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使用χCRAC技术在活体内以高时间分辨率监测蛋白质-RNA相互作用动态

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DOI：

10.3791/61027

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2020年5月9日

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1Centre for Engineering Biology, University of Edinburgh, 2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.

本文内容

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摘要

动力学交联与cDNA分析是一种能够在活细胞中以高时间分辨率研究蛋白质-RNA相互作用动态过程的方法。本文详细描述了该实验方案，包括酵母细胞培养、紫外交联、细胞收集、蛋白质纯化以及下一代测序文库制备等步骤。

摘要

RNA结合蛋白（RBPs）与其RNA底物之间的相互作用具有动态性和复杂性。在一条RNA的生命周期中，可被多种不同的RNA结合蛋白结合，从而调控其生成、稳定性、活性及降解过程。因此，人们已开展大量研究以揭示这两类分子之间相互作用的动态机制。其中一项重要突破源于“c罗斯-l印迹与 i免疫p交联免疫沉淀（CLIP）。该技术使得研究人员能够严格地鉴定特定RNA结合蛋白（RBP）所结合的RNA分子。简而言之，目标蛋白在体内通过紫外照射与RNA底物共价交联，随后在高严谨性条件下纯化，再将共价交联至蛋白的RNA转化为cDNA文库并进行测序。自该技术提出以来，已衍生出多种改进方法，以适应不同研究领域的需要。然而，紫外光交联的效率历来较低，导致需要较长的照射时间，从而无法实现对RBP-RNA相互作用的动态时间过程研究。为解决这一问题，我们近期设计并构建了性能显著提升的紫外照射与细胞收集装置。利用这些新工具，我们建立了一种可在活细胞中以高时间分辨率进行RBP-RNA相互作用动力学分析的实验方案：动力学 CR交联 A分析 cDNA（χCRAC）。我们近期利用该技术研究了酵母RNA结合蛋白（RBP）在营养胁迫适应中的作用。本文详细概述了χCRAC方法，并展示了利用Nrd1 RBP获得的最新研究结果。

引言

RNA通常依赖RNA结合蛋白（RBP）来发挥其功能，这使得人们对这些分子之间的相互作用动态产生了极大兴趣。目前已在多种生物体中鉴定出许多RBP。然而，体内研究RBP与RNA的相互作用一直极具挑战性。研究此类相互作用的一个重大突破是CLIP技术的出现1。该方法利用紫外线（UV，254 nm）照射，在RBP与其直接结合的RNA之间诱导形成共价键（即零距离交联）。随后，在严格条件下通过免疫纯化目标RBP，以确保仅能鉴定到与蛋白共价交联的RNA。结合的RNA随后经RNase部分消化，再转化为cDNA文库用于测序。高严格性的纯化步骤至关重要，因为它显著提高了蛋白和RNA回收的特异性，这一特异性还可通过SDS-PAGE进一步纯化交联的核糖核蛋白（RNP）复合物而得到增强。CLIP及相关方法能够以单核苷酸分辨率揭示蛋白结合位点，因为在测序文库构建过程中，与RNA交联的氨基酸常常会终止逆转录酶反应，或导致该酶在交联位点引入突变1,2,3。

自原始CLIP方案问世以来，已衍生出多种改进方法。其中一项重要突破是HITS-CLIP（或称CLIP-seq）的发展，该方法将高通量测序与CLIP技术相结合3。此后，所有基于CLIP的方法均采用了这一测序策略。iCLIP在RNase介导的RNA片段化和接头连接技术方面进行了优化，有助于更精确地定位RBP结合位点4。PAR-CLIP则结合了4-硫代尿苷/尿嘧啶标记与365 nm波长的交联，使得通过分析T-C替换来定位交联位点成为可能5。CRAC、urea-iCLIP、dCLIP和uvCLAP引入了变性条件及双重亲和纯化步骤，进一步降低了亲和树脂上的非特异性结合，显著提高了目标蛋白捕获的特异性2,6,7,8,9。此外，CRAC、uvCLAP和dCLIP还引入了对目标RBP进行亲和标签标记的策略，从而避免了制备特异性抗体的需要。

