微血管内全场流动的时空分析

摘要

为了从高速毛细血管血流图像序列中量化微血管血流，我们开发了STAFF（全场时空血流分析）软件。该软件可对整个图像视野内随时间变化的血流速度进行评估，并生成一系列彩色编码的空间图谱用于可视化，同时提供表格化输出以进行定量分析。

摘要

血流速度和分布的变化对于维持组织和器官的灌注以应对细胞需求的变化至关重要。此外，微循环中出现的异常往往是多种病理状态发展的首要指标。光学成像技术的进步使得活体显微成像（intravital microscopy, IVM）成为一种实用方法，能够在活体动物中以高速、长时间地实现细胞和亚细胞水平的成像。然而，尽管维持充分的组织灌注极为重要，毛细血管血流在空间和时间上的变异性却很少被系统记录。在传统方法中，通常仅选择少量毛细血管段在有限的时间内进行成像。为了以无偏倚的方式全面量化毛细血管血流，我们开发了全场血流时空分析法（Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow, STAFF），这是一种用于FIJI开源图像处理平台的宏程序 图像分析软件。利用毛细血管内血流全场的高速图像序列，STAFF 可生成 代表每个时间间隔内每条血管段随时间变化的运动图像，称为线状图（kymographs）。通过线状图，STAFF 根据红细胞在单位时间内移动的距离计算流速，并将速度数据输出为一系列彩色编码的空间图以供可视化，同时提供表格形式的定量分析数据。在正常小鼠肝脏中，STAFF 分析量化了肝小叶内中央周围区与门管周围区之间血流速度的显著差异。更为意外的是，不同肝窦状隙之间的血流速度也存在明显差异。 并排存在且在数秒内单个血管节段内可见的波动。STAFF 是一种强大的新工具，能够通过测量毛细血管血流复杂的时空动态，提供全新的研究见解。

引言

微血管系统在生理学中起着关键作用，能够在不断变化的条件下确保组织的有效灌注。微血管功能障碍与多种疾病相关，包括长期的心血管发病率和死亡率、痴呆的发生，以及肝肾疾病，因此成为广泛生物医学研究中的一个重要关注因素^1,2,3,4,5。尽管已有多种技术用于评估组织灌注，但只有活体显微镜技术能够以足够的时间和空间分辨率进行数据采集，从而在单个毛细血管水平上表征血流情况。

微血管血流可通过荧光显微镜观察，其方法包括观察荧光微球的运动，或观察在细胞膜不通透性荧光标记物（如荧光标记的葡聚糖或白蛋白）背景下的红细胞运动^6，7。微血管血流可在浅层细胞层中通过宽场显微镜成像，也可通过共聚焦或多光子显微镜在深层组织中实现成像。然而，毛细血管的血流速度较快，通常需要高于每秒60帧的速度才能捕捉到红细胞的通过过程。由于大多数激光扫描共聚焦和多光子显微镜需要1–5秒才能完成一幅完整图像的扫描，因此通常只能通过限制视场范围来实现足够高的成像速度，有时甚至需缩小至单条扫描....

方案

所有动物实验均经印第安纳大学机构动物护理和使用委员会批准，并按照其指南进行，同时遵循美国国家研究委员会（NRC）关于动物护理和使用的指南。

1. 活体显微镜检查的手术准备

注意：本操作不属于存活手术。一旦开始第1节"活体显微成像的手术准备”，则必须持续进行，直至完成第2节"活体显微成像”为止，期间不得中断。

1. 将9至10周龄的雄性C57BL/6小鼠适应环境至少4天，并在实验前禁食16小时。
2. 称量动物体重，使用5%异氟烷进行镇静，并将其置于加热垫上以维持体温。氧气流速保持在1–2 L/min，维持麻醉时使用1–2%异氟烷。通过夹趾法检查反射反应。使用直肠温度计监测体温，并通过视觉观察监测心率和呼吸频率。
3. 当麻醉状态稳定后，剃除颈静脉插管部位的毛发，同时剃除肋缘下方区域以暴露肝脏。
4. 进行颈静脉插管时，在小鼠下颌下方1–2 cm处做一长约1 cm的左侧腹侧切口。清除颈静脉周围的所有脂肪和筋膜组织。使用06号缝合线结扎颈静脉前端，以防出血。
   1. 在颈静脉上做一个微小切口，将导管（30 G × ½ 英寸针头）、针持器和聚乙烯管（0.011 × 0.024 英寸² ，连接至鲁尔短接头并充满0.9%生理盐水）插入约1 cm，然后....

