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方法文章

使用液相色谱串联质谱法对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）细胞脂质组进行定量分析

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DOI：

10.3791/60616

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2020年3月8日

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Concordia University, 2Department of Chemistry and Biochemistry, Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry, Concordia University

本文内容

摘要

我们介绍一种采用液相色谱串联质谱法鉴定和定量酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中主要细胞脂质的实验方案。该方法可对酵母细胞内主要脂质类别进行定量分析，具有通用性强、稳健性和高灵敏度的特点。

摘要

脂质是一类结构多样且具有两亲性的分子，不溶于水。脂质在生物膜的组织与功能、能量储存与产生、细胞信号传导、蛋白质的囊泡运输、细胞器发生以及程序性细胞死亡等过程中发挥着重要作用。由于出芽酵母Saccharomyces cerevisiae是一种易于进行深入分子分析的单细胞真核生物，作为模式生物被广泛使用，有助于揭示脂质代谢和细胞内运输与真核细胞中复杂生物学过程之间的关联机制。要深入理解这些机制，关键在于具备一种多功能、稳定、灵敏且准确的分析方法，用于定量检测酵母细胞中主要脂质类别。本文介绍了一种利用液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）对S. cerevisiae主要细胞脂质进行定量分析的实验方案。所述LC-MS/MS方法具有良好的通用性和稳健性，能够对10类脂质中的多种分子种类（包括不同的同量异位或同分异构形式）进行鉴定和定量。该方法灵敏度高，可检测低至0.2 pmol/µL浓度的某些脂质分子。该方法已成功应用于完整酵母细胞及其纯化细胞器的脂质组分析。在本方法中使用不同的电喷雾电离质谱流动相添加剂，可提高某些脂质分子的电离效率，从而改善其鉴定与定量效果。

引言

大量证据表明，脂质作为生物大分子的主要类别之一，在真核细胞内的多种重要生命过程中发挥着关键作用。这些过程包括构成质膜及细胞器膜的脂双层的组装、小分子跨细胞膜的运输、对细胞外环境变化的响应及细胞内信号转导、能量的生成与储存、定位于不同细胞器的蛋白质的输入与输出、内膜系统中蛋白质的囊泡运输及蛋白质分泌，以及多种形式的程序性细胞死亡1,2,3,4,5,6,7,8,9,10。

芽殖酵母S. cerevisiae是一种单细胞真核生物，已被成功用于揭示脂质在这些重要细胞过程中所起关键作用的部分机制4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20。S. cerevisiae是研究这些机制的宝贵模式生物，因其适用于全面的生物化学、遗传学、细胞生物学、化学生物学、系统生物学以及微流控分析技术21,22,23,24,25。要进一步阐明脂质代谢和细胞内运输如何参与这些重要细胞过程的机制，需要高灵敏度的质谱技术，以实现对细胞脂质组的定量表征，解析脂质组的分子复杂性，并将定量脂质组学整合到系统生物学的多学科研究平台中1,2,3,26,27,28,29,30。

目前用于酵母细胞及其他真核生物细胞的质谱辅助定量脂质组学方法在通用性、稳健性或灵敏度方面均不够理想。此外，现有方法无法区分各种同量异位或同分异构的脂质种类。本文介绍一种通用、稳健且灵敏的方法，可利用液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）对酿酒酵母（S. cerevisiae）的主要细胞脂质进行定量分析。

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方案

1. 酵母培养用无菌培养基的制备

  1. 配制90 mL完全YP培养基，其中含有1% (w/v) 酵母提取物和2% (w/v) 胰蛋白胨。
  2. 配制90 mL合成基本YNB培养基，其中含有0.67% (w/v) 无氨基酸酵母氮源基础培养基、20 mg/L L-组氨酸、30 mg/L L-亮氨酸、30 mg/L L-赖氨酸和20 mg/L尿嘧啶。
  3. 将90 mL完全YP培养基等量分装至两个250 mL锥形瓶中（即每瓶45 mL）。
  4. 将90 mL合成基本YNB培养基等量分装至两个250 mL锥形瓶中（即每瓶45 mL）。
  5. 使用前，在15 psi/121 °C条件下对含YP和YNB培养基的锥形瓶进行高压灭菌45分钟。

2. 酵母菌株

  1. 使用野生型菌株 BY4742（MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0）。

3. 在含葡萄糖的完全 YP 培养基中培养酵母

  1. 使用高压灭菌器在 15 psi/121 °C 条件下对 20% (w/v) 葡萄糖储备液灭菌 45 分钟，灭菌后备用。
  2. 向两个含有无菌 YP 培养基的锥形瓶中，各加入 5 mL 无菌的 20% (w/v) 葡萄糖储备液，使葡萄糖终浓度为 2% (w/v)。
  3. 使用微生物接种环将野生型菌株 BY4742 的细胞接种至两个含有葡萄糖 YP 培养基的锥形瓶中。
  4. 在 30 °C 条件下，以 200 rpm 振荡培养过夜。
  5. 取一份酵母培养液样品，使用血细胞计数板测定每毫升培养液中的酵母细胞总数。

