通过流式细胞术测定造血干细胞和T细胞中的线粒体质量与膜电位

摘要

本文介绍了一种在体外培养的造血干细胞和T细胞中可靠测定线粒体质量与膜电位的方法。

摘要

静息、自我更新与分化之间的精细平衡对于维持造血干细胞（HSC）库以及终生生成所有成熟血细胞至关重要。近年来，细胞代谢被发现是调控HSC功能与命运的关键因素。我们先前已证明，线粒体代谢的调节可影响HSC的命运。具体而言，通过化学解偶联电子传递链，我们能够在通常会迅速诱导分化的培养条件下维持HSC的功能。然而，HSC数量有限，常常限制了标准检测方法在测量HSC代谢以预测其功能方面的应用。本文中，我们报道了一种简单的流式细胞术检测方法，可在HSC等稀有细胞中可靠地测量线粒体膜电位和线粒体质量。我们讨论了从小鼠骨髓中分离HSC，以及在体外培养后对线粒体质量与膜电位的测定。作为示例，我们展示了通过代谢调节剂处理对HSC中这些参数的调控。此外，我们将该方法拓展应用于人外周血来源的T细胞及人肿瘤浸润淋巴细胞（TILs），发现其线粒体特征存在显著差异，可能反映了不同T细胞的功能状态。我们认为，该检测方法可用于在不同背景下筛选多种细胞类型中线粒体代谢的调节因子。

引言

造血干细胞（HSCs）是一类存在于骨髓中的稀有细胞群体，负责在整个生物体生命周期中维持血液的生成与稳态。HSCs 通过产生祖细胞来介导这一过程，祖细胞再经过多轮细胞分裂和精确调控的分化步骤，最终生成终末分化的成熟血细胞谱系¹。重要的是，HSCs 主要通过无氧糖酵解产生能量；相比之下，分化方向更明确且活跃的造血祖细胞则将其代谢方式转向线粒体代谢^2,3,4。这种独特的代谢状态被认为可保护 HSCs 免受活性线粒体产生的活性氧（ROS）所造成的细胞损伤，从而维持其长期的体内功能^5,6,7,8。由于 HSCs 数量有限，直接检测其代谢状态具有挑战性，且通量通常较低。本文中，我们描述了一种基于流式细胞术的检测方法，利用四甲基罗丹明甲酯（TMRM）荧光检测 HSCs 的线粒体膜电位（ΔΨm），并利用绿色荧光线粒体染料（Mitotracker Green）检测线粒体质量。我们先前已证实，低 ΔΨm 是高度纯化的 HSCs 的可靠功能标志物

方案

本文所述所有实验均遵循本机构的指导原则，并依照瑞士动物实验法规（许可编号：VD3194）以及涉及人类样本研究的法规（方案编号：235/14；CER-VD 2017-00490）进行。

1. 造血干细胞提取

1. 购买野生型 C57BL6/J 小鼠，并将其在动物房中饲养至少一周，以减少运输带来的应激反应。
2. 实验当天，使用 CO₂ 窒息法处死小鼠。
3. 用 70% 乙醇喷洒小鼠体表以消毒毛发，使用标准手术器械（如解剖剪和镊子）从腹部切开，分离后肢的股骨和胫骨。
4. 用软纸巾去除附着在股骨、胫骨和骨盆上的肌肉组织，将清理干净的骨骼放入含有 PBS 加 1 mM EDTA（缓冲液）的 50 mL 离心管中，并置于冰上。
5. 用 70% 乙醇喷洒研钵和研杵，将其放入细胞培养超净台中，用紫外灯灭菌 30 分钟。灭菌后，用缓冲液冲洗研钵和研杵，以去除残留的乙醇。
6. 将清洁的骨骼连同部分缓冲液（约 10 mL）放入研钵中，轻轻研磨以释放骨髓细胞至悬浮液中。随后收集细胞悬液，通过 70 µm 细胞滤网过滤至 50 mL 离心管中，获得单细胞悬液。
7. 重复步骤 1.6，直至所有骨髓被完全提取，且骨碎片变为白色。
8. 将含有骨髓单细胞悬液的 50 mL 离心管置于离心机中，在 4 °C 条件下以 300 xg 离心 10 ....

