混匀后立即加入10 µL 1%脱氧胆酸钠。再次涡旋混匀，随后加入30 µL 20%三氯乙酸（TCA），最后再进行一次涡旋。
    2. 将样品在冰上孵育20分钟，然后在4 °C下以21,000 × g离心30分钟。
    3. 吸除上清液，加入0.5 mL预冷至-20 °C的丙酮。涡旋混匀后，在4 °C下以21,000 × g离心30分钟。重复此步骤一次。
    4. 吸除上清液，将管底残留的沉淀在空气中干燥。
  2. 采用改良的滤膜辅助样品制备法（Filter Aided Sample Prep, FASP），优化以减少样品操作步骤，进行质谱分析样品的制备，具体步骤如下14。
    1. 用30 µL SDS烷基化缓冲液（见表1）重悬第5.1.4步获得的蛋白沉淀。将样品置于95 °C金属浴中孵育5分钟。随后在室温下冷却15分钟，再进行下一步操作。
    2. 向每个样品中加入300 µL UA溶液和30 µL 100 mM TCEP。将该溶液加载至30k超滤离心滤膜上。在室温下以21,000 × g离心10分钟。
      注：此时目标蛋白及其潜在互作蛋白应已截留在滤膜上。但可保留穿滤液，以防滤膜出现问题。
    3. 用250 µL UA溶液洗涤滤膜，在室温下以21,000 × g离心10分钟。倾去穿滤液，并重复洗涤共3次。
    4. 用100 µL 100 mM Tris（pH 8.5）洗涤滤膜，在室温下以21,000 × g离心10分钟。倾去穿滤液，并重复洗涤共3次。
    5. 加入3 µL浓度为1 µg/µL的Lys C（溶于0.1 M Tris pH 8.5中）。将滤膜内液体补至100 µL刻度线，置于37 °C摇床（nutator）上轻柔振荡，消化1小时。
    6. 加入1 µL浓度为1 µg/µL的质谱级胰蛋白酶（trypsin）。轻轻混匀，置于37 °C摇床（nutator）上轻柔振荡，过夜孵育。
    7. 以21,000 × g离心20分钟，将肽段从滤膜上洗脱。
      注：可能需要多次离心才能完全回收所有洗脱液。若未充分执行此步骤，可能导致严重的样品损失。
  3. 使用C18离心柱对肽段进行脱盐处理。按照制造商提供的操作说明进行。
  4. 将冻干的肽段溶于7 µL含0.1%三氟乙酸（TFA）的5%乙腈溶液中。超声处理3分钟以确保肽段充分重悬。在14,000 × g下离心10分钟。
  5. 将重悬后的肽段转移至合适的样品瓶中，用于上样至液相色谱-质谱联用系统（LC/MS）。

6. 液相色谱/质谱系统适用性

注意：由于亲和纯化样品中的蛋白质含量通常较少且丰度较低，因此液相色谱-质谱（LC/MS）平台必须具备最大程度的灵敏度和稳定性，这一点至关重要。

  1. 为流动相 A，将 1 mL 液相色谱-质谱级甲酸加入 1 L 液相色谱-质谱级水中；为流动相 B，将 1 mL 液相色谱-质谱级甲酸加入 1 L 液相色谱-质谱级乙腈中。
  2. 制备或安装一根内径为 75 µm 的熔融石英毛细管柱，填充粒径 <2 µm、长度 ≥250 mm 的反相 C18 树脂。将样品直接进样至色谱柱可获得最佳结果。
  3. 使用新鲜的流动相冲洗超高效液相色谱（UPLC）系统。安装 C18 色谱柱后，使用合适的电喷雾发射器（例如内径 20 µm × 外径 360 µm，拉制至尖端 10 µm）建立稳定的流速和电喷雾。将色谱柱温度维持在 40−60 °C。
  4. 通过进样复杂的质控标准品（例如 100−200 ng HeLa 全细胞裂解液胰蛋白酶消化产物）测试整体液相色谱-质谱系统的性能。使用适用于复杂样品的梯度程序进行洗脱（例如 2−3 小时梯度洗脱时间）。建立肽段和蛋白质鉴定的基线系统性能。
    注意：为获得最佳结果，从 20,000−35,000 个独特肽段中鉴定出 3,000−5,000 个或更多蛋白质，可为实验样品提供最优的系统性能。
  5. 对于常规的液相色谱-质谱系统适用性测试，进样 100−200 fmol 或更少的单一蛋白质消化标准品（例如牛血清白蛋白，BSA）。使用短梯度程序洗脱（例如 20−30 分钟）。
    注意：多次进样蛋白质消化标准品有助于建立液相色谱-质谱系统的基线性能，每次免疫共沉淀-质谱（IP-MS）样品后重复进样可监测整个实验过程中系统性能的变化，并检测仪器漂移，从而避免对无标记定量实验造成偏差。个别特征峰强度和峰形的基线数据可用于评估质谱、液相色谱及色谱柱的性能。
  6. 为避免分析柱过载，将实验样品的一小部分（总量的 15−30%）上样至色谱柱，并使用适用于复杂样品的梯度程序进行分离（例如 2−3 小时）。若蛋白质鉴定数量不理想，可将全部样品上样至色谱柱。
  7. 在样品之间运行一次单一蛋白质消化标准品，以监测液相色谱-质谱系统性能及样品残留。根据样品情况，可能需要使用多个标准品以降低样品残留。