4. 将酵母转移至含葡萄糖的合成最低YNB培养基中进行培养

  1. 向两个含有无菌YNB培养基的锥形瓶中各加入5 mL无菌的20% (w/v)葡萄糖储备液，使葡萄糖终浓度为2% (w/v)。
  2. 使用无菌移液管将过夜培养的酵母菌液转移至上述两个含葡萄糖YNB培养基的锥形瓶中，每瓶接种量应含有总数为5.0 × 107个细胞的菌液。
  3. 在30 °C、200 rpm振荡条件下培养细胞至少24小时（或根据实验需要更长时间）。

5. 脂质提取所需试剂、实验耗材和设备的准备

  1. 准备以下试剂和材料：1）高纯度（>99.9%）氯仿；2）高纯度（>99.9%）甲醇；3）28%（v/v）氨水溶液（溶于纳米纯水）；4）玻璃珠（经酸洗处理，425–600 µm）；5）配有合适转接头的涡旋振荡器；6）15 mL 高速玻璃离心管，配聚四氟乙烯衬垫盖；7）氯仿与甲醇按 17:1 和 2:1 体积比配制的混合液；8）含 0.1%（v/v）氨水的氯仿/甲醇（2:1）混合液；9）ABC 溶液（155 mM 碳酸氢铵，pH = 8.0）；10）按 表1 所示，用氯仿与甲醇（2:1）混合液配制的内标脂质标准品混合液；以及 11）2 mL 玻璃样品瓶，配聚四氟乙烯衬垫盖，用于细胞脂质提取。

6. 液相色谱试剂、实验器具和设备的准备

  1. 准备以下物品：1）乙腈/2-丙醇/纳米纯水（65:35:5）混合液；2）配有合适转接头的涡旋振荡器；3）超声波破碎仪；4）带有插入式小瓶的玻璃小瓶，用于微孔板；5）配备二元泵、脱气装置和自动进样器的液相色谱系统；6）C18反相色谱柱（2.1 mm；75 mm；孔径130 Å；pH范围1-11），并连接至预柱系统；7）流动相A：乙腈/水（60:40）；8）流动相B：异丙醇/乙腈（90:10）。

7. 从酵母细胞中提取脂质

  1. 取一份酵母培养物。使用血细胞计数板或测定 OD600 来确定每毫升培养物中的酵母细胞总数。
  2. 取含有总数为 5.0 × 107 个细胞（相当于 OD600 为 3.3 单位）的酵母培养物体积，将其加入预冷的 1.5 mL 微量离心管中。
  3. 在 4 °C 条件下，以 16,000 × g 离心 1 分钟收集细胞，弃去上清液。
  4. 加入 1.5 mL 冰冷的纳米纯水，于 4 °C 以 16,000 × g 离心 1 分钟洗涤细胞，弃去上清液。
  5. 加入 1.5 mL 冰冷的 ABC 溶液，于 4 °C 以 16,000 × g 离心 1 分钟再次洗涤细胞，弃去上清液。细胞沉淀可在脂质提取前于 -80 °C 保存。
  6. 开始脂质提取时，将细胞沉淀置于冰上解冻。
  7. 将细胞沉淀重悬于 200 µL 冰冷的纳米纯水中。将细胞悬液转移至一个带聚四氟乙烯衬垫盖子的 15 mL 高强度玻璃螺口离心管中，并向该管中加入以下成分：1）用氯仿/甲醇（2:1）混合液配制的内标脂质混合物 25 µL；2）425–600 µm 酸洗玻璃珠 100 µL；3）氯仿/甲醇（17:1）混合液 600 µL。
  8. 在室温（RT）下高速涡旋振荡该管 5 分钟，以破碎细胞。
  9. 在室温下低速涡旋振荡该管 1 小时，以促进脂质的提取。
  10. 将样品置于冰上孵育 15 分钟，以促进蛋白质沉淀以及水相与有机相的分离。
  11. 在室温下，使用临床离心机以 3,000 × g 离心 5 分钟。此离心步骤可使上层水相与含有所有脂类的下层有机相分离。
  12. 使用硼硅酸盐玻璃移液管将下层有机相（约 400 µL）转移至另一个带聚四氟乙烯衬垫盖子的 15 mL 高强度玻璃螺口离心管中。转移过程中避免扰动玻璃珠或上层水相。保持下层有机相处于氮气气流中。
  13. 向剩余的上层水相中加入 300 µL 氯仿-甲醇（2:1）混合液，以提取鞘脂以及 PA、PS、PI 和 CL。在室温下剧烈涡旋振荡该管 5 分钟。
  14. 在室温下，使用临床离心机以 3,000 × g 离心 5 分钟。
  15. 使用硼硅酸盐玻璃移液管将离心后形成的下层有机相（约 200 µL）转移至第 7.13 步收集的有机相中。
  16. 使用氮气气流蒸发合并后的有机相中的溶剂。在氮气气流下密封含有脂膜的离心管，并将这些管子储存于 -80 °C。

