方法文章

使用液相色谱串联质谱法对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）细胞脂质组进行定量分析

DOI：

10.3791/60616

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2020年3月8日

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1Department of Biology, Concordia University, 2Department of Chemistry and Biochemistry, Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry, Concordia University

本文内容

摘要

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我们介绍一种采用液相色谱串联质谱法鉴定和定量酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中主要细胞脂质的实验方案。该方法可对酵母细胞内主要脂质类别进行定量分析，具有通用性强、稳健性和高灵敏度的特点。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

脂质是一类结构多样且具有两亲性的分子，不溶于水。脂质在生物膜的组织与功能、能量储存与产生、细胞信号传导、蛋白质的囊泡运输、细胞器发生以及程序性细胞死亡等过程中发挥着重要作用。由于出芽酵母Saccharomyces cerevisiae是一种易于进行深入分子分析的单细胞真核生物，作为模式生物被广泛使用，有助于揭示脂质代谢和细胞内运输与真核细胞中复杂生物学过程之间的关联机制。要深入理解这些机制，关键在于具备一种多功能、稳定、灵敏且准确的分析方法，用于定量检测酵母细胞中主要脂质类别。本文介绍了一种利用液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）对S. cerevisiae主要细胞脂质进行定量分析的实验方案。所述LC-MS/MS方法具有良好的通用性和稳健性，能够对10类脂质中的多种分子种类（包括不同的同量异位或同分异构形式）进行鉴定和定量。该方法灵敏度高，可检测低至0.2 pmol/µL浓度的某些脂质分子。该方法已成功应用于完整酵母细胞及其纯化细胞器的脂质组分析。在本方法中使用不同的电喷雾电离质谱流动相添加剂，可提高某些脂质分子的电离效率，从而改善其鉴定与定量效果。

引言

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大量证据表明，脂质作为生物大分子的主要类别之一，在真核细胞内的多种重要生命过程中发挥着关键作用。这些过程包括构成质膜及细胞器膜的脂双层的组装、小分子跨细胞膜的运输、对细胞外环境变化的响应及细胞内信号转导、能量的生成与储存、定位于不同细胞器的蛋白质的输入与输出、内膜系统中蛋白质的囊泡运输及蛋白质分泌，以及多种形式的程序性细胞死亡1,2,3,4,5,6,7,8,9,10。

芽殖酵母S. cerevisiae是一种单细胞真核生物，已被成功用于揭示脂质在这些重要细胞过程中所起关键作用的部分机制4,....

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方案

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1. 酵母培养用无菌培养基的制备

  1. 配制90 mL完全YP培养基，其中含有1% (w/v) 酵母提取物和2% (w/v) 胰蛋白胨。
  2. 配制90 mL合成基本YNB培养基，其中含有0.67% (w/v) 无氨基酸酵母氮源基础培养基、20 mg/L L-组氨酸、30 mg/L L-亮氨酸、30 mg/L L-赖氨酸和20 mg/L尿嘧啶。
  3. 将90 mL完全YP培养基等量分装至两个250 mL锥形瓶中（即每瓶45 mL）。
  4. 将90 mL合成基本YNB培养基等量分装至两个250 mL锥形瓶中（即每瓶45 mL）。
  5. 使用前，在15 psi/121 °C条件下对含YP和YNB培养基的锥形瓶进行高压灭菌45分钟。

2. 酵母菌株

  1. 使用野生型菌株 BY4742（MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0）。

3. 在含葡萄糖的完全 YP 培养基中培养酵母

  1. 使用高压灭菌器在 15 psi/121 °C 条件下对 20% (w/v) 葡萄糖储备液灭菌 45 分钟，灭菌后备用。
  2. 向两个含有无菌 YP 培养基的锥形瓶中，各加入 5 mL 无菌的 20% (w....

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结果

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我们利用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）对酵母细胞内主要细胞脂质进行定量评估的方法具有良好的通用性和稳健性。该方法使我们能够鉴定并定量在含有2%葡萄糖的合成基本YNB培养基中培养的S. cerevisiae细胞中的10种不同脂质类别。这些脂质类别包括游离（非酯化）脂肪酸（FFA）、心磷脂（CL）、植烷酰神经酰胺（PHC）、植烷鞘氨醇（PHS）、磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰甘油（PG）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰丝氨酸（PS）和三酰甘油（TAG）（补充表1）。通过该LC-MS/MS方法，我们鉴定并定量了每一类脂质中的多种分子种类（补充表1）。

我们的LC-MS/MS方法也具有很高的灵敏度。事实上，该方法能够对浓度低至0.165 pmol/µL的脂质分子种类进行鉴定和定量（见表5中植物鞘氨醇酰胺的数据）。该定量.......