7. 数据处理

  1. 下载位于 https://www.maxquant.org/ 的蛋白质组学软件包 MaxQuant。
    注意：此步骤将用于将第6.6步获得的质谱RAW数据文件处理为包含蛋白质ID、基因名称及相应定量值的数据表，以用于后续分析。
    1. 选择 加载 在……之内 输入数据 部分内容的子标题 原始数据 选项卡。打开存储 MS 原始文件的文件位置，并为每次 MS/MS 运行选择相应的原始文件。
    2. 点击 组特异性 标签并选择 消化在酶列表中选择 LysC 并单击右箭头，将该酶添加到将用于搜索的酶列表中。接下来，选择 仪器 并确保屏幕顶部下拉列表中显示正确的仪器类型。其他特定于组的搜索参数保持默认设置。
    3. 点击 全局参数 标签并选择 序列. 添加将用于此次搜索的分类学对应的适当 FASTA 文件。如果未执行此操作，肽段将无法被正确指认。对于人类蛋白质组，请从 UniProt 下载 FASTA 文件，网址为 https://www.uniprot.org/help/human_proteome。
    4. 在 全局参数 标签，点击 蛋白质定量. 在 用于定量的多肽 下拉菜单，选择 独特 + 一次性剃刀.
      注意：MaxQuant 可通过基于强度的绝对定量（iBAQ）和非标记定量（LFQ）对蛋白质进行替代性定量。然而，本实验方案的下游分析仅需肽段计数信息即可满足15.
    5. 在 MaxQuant 界面的左下角，选择用于搜索的处理器数量。这将直接影响运行所需的时间，因此请尽可能选择较多的处理器。点击 开始 在屏幕左下角点击以开始运行。选择 性能 在屏幕顶部的标签中查看搜索进度。
  2. 当运行完成后，使用蛋白质组学计算平台 Perseus 或其他电子表格程序打开 proteingroups.txt 文件以查看数据16.
    1. 使用 Perseus 去除常见污染物以及对反向蛋白序列的匹配结果。详细操作请参考 Perseus 官方文档：http://www.coxdocs.org/doku.php?id=perseus:user:use_cases:interactions
      注意：在分析软件（例如 Excel）中打开 proteingroups.txt 文件会自动损坏某些基因和蛋白质名称。
  3. 使用亲和纯化污染物数据库（Contaminant Repository for Affinity Purification, CRAPome）分析实验数据。请在该数据库注册账户 http://crapome.org/，并根据需要参考教程操作17,18.
    1. 使用 分析您的数据 在CRAPome主页上找到的工作流程。选择与本相互作用实验所用亲和纯化系统相对应的外部对照。
      注意：这些对照可用于计算第二次倍数变化富集，有助于检测常见污染物。
    2. 使用 Perseus 或合适的电子表格应用程序，根据 MaxQuant 输出的 proteingroups.txt 文件生成输入文件。手动格式化的详细信息请参见 http://crapome.org/?q=fileformatting。或者，可使用提供的 R 脚本“export_CRAPomeSAINT_Input_File.R”生成 SAINT/CRAPome 输入文件。详见 README.txt 中的说明 补充编码文件.
    3. 运行分析以确定免疫沉淀中每种诱饵蛋白的倍数变化富集程度和SAINT（互作组显著性分析）概率。确保 用户控制下拉菜单中选择“” FC-A，“CRAPome 对照” 或 所有对照组 被选中的 FC-B 下拉并 概率评分 用于生成SAINT概率。运行结束后，查看在下方可获得的输出结果 分析结果 以及一个作业 ID。从 分析结果 用于未来的绘图和数据可视化。
  4. 将蛋白质按照 FC-A（免疫沉淀样本 vs. 用户对照）和 SAINT 概率作图，具体操作请参照所提供的 R 脚本 补充编码文件.
    注意：提供了一套 R 脚本，用于生成 FC-A 与 SAINT 概率以及 iBAQ 与 log 的关系图2 （蛋白质丰度），根据对无标记强度进行经验贝叶斯分析所得的校正后 p 值范围进行着色。差异统计分析及绘图的详细信息见 README.txt 文件及 R 脚本“main_differential_analysis.R”中 补充编码文件.
  5. 评估诱饵蛋白已知相互作用蛋白在FC-A和SAINT中的排序情况。以FC-A设定截断值 > 3.00 和 SAINT > 0.7，作为三次重复单个诱饵实验的起始值。
    注意：确定“高置信度”互作蛋白和“低置信度”互作蛋白的截断值必须依据生物学信息。

