本方案介绍了一种用于同步辐射X射线吸收光谱实验的生物冷冻样品制备的详细步骤。我们描述了优化样品制备和冷冻保存所需的所有步骤，并以癌细胞和浮游植物细胞为例展示了该方案的应用。该方法为生物样品的冷冻制备提供了通用标准。
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本文内容
摘要
摘要
利用X射线吸收光谱法（XAS）研究元素在生物系统中金属的作用具有重要意义。样品制备是其中关键且通常较为复杂的步骤，尤其对于生物样品而言更是如此。尽管X射线形态分析技术已被广泛应用，但目前尚未向该技术的使用者发布详细的实验方案。此外，化学状态的改变是一个需要关注的问题，建议采用基于冷冻的技术，以接近天然水合状态分析生物样品，从而最大程度地保持细胞或组织的化学完整性。本文提出了一种基于冷冻保存样品的细胞制备方案，并将其应用于癌细胞中硒的高能量分辨率荧光检测X射线吸收光谱研究，以及浮游植物中铁的研究。该方案也可用于其他生物样品以及其他易受辐照损伤的X射线技术。
引言
对必需或有毒元素的细胞生物转化过程的研究需要高灵敏度的形态分析技术，并应尽量减少样品前处理步骤，因为这些步骤往往容易导致化学形态的改变。
硒和铁等生理元素由于其复杂的化学性质、不同硒或铁物种的稳定性差异，以及在样品中极低的浓度（ppm（mg/kg）甚至低于ppm水平），通常难以进行形态分析。因此，利用X射线吸收谱（XAS）研究这些元素的形态具有极大挑战性。在同步辐射光源上，可采用同步辐射XAS技术，尤其是高能量分辨率荧光检测XAS（HERFD-XAS），后者能够实现极低的信号与背景比1，从而对复杂生物基质中高度稀释的元素进行形态分析2,3。常规荧光XAS测量可在欧洲同步辐射装置（ESRF）的CRG-FAME光束线上，使用能量分辨的固态探测器（SSD）进行，其能量带宽约为150–250 eV4；而HERFD-XAS测量则需在ESRF的CRG-FAME-UHD光束线上，采用晶体分析谱仪（CAS），其能量带宽约为1–3 eV2。两种方法分别通过电子或光学过程，根据荧光光子的能量对其进行分辨。
样品的冷冻制备对于保持结构完整性及化学组成的原始状态至关重要，从而使得分析能够....
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方案
1. 用于硒形态分析的人源PC-3和OVCAR-3癌细胞沉淀物的制备
注意：以下实验方案改编自 Weekley 等人的研究10。所有步骤均须在生物安全二级条件和限制下，于细胞培养罩内采用无菌技术进行。
- 使用马氏计数板对细胞进行计数。PC-3细胞系每瓶接种150,000–200,000个细胞，OVCAR-3细胞系每瓶接种300,000个细胞。
- 在适当的细胞培养基中，将种子细胞接种于T-75培养瓶中（每种条件设三个培养瓶，以实现三重复）表1在超净工作台内。
- 将细胞培养物置于37 °C、含5% CO₂的湿润培养箱中继续培养2 待其生长至80%融合度。通常情况下，PC-3前列腺癌细胞系每24小时倍增一次，而OVCAR-3卵巢癌细胞系则需72小时。培养瓶须置于培养箱中。
- 同时，将用于处理的硒纳米颗粒（Se-NPs）稀释至最终浓度，该浓度对应于通过MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）法预先测定的IC20（抑制浓度，即引起20%细胞死亡的浓度），用于评估细胞毒性。这些浓度因Se-NPs的类型而异，也因所研究的细胞系不同而有所差异。
- 将纳米颗粒储备液（2 mg/mL）置于 在室温（RT）下，于超声水浴中处理30分钟，使用牛血清白蛋白（BSA....