8. 通过液相色谱分离提取的脂质

  1. 向含有第7.16步所得脂质膜的试管中加入500 µL乙腈/异丙醇/纳米纯水（65:35:5）混合液。在室温下涡旋振荡试管，每次10秒，共3次。
  2. 将试管内容物进行超声处理15分钟。在室温下涡旋振荡试管，每次10秒，共3次。
  3. 从试管中取100 µL样品，加入用于孔板的带插件的玻璃小瓶中。在将插件放入孔板前，去除插件中的气泡。
  4. 使用液相色谱系统，通过与预柱系统相连的反相C18 CSH柱分离不同脂质种类（见材料表）。分离过程中，保持色谱柱温度为55 °C，流速为0.3 mL/min。将样品置于孔板中，保持在室温。
  5. 使用由混合液A（乙腈/水[60:40 (v/v)]）和混合液B（异丙醇/乙腈[90:10 (v/v)]）组成的流动相。在正离子模式下检测由电喷雾电离（ESI）离子源产生的母离子（ESI (+)模式）时，流动相A和B中添加甲酸铵，终浓度为10 mM。在负离子模式下检测母离子（ESI (-)模式）时，流动相A和B中添加乙酸铵，终浓度为10 mM。
  6. 向ESI (+)和ESI (-)模式进样时，均使用10 µL样品体积。
  7. 采用以下液相梯度通过液相色谱分离不同脂质种类：0-1分钟，10%（B相）；1-4分钟，60%（B相）；4-10分钟，68%（B相）；10-21分钟，97%（B相）；21-24分钟，97%（B相）；24-33分钟，10%（B相）。
  8. 将提取空白样作为第一个样品、每四个样品之间以及最后一个样品进行分析。扣除背景信号以标准化数据。
  9. 图1展示了从野生型菌株BY4742细胞提取的脂质的LC/MS数据所得的代表性总离子流色谱图。

9. 经液相色谱分离的脂质的质谱分析

  1. 使用配备HESI（加热电喷雾电离）离子源的质谱仪分析经液相色谱分离的脂质。采用表2中提供的设置。
  2. 使用傅里叶变换分析器在150–2,000 Da的质量范围内以60,000的分辨率检测母离子（MS1）。
  3. 采用表3中提供的设置检测二级离子（MS2）。

10. 通过处理LC-MS/MS原始数据鉴定和定量不同脂质类别及种类

  1. 参见材料表，了解用于从原始 LC-MS/MS 文件中进行不同脂质鉴定与定量的软件。该软件使用目前最大的脂质数据库，包含超过 150 万种脂质离子前体（MS1）及其预测的碎片离子（MS2）。该软件利用 MS1 峰进行脂质定量，利用 MS2 进行脂质鉴定。两种异构型磷脂酰丝氨酸（34:0）的代表性色谱图显示于图 2，其 MS1 和 MS2 谱图分别显示于图 3和图 4；这两种异构体具有相同的 m/z 值但保留时间不同。
  2. 对包含全扫描 MS1 数据和数据依赖型 MS2 数据的 LC-MS 原始文件进行搜索，以鉴定游离（非酯化）脂肪酸（FFA）、心磷脂（CL）、植烷酰神经酰胺（PHC）、植烷鞘氨醇（PHS）、磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰甘油（PG）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰丝氨酸（PS）和三酰甘油（TAG）等脂质类别，前体离子的 m/z 容差设为 5 ppm，产物离子容差设为 10 ppm。其他搜索参数见表 4。请遵循软件用户手册中的操作说明。内部脂质标准品及具有非常见脂肪酸组成的脂质种类的鉴定需手动验证。
  3. 为借助 Lipid Search 软件的免费开源替代工具来鉴定和定量不同脂质类别及种类，可使用 Lipid Data Analyzer（http://genome.tugraz.at/lda2/lda_download.shtml）、MZmine 2（http://mzmine.github.io/）或 XCMS（https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/xcms.html）软件处理 LC-MS/MS 的原始数据。