8. 数据可视化

注意：有许多程序可有效可视化蛋白质组学数据（例如 R、Perseus、Cytoscape、STRING-DB）。分析高置信度互作蛋白之间的连接性及其功能富集情况，可作为进一步验证和功能表征候选蛋白的优先排序策略。

  1. 在 https://cytoscape.org/download.html19 下载开源网络可视化工具 Cytoscape。
  2. 准备一个制表符分隔的交互数据输入文件，该文件应包含三列：诱饵（源节点）、猎物（目标节点）、相互作用类型（边类型）。此操作可在 Perseus 或任意选定的电子表格程序中完成。
  3. 在程序左上角选择 从文件导入表格 图标（图标中有一个向下的箭头和一个矩阵）。Cytoscape 将自动将交互数据填充为网络，以便进行自定义格式化和设计。
  4. 在 Cytoscape 控制面板中选择 样式 选项卡，点击 Def 列中的方块以调整整个网络的属性。选择网络中特定的节点或边，然后点击样式菜单中 Byp. 列内的方块，以绕过默认设置并仅调整所选对象。或者，点击样式菜单顶部的下拉菜单，查看预设的网络格式。
    注意：此时可将 STRING-db 蛋白质-蛋白质相互作用数据通过输入文件手动整合到该网络中，或通过 Cytoscape 插件提供的多种富集分析工具进行整合，详见 http://apps.cytoscape.org/20。推荐用于富集分析的 Cytoscape 插件位于 http://apps.cytoscape.org/apps/cluego21。
  5. 为提高本工作流程生成数据集的可信度，可对感兴趣的猎物蛋白作为诱饵开展反向免疫共沉淀-质谱（reciprocal IP-MS）或免疫共沉淀-印迹（IP-western）实验。

结果

在免疫共沉淀-质谱（IP-MS）实验中，所鉴定出的蛋白质质量大部分来源于非特异性结合蛋白。因此，IP-MS实验的关键挑战之一在于区分高置信度相互作用蛋白与非特异性结合蛋白。为展示评估数据质量所使用的关键参数，本研究利用仅含磁珠的对照组，对5 mg HeLa细胞核提取物进行了三份重复的免疫共沉淀实验。确保IP-MS实验可靠性的首个内部检验标准是：诱饵蛋白是否在对照组基础上，以其变化倍数（fold-change）和SAINT概率均被鉴定为富集程度最高的蛋白之一。在本例中，诱饵蛋白DYRK1A在对照组之上的富集蛋白中排名前三图 2A,B). 在一项利用四种独立抗体对DYRK1A进行的核相互作用组研究中，采用FC-A阈值 >3.00 和 SAINT 概率截断值 >0.7 提供了一个严格的阈值，用于鉴定新发现的和先前已验证的相互作用蛋白22在应用于本实验时，高置信度互作蛋白与 >95%的共纯化蛋白被鉴定为非特异性图2A,B). 同时应用倍数变化富集阈值和概率阈值，可通过要求蛋白质鉴定结果在生物学重复样本中 consistently 高度富集，从而提高筛选的严格性。