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结果
这些制备的主要目的是研究硒纳米颗粒（Se-NPs）与癌细胞之间的相互作用，以及浮游植物中铁的结合与隔离。
初始状态（BSA Se-NPs）以及在营养培养基中孵育后的细胞（BSA Se-NPs 经24小时孵育后）中硒的HERFD-XANES谱图如图10所示。结果表明，初始Se-NPs中的硒以Se(0)和类似亚硒酸盐的形式存在，而在与PC-3细胞相互作用后，细胞内的硒主要以Se(0)形式存在，表明细胞内硒的物种发生了变化。对于铁元素，参考样品的HERFD-XANES谱图显示出明显的边位置差异，取决于铁的氧化态，其中还原态铁物种的边位置向低能量方向偏移（图11）。在同一硅藻颗粒位置连续采集的两条谱图相似，表明在10 K的氦低温恒温器条件下进行两次采集时，光束损伤有限。此外，从硅藻颗粒不同位置（此处为三个位置）获得的谱图完全一致，说明样品颗粒具有均一性，因此可将谱图进行平均以获得信噪比更高的谱图（平均谱图）。硅藻的平均谱图显示其.......
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讨论
本方案通过X射线吸收光谱法研究生物样品中硒和铁的化学形态。重点介绍生物样品及参比化合物的冷冻制备与储存，以及高能量分辨率荧光检测X射线吸收光谱（HERFD-XAS）测量。
冷冻制备与保存
对大体积生物样品颗粒进行冷冻制备，可有效保存样品中各类化学组分的完整性。这一点至关重要，因为在样品制备过程中若采用冷冻干燥或空气干燥方法，已观察到化学形态发生变化6。当所选用于测量的光束线配备了氦气低温恒温器后，应立即采用本方案。
对于参比化合物，当使用对氧化还原敏感的元素时，必须在无氧气氛中操作，以保持其氧化态。随后可通过谱图边缘位置的变化来验证，如二价和三价铁参比化合物所示（图11）。
此样品制备可在同步辐射或实验室分析之前进行。在此情况下，应将冷冻沉淀物或参照样品转移至冻存管中，并储存在液氮中2 罐。该LN<.......
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致谢
我们感谢CEMHTI（法国奥尔良，ANR-13-BS08-0012-01）和Labex OSUG@2020（法国格勒诺布尔，ANR-10-LABX-0056）对光束线开发提供的资金支持。FAME-UHD项目获得了法国"grand emprunt" EquipEx（EcoX，ANR-10-EQPX-27-01）、CEA-CNRS CRG联合体以及INSU CNRS研究所的财政资助。我们感谢在实验过程中所有参与人员的贡献，特别是BM30B和BM16线站上的所有工作人员。作者感谢欧洲同步辐射设施提供的同步辐射机时。我们同时感谢PHYTOMET ANR项目（ANR-16-CE01-0008）和SEDMAC项目（INCA-Plan cancer-ASC16019CS）提供的资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 硝酸铵 | Sigma-Aldrich | A3795 | NH4NO3，溶于milliQ水，浓度为2.66 mg/L |
| 厌氧培养箱 | Coy Laboratory, USA | 配备厌氧监测仪（CAM-12） | |
| 抗生素储备液 | Sigma-Aldrich | A0166（氨苄青霉素），S9137（硫酸链霉素） | 溶于milliQ水，浓度为1 mL/L（氨苄青霉素钠和硫酸链霉素，100 mg/mL） |
| 氮化硼粉末 | Sigma-Aldrich | 255475 | |
| 细胞计数板 | Neubauer 或 Malassez | ||
| 细胞刮刀 | |||
| 杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS） | GIBCO | 14190-094 | 不含钙、镁和酚红 |
| Eppendorf 管 | 0.5 mL 和 1.5 mL | ||
| Falcon 管 | 15 mL 和 50 mL | ||
| 柠檬酸铁（Fe/柠檬酸 = 1/20） | Sigma-Aldrich | F3388 | FeCl3 50 mM 和柠檬酸钠 1 M 的水溶液，pH 6.5 |
| 胎牛血清 | GIBCO | A31604-02 | 性能增强型，经认证的 One Shot 规格，源自美国 |
| 培养瓶 | Sigma-Aldrich | Z707503 | TPP，表面积 150 cm² |
| 生长培养箱 | Sanyo | Sanyo MLR-352 | 20°C，12:12 光照（3,000 lux）暗周期 |
| HEPES 缓冲液 | Sigma-Aldrich | H4034 | HEPES 溶于 milliQ 水，浓度为 1 g/L |
| 高级别浆液性卵巢癌细胞系 OVCAR-3 | ATCC, Rockville, MD | HTB-161 | 储存温度：液氮蒸气相温度 |
| 培养箱 | 37°C，加湿环境，含 5% CO2 | ||