结果

STAFF 分析可在数秒至数分钟的时间范围内，对整个显微镜视野内的微血管流速进行全面统计。代表性结果如图1、图2、图3和图4所示。图1展示了一个小鼠肝脏微血管网络的时间序列示例、用于定义微血管流动轴线的骨架化图像的生成过程，以及由 STAFF 生成的用于定量分析的各个血管段分布图。STAFF 随后利用骨架化图像将微血管网络分解为独立的血管段，并为每一段生成相应的时空图（kymograph）图像。这些图像连同用于确定时空图分析时间区间的工具一并提供给用户（图2）。接着，STAFF 利用骨架结构和用户提供的时间区间，将每一段的时空图进一步划分为独立的血管段-时间区间。随后，STAFF 识别出每个血管段-时间区间时空图中的主要角度，并以 .csv 数据文件的形式提供流速测量结果（

讨论

本方案中有多个关键步骤。首先，在进行肝脏活体成像时，尽量减少运动对于生成可用于STAFF分析毛细血管血流的视频至关重要。由于靠近膈肌，呼吸会引起短暂的运动，但固定后的肝脏会在每次呼吸后回到初始位置。通过纱布将手术暴露的肝脏固定在盖玻片底部的培养皿上，并使用倒置显微镜从下方进行成像，可在呼吸间期实现器官的稳定^16,17,18,19。其次，强烈建议图像采集速度达到100 fps，因为可测量的血流速度取决于图像采集速度以及血流测量段的最小长度¹¹。第三，生成高质量的骨架图——即血管网络的线条化表示——是利用STAFF获取毛细血管血流速度的下一个关键步骤。骨架线段应位于分析时间段内呼吸间期血管结构的中点附近，并需识别出偏离成像平面的血管分支。这些隐藏分支在血管段上的位置可通过观看视频、检查时空图（kymograph）或观察该血管段随时间变化的流.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
#5 镊子	Fine Science Tools	11251-20	Dumont #5 Inox 镊子
C57BL/6 小鼠	Jackson Labs		雄性，9–12 周龄
套管	Instech	BTPE-10	聚乙烯导管 0.011 × 0.024 英寸
CMOS 相机	Hamamatsu	C11440-42U30	4.0LT 科学级 CMOS 相机
盖玻片底培养皿	Electron Microscopy Sciences		WillCo Dish 玻璃底 GWST5040
解剖剪刀	Fine Science Tools
Fiji ImageJ 图像分析软件			https://fiji.sc/ ; https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip
荧光素葡聚糖	Thermo Fisher, Invitrogen	D1822	葡聚糖，荧光素标记，分子量 70,000，阴离子型，赖氨酸可固定
纱布海绵	Fisher	22-415-504	2×2 英寸 Dukal 无菌纱布海绵
加热垫	Reptitherm	RH-4	置于小鼠与载物台之间
加热垫	Sunbeam	000732-500-000U	覆盖于小鼠上方
倒置落射荧光显微镜	Nikon		Nikon TiE 倒置显微镜
Isis 啮齿类电动剃毛器	Braun Aesculap	GT420
异氟烷	Abbott GmbH	PZN4831850
鲁尔接头适配器	Fisher	14-826-19E	导管适配器
显微剪刀	Castro Viejo
显微镜物镜	Nikon		Plan Fluor 20×，数值孔径 0.75，水浸物镜
针头	Fisher		30 G × 1/2"
持针器	Olsen-Hegar
物镜加热器	BioScience Tools	MTC-HLS-025	带物镜加热器的温度控制器
直肠温度计	Braintree Scientific, INC	TH-5A	小鼠体温监测
STAFF 宏程序			https://github.com/icbm-iupui/STAFF
缝合线	Harvard Bioscience	723288	黑色丝线缝合线，6-0 规格，线轴装