除了统计学评分外，CRAPome 分析流程还将先前报道的相互作用映射到诱饵-猎物数据上23尽管这种映射对于区分高置信度和低置信度相互作用具有参考价值，但先前报道的相互作用在FC-A和SAINT概率评分中可能得分较低，这可能表明特定诱饵蛋白的许多已知相互作用仅存在于特定的细胞类型、生物学环境或细胞器中。以DYRK1A数据集为例，iREF互作蛋白的FC-A值低至0.45，表明相对于对照组的富集程度极低（图2C). 为避免假阳性结果的膨胀，统计学阈值的设定应优先考虑严格性，而非减少假阴性。需要注意的是，这些相互作用的检测与蛋白质丰度无关。图 2C). 在HeLa细胞中，每种iREF相互作用的计算绝对拷贝数与通过IP-MS检测到的相互作用伙伴的检测水平无相关性24.

Cytoscape 是一种用于可视化多层相互作用数据的有效工具19在本实验所述的DYRK1A免疫沉淀实验中，联合使用FC-A > 3.0 和 SAINT > 0.9 将高置信度互作蛋白的列表缩减至六种蛋白（图2D). 然而，当应用 FC-A 截断值时 > 在分离的3.0中，向网络中额外添加了八种蛋白质。这些新增的蛋白质互作分子与网络中已有的互作分子具有较高的连接性，提示它们可能参与相似的复合物或发挥类似的功能作用。为此，来自STRING-DB的蛋白质-蛋白质相互作用证据以蓝色虚线形式整合入该网络中20尽管这种单诱饵、三重复实验仅提供了DYRK1A完整相互作用网络的有限样本，但通过使用额外的诱饵、增加重复次数以及整合大型公共数据集，可进一步扩展高置信度相互作用网络。因此，统计学阈值将针对每个独立实验而有所不同，需进行充分评估。

核提取物实验流程示意图；免疫沉淀、质谱分析、数据分析、蛋白质研究。
图1：亚细胞免疫沉淀-质谱（IP-MS）的代表性蛋白质组学工作流程。细胞在4 L圆底烧瓶或15 cm组织培养皿中培养，并同时收获用于亚细胞分级分离。细胞被分离为胞质组分、核组分和核沉淀物，使用一种或多种识别相同目标蛋白的抗体，从1−10 mg核裂解物中进行免疫沉淀。在单次进样质谱分析之前，进行滤膜辅助样品制备（FASP）和离线样品纯化。后续的计算分析流程用于将原始数据处理为可解释的相互作用数据。请点击此处查看该图的放大版本。

使用DYRK1A进行蛋白质相互作用分析；蛋白质数据的图表、散点图和网络图。
图2：单诱饵单抗体IP-MS实验的代表性数据。（A）使用针对激酶DYRK1A的单一抗体进行优化实验（n = 3）后，通过CRAPome分析流程获得的FC-A和SAINT概率输出结果。以仅珠子对照组作为比较。红色实线表示设定的阈值：FC-A > 3.00 且 SAINT > 0.7。（B）MaxQuant输出的蛋白质丰度估计值（iBAQ）与DYRK1A免疫沉淀组相对于对照组的蛋白质丰度log2比值的关系图，颜色根据对无标记强度进行经验贝叶斯分析所得的校正p值范围标注。（C）在iRef数据库中列为相互作用蛋白的蛋白质的FC-A值与其估计拷贝数的关系23,24。（D）DYRK1A相互作用蛋白的Cytoscape网络可视化图。蓝色节点：FC-A > 3.00 且 SAINT > 0.7；橙色节点：FC-A > 3.00；黑色边线：在IP-MS实验中鉴定出的相互作用蛋白；蓝色虚线边：猎物蛋白之间的SAINT相互作用（置信度 > 0.150）。请点击此处查看此图的放大版本。