为了加快CLIP方法的流程，还进行了多项优化。原始的CLIP实验方案采用对捕获的RNA进行放射性标记，以便在SDS-PAGE后可视化RBP-RNA复合物。然而，对于不具备放射性操作条件的实验室而言，使用放射性物质可能带来困难。irCLIP引入了荧光团偶联的接头，可通过红外成像实现检测10；而sCLIP则通过对捕获的RNA进行生物素标记，利用链霉亲和素偶联的HRP进行检测11。此外，eCLIP完全省去了RNA标记步骤，而是根据蛋白质已知的分子量直接切取目标蛋白条带12。在FAST-iCLIP中，也采用了基于链霉亲和素的纯化策略以加速文库构建：将生物素化的3’接头连接到RNA上，并用于逆转录和环化后的纯化步骤13。对iCLIP实验方案的其他改进也显著提高了文库的复杂度4。

最后，CLIP 技术已得到改进，可用于捕获来自不同细胞亚区室的 RNA 结合蛋白14,15，通过脉冲诱导光激活核糖核苷来可视化新转录的 RNA5,16,17，捕获甲基化 RNA18,19,20，研究 RNA-RNA 相互作用21,22，以及绘制 RNA 的 3’ 末端图谱23,24。

尽管基于CLIP的技术在帮助我们理解RNA结合蛋白（RBPs）与RNA之间的相互作用方面做出了重要贡献，但其应用受到紫外（UV）交联效率低下的限制。虽然单层培养的细胞通常相对容易进行交联，但在组织或悬浮细胞中实现有效交联则具有显著挑战性。组织可能需要多轮UV照射才能穿透至目标细胞层，而微生物细胞通常在含有芳香族、吸收UV的化合物的丰富培养基中生长25。事实上，对于此类样本，已有研究采用长达30分钟的UV照射时间，以实现RNA结合蛋白与其结合RNA之间足够的交联效率26,27,28。然而，这种长时间的UV照射会诱导细胞内的应激反应，例如UV引起的DNA损伤，这在某些应用中可能污染最终的实验数据。

大多数CLIP研究集中于在细胞中生成特定蛋白-RNA相互作用的单个"快照"。然而，蛋白-RNA相互作用本质上是动态的，尤其是在细胞受到环境变化影响时。这可能包括必需营养物质的突然减少或温度的快速变化。因此，为了真正理解RNA结合蛋白（RBP）在应激过程中的作用，最好进行时间分辨分析，因为这类分析能够捕获应激期间RBP靶标的完整谱系，并确定所选RBP在应激反应的哪个阶段具有活性。特别是酵母中的研究表明，适应的最初几分钟对于细胞存活至关重要，而细菌中RNA的半衰期可从几分钟到几秒不等29,30,31,32,33。因此，理想情况下，此类时间分辨分析应在高时间分辨率下进行。然而，较长的交联时间使得对早期适应性反应的研究尤为困难。

为了解决上述问题，我们近期开发了一种改进方法，能够在分钟级的时间尺度上实现细胞的交联与收集。我们的χCRAC方法可对RNA结合蛋白（RBP）与RNA相互作用的动态变化进行定量测量，其分辨率达到了前所未有的水平。该方法的关键在于开发了一种新型紫外（UV）照射装置32，可将溶液中酵母和细菌所需的交联时间缩短约10倍，从而近乎瞬时地“冻结”RBP-RNA相互作用。此外，为了在紫外照射后快速收集细胞，我们还开发了一种真空过滤装置，可在约30秒内收集0.5 L培养体积中处于指数生长期的酵母32。这些技术创新使得在分钟级分辨率下研究RBP-RNA动态成为可能。同时，我们还对原始CRAC实验流程2进行了多项优化，以提高其实用性。