| 牛胰腺胰岛素溶液 | Sigma-Aldrich | I0516 | 胰岛素 10 mg/mL 溶于 25 mM HEPES（pH 8.2），BioReagent 级，经无菌过滤，适用于细胞培养 |
| 手动液压机 | Specac, USA | ||
| 海洋硅藻 Phaeodactylum tricornutum | Roscoff 培养物保藏中心 | RCC69 | http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69 |
| 吗啉代丙磺酸 | Sigma-Aldrich | M3183 | MOPS，溶于 milliQ 水，浓度为 250 mg/L（pH 7.3） |
| 光学显微镜 | |||
| 前列腺癌细胞系 PC-3 | ECCAC, Salisbury, UK | 90112714 | 储存温度：液氮蒸气相温度 |
| 青霉素-链霉素溶液 | Sigma-Aldrich | P4333 | 稳定化溶液，含 10,000 单位青霉素和 10 mg 链霉素/mL，经无菌过滤，BioReagent 级，适用于细胞培养 |
| 移液器辅助器（Pipette-boy） | 25 mL、10 mL 和 5 mL 无菌塑料移液管 | ||
| 浮游生物培养基 Mf：海水盐 | Sigma-Aldrich | S9883 | 40 g/L 的 milliQ 水。成分：Cl⁻ 19.29 g，Na⁺ 10.78 g，SO₄²⁻ 2.66 g，Mg²⁺ 1.32 g，K⁺ 420 mg，Ca²⁺ 400 mg，CO₃²⁻/HCO₃⁻ 200 mg，Sr²⁺ 8.8 mg，BO₂⁻ 5.6 mg，Br⁻ 56 mg，I⁻ 0.24 mg，Li⁺ 0.3 mg，F⁻ 1 mg |
| 塑料镊子 | Oxford Instrument | AGT 5230 | |
| RPMI 1640 培养基（ATCC 改良型） | GIBCO | A10491-01 | 含 4.5 g/L D-葡萄糖、1.5 g/L 碳酸氢钠、110 mg/L（1 mM）丙酮酸钠、2.388 g/L（10 mM）HEPES 缓冲液和 300 mg/L L-谷氨酰胺的溶液，仅供科研使用 |
| 硒纳米颗粒（Se-NPs），牛血清白蛋白（BSA）包被，2 mg/mL | NANOCS Company, USA | Se50-BS-1 | BSA 稳定的 Se-NPs 溶液。平均粒径约 30 nm。4°C 避光保存。 |
| 硒纳米颗粒（Se-NPs），壳聚糖包被，2 mg/mL | NANOCS Company, USA | 11. Se50-CS-1 | 壳聚糖稳定的 Se-NPs 溶液。平均粒径约 30 nm。4°C 避光保存。 |
| 五水合硅酸钠 | Sigma-Aldrich | 71746 | Na2SiO3·5H2O，溶于 milliQ 水，浓度为 22.8 mg/L |
| 硝酸钠 | Sigma-Aldrich | S5022 | NaNO3，溶于 milliQ 水，浓度为 75 mg/L |
| 磷酸二氢钠 | Sigma-Aldrich | S5011 | NaH2PO4，溶于 milliQ 水，浓度为 15 mg/L |
| T-75 培养瓶 | |||
| 组织培养超净台 | |||
| 微量元素储备液 | Sigma-Aldrich | M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857 | 1 mL/L 的 milliQ 水（MnCl2·4H2O 200 mg/L，ZnSO4·7H2O 40 mg/L，Na2MoO4·2H2O 20 mg/L，CoCl2·6H2O 14 mg/L，Na3VO4·nH2O 10 mg/L，NiCl2 10 mg/L，H2SeO3 10 mg/L） |
| 台盼蓝溶液（0.4%） | GIBCO | 15250061 | |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含酚红 | GIBCO | 25300-054 | |
| 维生素储备液 | Sigma-Aldrich | T1270（硫胺素），B4639（生物素），V6629（维生素B12） | 1 mL/L 的 milliQ 水（盐酸硫胺素 20 mg/L，生物素 1 mg/L，维生素B12 1 mg/L） |
| 37°C 水浴 |
参考文献
- Llorens, I., et al. High energy resolution five-crystal spectrometer for high quality fluorescence and absorption measurements on an x-ray absorption spectroscopy beamline. Review of Scientific Instruments. 83 (6), 063104(2012).
- Proux, O., et al.
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