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讨论

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以下预防措施对于成功实施本文所述方案至关重要：

1. 氯仿和甲醇具有毒性。它们能有效从各种表面提取物质，包括实验室塑料器皿和皮肤。因此，在操作中应谨慎处理这些有机溶剂：避免在接触氯仿和/或甲醇的步骤中使用塑料制品，使用硼硅酸盐玻璃移液管进行这些操作，并在使用前用氯仿和甲醇冲洗这些移液管。

2. 使用甲醇/氯仿（17:1）混合液进行脂质提取时，用硼硅酸盐玻璃移液管将下层有机相（约400 µL）转移至带有聚四氟乙烯衬垫盖的15 mL高强度玻璃螺口离心管中。转移过程中不得扰动玻璃珠或上层水相。保持下层有机相处于氮气气流中。

3. 在进行 LC-MS/MS 样品制备时，将玻璃小瓶插入孔板之前，必须去除所有气泡。

4. 为在液相色谱分离脂质前实现甲酸铵和乙酸铵在流动相A和流动相B中的完全溶解，需先将每种盐分别溶于500 µL的纳米纯水中，再将溶液与流动相混合，并超声处理20分钟。

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披露

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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

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我们感谢Titorenko实验室现任和前任成员的讨论与交流。感谢康考迪亚大学的生物质谱应用中心和结构与功能基因组学中心提供的卓越服务。本研究得到了加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）（项目编号：RGPIN 2014-04482）和康考迪亚大学主席基金（CC0113）的资助。K.M. 获得了康考迪亚大学优秀奖的支持。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
15 mL 高速玻璃离心管，带聚四氟乙烯（Teflon）衬里瓶盖PYREX05-550
2 mL 玻璃样品瓶，带聚四氟乙烯（Teflon）衬里瓶盖Fisher Scientific60180A-SV9-1P
2-丙醇Fisher ScientificA461-500
乙腈Fisher ScientificA9554
Agilent 1100 系列液相色谱系统Agilent TechnologiesG1312A
Agilent 1100 微孔板Agilent TechnologiesG1367A
乙酸铵Fisher ScientificA11450
碳酸氢铵Sigma9830
甲酸铵Fisher ScientificA11550
氢氧化铵Fisher ScientificA470-250
蛋白胨Fisher ScientificBP1420-2
心磷脂Avanti Polar Lipids750332
Centra CL2 临床离心机Thermo Scientific004260F
神经酰胺Avanti Polar Lipids860517
氯仿Fisher ScientificC297-4
CSH C18 VanGuardWaters186006944预柱系统
游离脂肪酸（19:0）Matreya1028
玻璃珠（酸洗，425–600 μM）Sigma-AldrichG8772
葡萄糖Fisher ScientificD16-10
血细胞计数板Fisher Scientific267110
L-组氨酸SigmaH8125
Lipid Search 软件（V4.1）Fisher ScientificV4.1LC-MS/MS 分析软件
L-亮氨酸SigmaL8912
L-赖氨酸SigmaL5501
甲醇Fisher ScientificA4564
磷脂酰胆碱Avanti Polar Lipids850340
磷脂酰乙醇胺Avanti Polar Lipids850704
磷脂酰甘油Avanti Polar Lipids840446
磷脂酰肌醇Avanti Polar LipidsLM1502
磷脂酰丝氨酸Avanti Polar Lipids840028
反相色谱柱 CSH C18Waters186006102
鞘氨醇Avanti Polar Lipids860669
Thermo Orbitrap Velos 质谱仪Fisher ScientificETD-10600
甘油三酯Larodan, MalmoTAG Mixed FA
超声波破碎仪Fisher Scientific15337416
尿嘧啶SigmaU0750
涡旋振荡器Fisher Scientific2215365
酵母提取物Fisher ScientificBP1422-2
不含氨基酸的酵母氮源基础培养基Fisher ScientificDF0919-15-3
酵母菌株 BY4742DharmaconYSC1049

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bou Khalil, M., et al. Lipidomics era: accomplishments and challenges. Mass Spectrometry Review. 29 (6), 877-929 (2010).
  2. Shevchenko, A., Simons, K. Lipidomics: coming to grips with lipid diversity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8)....

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重印与许可

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