我们最近利用χCRAC研究了酵母核内RNA结合蛋白Nab3在葡萄糖剥夺条件下的靶标组。在Saccharomyces cerevisiae中，Nab3可与RNA结合蛋白Nrd1及RNA解旋酶Sen1形成NNS复合物。NNS复合物结合于RNA聚合酶及新生转录本时，可触发转录终止34。该复合物主要参与清除隐蔽的非编码RNA转录本，但也被证明可调控蛋白编码基因的表达。研究显示，在施加胁迫仅一分钟后，Nab3即表现出对非编码和编码转录本的差异性靶向32。我们证明，Nab3介导的共转录终止导致逆转座子基因呈现非常短暂的脉冲样表达，而这种表达模式使用传统的基于CLIP的方法难以检测。此外，我们在UV交联仪中采用的短时间紫外照射显著提高了短寿命非编码RNA的回收率32。χCRAC有望成为解析RNA结合蛋白如何在即时时间尺度上塑造应激反应，以及其在整个应答生命周期中功能动态变化的关键工具。本文提供了χCRAC实验方案中所有步骤的详细概述。为便于说明，本方法被用于研究酵母Nrd1蛋白及其在葡萄糖剥夺条件下、多个时间点上的RNA靶标组，Nrd1参与转录终止和RNA降解过程35,36。最后，我们还证明，我们的紫外照射装置能够快速将RNA结合蛋白与HeLa细胞中的RNA交联，从而使得在贴壁细胞中开展高分辨率的时间分辨分析成为可能。

方案

TN150
50 mM Tris pH 7.8
150 mM NaCl
0.1% NP-40
1X 蛋白酶抑制剂
TN1000
50 mM Tris pH 7.8
1M NaCl
0.1% NP-40
NP-PNK
50 mM Tris-HCl pH 7.8
10 mM MgCl2
0.1% NP-40
5 mM β-巯基乙醇
5 x PNK
250 mM Tris-HCl pH 7.8
50 mM MgCl2
50 mM β-巯基乙醇
WB I
50 mM Tris-HCl pH 7.8
300 mM NaCl
10 mM 咪唑
6M 盐酸胍
0.1% NP-40
5 mM β-巯基乙醇
WB II
50 mM Tris-HCl pH 7.8
50 mM NaCl
10 mM 咪唑
0.1% NP-40
5 mM β-巯基乙醇
洗脱缓冲液
50 mM Tris pH 7.8
50 mM NaCl
250 mM 咪唑
0.1% NP-40
5 mM β-巯基乙醇
蛋白酶K缓冲液
50 mM Tris
0.1% NP-40
5 mM β-巯基乙醇
1% SDS
5 mM EDTA
50 mM NaCl2
哺乳动物裂解缓冲液
50 mM Tris-HCl pH 8
100 mM NaCl
0.5% v/v Triton X-100
0.25% w/v 脱氧胆酸钠
0.1% w/v SDS
5 mM EDTA
1 mM DTT（新鲜加入）
1X 蛋白酶抑制剂