蛋白酶抑制剂（PI）混合物
试剂终浓度
Sodium Metabisulfite1 mM
Benzamidine1 mM
Dithiothreitol (DTT)1 mM
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)0.25 mM
磷酸酶抑制剂（PhI）混合物
试剂终浓度
Microcystin LR1 µM
Sodium Orthovanadate0.1 mM
Sodium fluoride5 mM
亚细胞分级缓冲液：
缓冲液 A pH 7.9
试剂终浓度
HEPES10 mM
MgCl21.5 mM
KCl10 mM
缓冲液 B pH 7.9
试剂终浓度
HEPES20 mM
MgCl21.5 mM
NaCl420 mM
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)0.4 mM
Glycerol25% (v/v)
缓冲液 C pH 7.9
试剂终浓度
HEPES20 mM
MgCl22 mM
KCl100 mM
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)0.4 mM
Glycerol20% (v/v)
免疫沉淀缓冲液：
IP 缓冲液 1
试剂终浓度
HEPES20 mM
KCl150 mM
EDTA0.1 mM
NP-400.1% (v/v)
Glycerol10% (v/v)
IP 缓冲液 2
试剂终浓度
HEPES20 mM
KCl500 mM
EDTA0.1 mM
NP-400.1% (v/v)
Glycerol10% (v/v)
SDS 烷基化缓冲液 pH 8.5
试剂终浓度
SDS4% (v/v)
Chloroacetamide40 mM
TCEP10 mM
Tris100 mM
UA pH 8.5
试剂终浓度
Urea8 M
Tris0.1 M
* 使用 HPLC 级 H2O

表1：缓冲液组成

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讨论

本文所述的蛋白质组学工作流程为鉴定目标蛋白的高置信度相互作用蛋白提供了一种有效方法。该方法通过亚细胞组分分离降低样品复杂性，并通过稳健的样品制备、离线样品纯化以及对液相色谱-质谱（LC-MS）系统的严格质量控制，重点提高相互作用伙伴的鉴定能力。文中描述的下游数据分析方法可对与诱饵蛋白共纯化的蛋白质进行简便的统计学评估。然而，由于存在大量实验变量（如实验规模、细胞系、抗体选择），每个实验在数据可视化和富集分析方面都需要采用不同的阈值和考量因素。

在进行免疫共沉淀-质谱（IP-MS）实验时，首要的设计考虑是选择用于共纯化目标蛋白及其相互作用伙伴的抗体。尽管在过去几十年中，可用于人类蛋白质组研究的商业化抗体已大幅增加，但仍有许多蛋白缺乏可用的试剂。此外，某些虽已通过如Western blot检测等应用验证的抗体，可能无法在免疫共沉淀实验中有效且特异性地富集目标蛋白。在开展大规模相互作用蛋白质组学实验之前，建议先从一个90%汇合度的10 cm培养皿（或等量细胞）中进行一次免疫共沉淀，并通过Western blot检测目标蛋白的存在。如果存在多个可用于免疫共沉淀的抗体，建议选择识别蛋白不同区域表位的多个抗体。抗体与诱饵蛋白的结合可能会遮蔽其与潜在相互作用伙伴结合所必需的界面；因此，选择针对诱饵蛋白不同表位的抗体，有助于提高基于质谱实验所鉴定出的相互作用图谱的覆盖范围。

第二个主要考虑因素在于选择适当的对照，以区分高置信度相互作用与低置信度或非特异性相互作用，后者可能在与诱饵蛋白共纯化时被错误识别。对于免疫共沉淀-质谱（IP-MS）实验而言，最严格的对照是从该诱饵蛋白的CRISPR敲除（KO）细胞系中进行免疫沉淀。此类对照能够识别并过滤掉那些直接与抗体结合而非与诱饵蛋白结合的非特异性蛋白。当无法为每个诱饵蛋白构建CRISPR敲除细胞系时，可使用与诱饵抗体同种型匹配的IgG-磁珠对照。在使用包含多种物种来源抗体的实验中，仅使用磁珠对照可能是合适的，但这会增加将假阳性结果误判为高置信度互作蛋白的可能性。

在免疫共沉淀-质谱（IP-MS）实验中，细胞系的选择取决于多个关键因素。蛋白质的表达水平和亚细胞定位在很大程度上依赖于细胞类型。尽管大多数基因在常用细胞系中的RNA表达水平已有估算数据，但蛋白质表达水平与RNA表达水平的相关性较差，必须通过实验手段加以确定25。应避免使用诱饵蛋白拷贝数极低的细胞系，以防止因可能需要大幅扩大细胞培养规模而带来的困难。然而需要注意的是，样品制备方法可针对极低丰度蛋白的检测进行优化。滤膜辅助样品制备（FASP）方法虽然稳健，但可能导致样品中超过50%的肽段损失。单管固相增强样品制备（SP3）是一种高效的质谱分析样品制备方法，可最大限度减少样品损失26。SP3方法所实现的更高回收率，在本实验流程中可作为检测限附近蛋白质定量的一种有效替代方案。