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结果

我们利用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）对酵母细胞内主要细胞脂质进行定量评估的方法具有良好的通用性和稳健性。该方法使我们能够鉴定并定量在含有2%葡萄糖的合成基本YNB培养基中培养的S. cerevisiae细胞中的10种不同脂质类别。这些脂质类别包括游离（非酯化）脂肪酸（FFA）、心磷脂（CL）、植烷酰神经酰胺（PHC）、植烷鞘氨醇（PHS）、磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰甘油（PG）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰丝氨酸（PS）和三酰甘油（TAG）（补充表1）。通过该LC-MS/MS方法，我们鉴定并定量了每一类脂质中的多种分子种类（补充表1）。

我们的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法也具有高灵敏度。事实上，该方法能够对浓度低至 0.165 pmol/µL 的脂质分子种类进行鉴定和定量（见表5中植物鞘氨...

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讨论

以下预防措施对于成功实施本文所述方案至关重要：

1. 氯仿和甲醇具有毒性。它们能有效从各种表面提取物质，包括实验室塑料器皿和皮肤。因此，在操作中应谨慎处理这些有机溶剂：避免在接触氯仿和/或甲醇的步骤中使用塑料制品，使用硼硅酸盐玻璃移液管进行这些操作，并在使用前用氯仿和甲醇冲洗这些移液管。

2. 使用甲醇/氯仿（17:1）混合液进行脂质提取时，用硼硅酸盐玻璃移液管将下层有机相（约400 µL）转移至带有聚四氟乙烯衬垫盖的15 mL高强度玻璃螺口离心管中。转移过程中不得扰动玻璃珠或上层水相。保持下层有机相处于氮气气流中。

3. 在进行 LC-MS/MS 样品制备时，将玻璃小瓶插入孔板之前，必须去除所有气泡。

4. 为在液相色谱分离脂质前实现甲酸铵和乙酸铵在流动相A和流动相B中的完全溶解，需先将每种盐分别溶于500 µL的纳米纯水中，再将溶液与流动相混合，并超声处理20分钟。

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

我们感谢Titorenko实验室现任和前任成员的讨论与交流。感谢康考迪亚大学的生物质谱应用中心和结构与功能基因组学中心提供的卓越服务。本研究得到了加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）（项目编号：RGPIN 2014-04482）和康考迪亚大学主席基金（CC0113）的资助。K.M. 获得了康考迪亚大学优秀奖的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
15 mL 高速玻璃离心管，带聚四氟乙烯（Teflon）衬里瓶盖PYREX05-550
2 mL 玻璃样品瓶，带聚四氟乙烯（Teflon）衬里瓶盖Fisher Scientific60180A-SV9-1P
2-丙醇Fisher ScientificA461-500
乙腈Fisher ScientificA9554
Agilent 1100 系列液相色谱系统Agilent TechnologiesG1312A
Agilent 1100 微孔板Agilent TechnologiesG1367A
乙酸铵Fisher ScientificA11450
碳酸氢铵Sigma9830
甲酸铵Fisher ScientificA11550
氢氧化铵Fisher ScientificA470-250
蛋白胨Fisher ScientificBP1420-2
心磷脂Avanti Polar Lipids750332
Centra CL2 临床离心机Thermo Scientific004260F
神经酰胺Avanti Polar Lipids860517
氯仿Fisher ScientificC297-4
CSH C18 VanGuardWaters186006944预柱系统
游离脂肪酸（19:0）Matreya1028
玻璃珠（酸洗，425–600 μM）Sigma-AldrichG8772
葡萄糖Fisher ScientificD16-10
血细胞计数板Fisher Scientific267110
L-组氨酸SigmaH8125
Lipid Search 软件（V4.1）Fisher ScientificV4.1LC-MS/MS 分析软件
L-亮氨酸SigmaL8912
L-赖氨酸SigmaL5501
甲醇Fisher ScientificA4564
磷脂酰胆碱Avanti Polar Lipids850340
磷脂酰乙醇胺Avanti Polar Lipids850704
磷脂酰甘油Avanti Polar Lipids840446
磷脂酰肌醇Avanti Polar LipidsLM1502
磷脂酰丝氨酸Avanti Polar Lipids840028
反相色谱柱 CSH C18Waters186006102
鞘氨醇Avanti Polar Lipids860669
Thermo Orbitrap Velos 质谱仪Fisher ScientificETD-10600
甘油三酯Larodan, MalmoTAG Mixed FA
超声波破碎仪Fisher Scientific15337416
尿嘧啶SigmaU0750
涡旋振荡器Fisher Scientific2215365
酵母提取物Fisher ScientificBP1422-2
不含氨基酸的酵母氮源基础培养基Fisher ScientificDF0919-15-3
酵母菌株 BY4742DharmaconYSC1049

参考文献

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