表1：χCRAC 所需的缓冲液及其成分。

1. 紫外交联和裂解液制备

  1. 溶液中的微生物
    1. 将过夜培养的酵母接种至3.5 L所需培养基中，起始OD600为0.05。在30 °C、180 rpm持续振荡条件下培养。
    2. 在培养过程中，准备其他必要材料。
      1. 准备一容器液氮。
      2. 准备3 L诱导应激的培养基，并在水浴中预热至30 °C。
      3. 设置过滤装置，打开交联仪（图2A），并标记50 mL锥形管，每个时间点使用一支。
    3. 当细胞达到所需OD600时，将500 mL细胞直接倒入交联仪中，用250 mJ的254 nm紫外光进行照射。有关交联仪的使用细节，请参见图2A和图3A。
      注意：针对每种目标蛋白，紫外照射能量必须仔细优化。详见讨论部分。
    4. 交联完成后，使用一种真空过滤装置（图2B、C）过滤细胞。将带有过滤后细胞的膜卷起，放入t = 0（零时间点）的50 mL锥形管中，并在液氮中快速冷冻。
    5. 将剩余细胞分别过滤到六个不同的滤膜上。通过将滤膜投入已预热的3 L应激诱导培养基中，并用移液条剧烈混匀50秒，重悬收集的细胞。50秒后，准备采集t = 1样本。
    6. 1分钟后，对500 mL细胞进行交联，并按照步骤1.1.3–1.1.4的方法进行过滤收集。之后在2、4、8、14和20分钟，或根据需要选择其他时间点重复该过程。
    7. 将含有细胞的锥形管在-80 °C保存。将磷酸盐缓冲液（PBS）置于4 °C过夜。
    8. 次日，取出每个含有交联样品的锥形管，通过剧烈振荡将其细胞重悬于25 mL冷PBS中。
    9. 将细胞悬液转移至新的锥形管中，在4 °C条件下以4,600 x g离心5分钟。
    10. 倒掉PBS，迅速再次离心以收集残留液体，然后用移液器吸除剩余液体。
    11. 通过与空管比较，计算管中沉淀物的重量。
    12. 加入两倍沉淀物体积的冰冻TN150缓冲液、60 µL DNase 1和10 µL RNase抑制剂。在冰上孵育30分钟。
      1. 例如，对于400 mg细胞，加入800 µL冰冻TN150缓冲液。
      2. 对于大多数可溶性蛋白，添加DNase并非必需，但在研究染色质结合蛋白（如RNA聚合酶）时非常重要。此外，它还能降低细菌裂解液的黏度。使用裂解缓冲液时必须精确加入两倍沉淀物体积，否则可能导致裂解效率下降。
    13. 向细胞悬液中加入三倍沉淀物体积（以mL计）的氧化锆珠。酵母使用直径0.5 mm的珠子，细菌使用直径0.1 mm的珠子。
      1. 例如，对于400 mg细胞，在1.5 mL离心管中量取1.2 mL氧化锆珠，并将其加入重悬于裂解缓冲液中的细胞中。
    14. 将细胞悬液涡旋1分钟，然后置于冰上1分钟。重复此过程共5次。
    15. 加入两倍沉淀物体积的TN150缓冲液，并剧烈涡旋混合。
    16. 在台式离心机中，于4 °C以4,600 g离心20分钟。
      1. 离心后，取50 µL上清液用于后续Western blot分析，以检测全细胞蛋白表达水平。
    17. 将上清液转移至1.5 mL离心管中，在微量离心机中于4 °C以20,000 x g离心20分钟。
      1. 或者，若使用5 mL离心管，则以13,000 x g离心20分钟。
      2. 离心后，取50 µL上清液用于后续Western blot分析，以检测蛋白的可溶性表达水平。
    18. 进行RBP捕获（第2节）。
  2. 培养的贴壁细胞
    1. 在紫外交联前24小时，将足够数量的贴壁细胞接种于培养皿中，使其第二天达到80%汇合度。在细胞培养箱中，于37 °C、5% CO2条件下在所需培养基中过夜培养。
      注意：若使用石英培养皿，建议在接种前2.5小时通过聚-D-赖氨酸（70,000–140,000分子量）和胎牛血清（FCS）处理培养器皿以促进细胞贴附。加入足量聚-D-赖氨酸覆盖整个生长表面，在室温（RT）孵育5分钟。随后，用清水彻底冲洗石英培养皿，并在细胞培养箱中干燥2小时或直至完全干燥。之后，加入足量FCS完全覆盖生长表面，并在培养箱中放置至少30分钟。接种细胞前应完全去除FCS。
    2. 当细胞达到80%汇合度后，移除培养基，并用15 mL冰冻PBS洗涤。接着，彻底去除所有残留液体，并立即进入下一步。
    3. 将培养皿转移至贴壁细胞专用托盘（图3B），用300 mJ的254 nm紫外光进行照射。有关交联仪的使用细节，请参见图2A和图3B。
      注意：针对每种目标蛋白，紫外照射能量必须仔细优化。详见讨论部分。
    4. 交联后立即把培养皿放在冰上，加入10 mL冰冻PBS。用刮棒收集细胞并转移至15 mL锥形管中，在4 °C条件下以300 x g离心5分钟形成沉淀。
    5. 去除PBS，将细胞沉淀重悬于1 mL冰冻PBS中，并转移至1.5 mL微量离心管中。再次在4 °C条件下以300 x g离心5分钟收集细胞。
    6. 去除PBS，并在干冰上迅速冷冻细胞沉淀。按需将细胞沉淀保存于-80 °C。
    7. 对每个时间点重复步骤1.2.3–1.2.6。
    8. 将细胞沉淀重悬于1 mL裂解缓冲液中，并转移至15 mL锥形管。随后再加入1 mL裂解缓冲液，总体积为2 mL。
    9. 加入5 µL哺乳动物RNase抑制剂。
    10. 在冰上以10安培功率超声处理5次，每次10秒，两次之间间隔30秒。
    11. 测定各样品的蛋白浓度，并归一化至最低浓度。
    12. 将1.98 mL裂解液转移至2 mL离心管中。
    13. 加入10 µL DNase I，在37 °C、1,200 rpm振荡条件下孵育5分钟。
    14. 在4 °C条件下以16,000 x g离心20分钟。
      1. 离心后，取50 µL上清液用于后续Western blot分析，以检测蛋白的可溶性表达水平。
    15. 进行RBP捕获（第2节）。