结果

在 图1 我们展示了从小鼠骨髓中分离造血干细胞的设门策略及其体外培养的孔板布局。 图1A 在SSC-A/FSC-A图中显示了淋巴细胞组分的鉴定。通过单细胞门控去除双联体后，根据无DAPI信号鉴定活细胞。LKS群体由lineage- Sca1定义⁺cKit⁺，被鉴定出来。该细胞群体已知含有干细胞和祖细胞。HSC约占LKS细胞群体的5–10%，通过CD150分选而鉴定⁺CD48^- 群体 图1B 代表96孔板用于体外培养的布局。分选后的HSC被接种于不同的培养条件下：本例中为对照组和NR补充培养组。根据方案所述，全骨髓细胞也被接种作为单色对照。为防止含细胞孔中培养基蒸发，所有周围孔中均需加水。此外，如前所述，由于边缘孔更易发生蒸发，因此避免用于细胞培养。

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讨论

对造血干细胞（HSC）功能的严格调控对于维持机体一生中稳定的造血功能至关重要。与体内多种其他细胞类型类似，细胞代谢是调控HSC功能的关键因素之一。我们实验室此前的研究⁹以及其他研究团队的工作^2,3均表明，线粒体在维持HSC特有代谢状态中具有重要作用。由于从小鼠骨髓中分离得到的HSC数量极低，难以通过常规代谢检测方法（例如SeaHorse氧耗检测）对其进行分析。基于我们先前的研究，我们建立了一种简便的流式细胞术检测方法，可在少量细胞（即HSC）中可靠地测定线粒体质量及膜电位（作为线粒体活性的间接读数）。该检测可在活细胞上进行，且不损害细胞活力⁹，从而确保细胞可用于后续任何功能实验（如集落形成单位实验或骨髓移植实验），供使用者进一步分析。我们预计该检测方法可用于筛选实验，快速评估来自不同遗传背景或基因敲除模型的HSC的线粒体特征。重要的是，本检测方法可与CFSE染色联合使用，同时读取HSC增殖情况及其线粒体特征

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5 mL FACS 管	Falcon	352235	样品制备
96 孔 U 型底板	Corning	3799	细胞培养
AutoMACS pro 分离仪	Miltenyi Biotec		自动细胞分离
BD FACS AriaIII	Becton and Dickinson		细胞分选
BD IMag 小鼠造血祖细胞富集试剂盒	BD	558451	谱系耗竭
BD LSRII	Becton and Dickinson		FACS 数据采集仪器
BD-DIVA	Becton and Dickinson		数据采集软件
CD150 PE	Biolegend	115904	抗体染色混合液
CD150 PE-Cy5	Biolegend	115912	抗体染色混合液
CD48 PB	Biolegend	103418	抗体染色混合液
离心机-5810R	Eppendorf		离心
Ckit PeCy7	Biolegend	105814	抗体染色混合液
FlowJo	FlowJo LLC		FACS 分析软件
GraphPad-Prism	GraphPad		数据绘图
MitoTracker Green	Invitrogen	M7514	绿色荧光线粒体染料，用于检测线粒体质量；工作浓度 = 100 nM；储存浓度 = 1 mM
烟酰胺核糖（NR）	实验室自行定制合成		代谢调节剂；工作浓度 = 500 µM；储存浓度 = 50 mM
PBS	CHUV	1000324	缓冲液配制；工作浓度 = 1x；储存浓度 = 1x
青霉素-链霉素（P/S）	Life technologies	15140122	体外培养；工作浓度 = 1x；储存浓度 = 1x
红细胞裂解缓冲液	Biolegend	420301	裂解红细胞；工作浓度 = 1x；储存浓度 = 10x
重组小鼠 Flt-3 配体（FLT3）	RnD	427-FL-005/CF	体外培养；工作浓度 = 2 ng/mL；储存浓度 = 10 µg/mL
重组小鼠干细胞因子（SCF）	RnD	455-MC-010/CF	体外培养；工作浓度 = 100 ng/mL；储存浓度 = 50 µg/mL
Sca1 APC	Thermo Fisher Scientific	17-5981-82	抗体染色混合液
StemlineII 造血干细胞扩增培养基	SIGMA	S0192	体外培养
链霉亲和素 Pac orange	Life Technologies	S32365	抗体染色混合液
链霉亲和素 Tx red	Life Technologies	S872	抗体染色混合液
TMRM	Invitrogen	T668	线粒体膜电位染色；工作浓度 = 200 nM；储存浓度 = 10 mM
超纯 EDTA	Invitrogen	15575-038	缓冲液配制；工作浓度 = 0.5 M；储存浓度 = 1 mM