该蛋白质组学工作流程已应用于多种核内诱饵蛋白，包括激酶、E3泛素连接酶以及多亚基复合物中的支架蛋白成员。在抗体试剂经过适当验证的前提下，成功实施此工作流程将能够检测到目标蛋白的高置信度核内蛋白质相互作用伙伴。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得了唐氏综合征琳达·克里尼克研究所向 W.M.O. 提供的大挑战基金以及 DARPA 合作协议 13-34-RTA-FP-007 的资助。我们感谢 Jesse Kurland 和 Kira Cozzolino 在阅读和评阅手稿方面所做的贡献。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.25% 胰蛋白酶，0.1% EDTAThermo Fisher Scientific25200056
1.5 ml 低吸附微量离心管Fisher Scientific02-681-320
4-20% Mini PROTEAN TGX 预制蛋白凝胶Bio-Rad4561096
丙酮（HPLC级）Thermo Fisher ScientificA949SK-4
Amicon Ultra 0.5 ml 30k 滤膜柱Millipore SigmaUFC503096
苯甲脒Sigma-Aldrich12072
苯并核酸酶Sigma-AldrichE1014
氯乙酰胺Sigma-AldrichC0267
透析袋封口夹Caroline Biological Supply Company684239
DTTSigma-Aldrich10197777001
EDTASigma-AldrichEDS
GAPDH 抗体Santa Cruz BiotechnologySc-47724
甘油Fisher Scientific887845
甘氨酸Sigma-AldrichG8898
HeLa QC 胰蛋白酶消化液Pierce88329
HEPESFisher ScientificAAJ1692630
胰岛素Thermo Fisher Scientific12585014
碘乙酰胺Sigma-AldrichI1149
KONTES Dounce 匀浆器 7 mlVWRKT885300-0007
7 ml 大间隙研杵VWRKT885301-0007
赖氨酰内肽酶 CVWR125-05061
氯化镁Sigma-Aldrich208337
微囊藻毒素enzo life sciencesALX-350-012-C100
Nonidet P-40 替代溶液Sigma-Aldrich98379
p84 抗体GeneTexGTX70220
磷酸盐缓冲液
Pierce BCA 蛋白定量试剂盒Thermo Fisher Scientific23227
Pierce BSA 蛋白消化液，质谱级Thermo Fisher Scientific88341LCMS 质控
Pierce C18 离心柱Thermo Fisher ScientificPI-89873
Pierce 胰蛋白酶，质谱级Thermo Fisher Scientific90057用于质谱样品制备
PMSFSigma-AldrichP7626
氯化钾Sigma-AldrichP9541
Protein A Sepharose CL-4BGE Healthcare Bio-Sciences17-0780-01
Protein G Sepharose 4 Fast FlowGE Healthcare Bio-Sciences17-0618-01
SDSSigma-AldrichL3771
石英毛细管喷针头Pico TIPFS360-20-10
7 ml 小间隙研杵VWRKT885302-0007
氯化钠Sigma-AldrichS3014
氟化钠Sigma-Aldrich201154
亚硫酸氢钠Sigma-Aldrich31448
正钒酸钠Sigma-AldrichS6508
Spectra/Por 8 kDa 24 mm 透析袋Thomas Scientific3787K17
TC 培养皿 150，标准型Sarstedt83.3903贴壁细胞用组织培养皿
TCASigma-AldrichT9159
TCEPThermo ScientificPG82080
TFAThermo Fisher Scientific28904
Thermo Scientific Orbitrap Fusion 质谱仪Thermo Fisher Scientific
Trizma BaseSigma-AldrichT6066
尿素Thermo Fisher Scientific29700
Waters ACQUITY M-Class UPLCWaters
Waters ACQUITY UPLC M-Class 反相色谱柱 1.7µm 球形杂化颗粒（1.7 µm，75 µm x 250 mm）Waters186007484纳流 C18 色谱柱

参考文献

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HeLa DYRK1A
无需标记的免疫沉淀质谱工作流程用于大规模核相互作用组分析
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