2. RBP 捕获

  1. 用 5 mL TN150 缓冲液将磁性抗 FLAG 抗体珠（每份样品 75 µL 悬液）或 IgG 琼脂糖珠（每份样品 500 µL 悬液）洗涤 3 次。最后重悬于 700 µL TN150 缓冲液中，并将 100 µL 洗涤后的珠子加入七个 15 mL 圆锥管中。
    1. 使用前置于冰上保存。
  2. 裂解液澄清后，将上清液加入含有抗 FLAG 抗体珠或 IgG 珠的离心管中。
  3. 在 4 °C 下旋转孵育 2 小时。
    注意：某些方案描述了与珠子过夜孵育，但不推荐此操作，因为长时间孵育会显著降低交联 RNA 的回收率。

3. 磁珠洗涤及标签的TEV蛋白酶切割

  1. 收集珠子并去除裂解液。
    1. 取50 µL上清液样品，用于后续Western blot分析，以检测未被捕获的蛋白质。
  2. 将珠子重悬于预冷的TN1000缓冲液中，并转移至1.5 mL离心管。在4 °C条件下，以轻微振荡孵育10分钟。共重复洗涤三次。
    1. 若使用IgG琼脂糖珠，每次用5 mL TN1000缓冲液洗涤；若使用抗FLAG珠，则每次使用2 mL。
  3. 随后，使用与上述相同体积的TN150缓冲液，重复洗涤珠子三次。
  4. 第三次洗涤后，将珠子重悬于600 µL TN150缓冲液中。
  5. 向珠子悬液中加入30 U自制的GST-TEV蛋白酶，在室温下旋转孵育2小时。
    注意：重组GST-TEV蛋白酶现已可商业购买，但尚未在本实验方案中进行测试。
    1. 在消化过程中，为下一步操作做准备：为每个样品设置由三个1.5 mL离心管组成的列（例如，对于七个样品，应准备三行七列）。
    2. 向最后一行的各管中加入0.4 g盐酸胍、27 µL 5 M氯化钠和3 µL 2.5 M咪唑（pH = 8）。请注意，咪唑的pH必须为8，这对维持RNA完整性至关重要。
    3. 此外，将所需体积的镍珠用WB I缓冲液洗涤三次，每份样品使用100 µL珠悬液。最后一次洗涤后，将珠子重悬于原始体积的WB I缓冲液中，并置于冰上保存。
  6. TEV消化完成后，使用磁力架（针对抗FLAG珠）或离心（针对IgG珠）收集上清液，并转移至先前准备好的第一行离心管中。
    1. 取50 µL TEV洗脱液样品，用于Western blot分析。
  7. 将恒温金属浴预热至37 °C。向第二行各管中加入1 µL RNase混合酶（1:50稀释）。
  8. 从第一行各管中取550 µL TEV洗脱液，加入第二行（含RNase混合酶）的对应管中，充分吹打混匀。
  9. 完成第一个样品的操作后，立即将其放入恒温金属浴中并启动计时器。继续处理后续样品，使各样品处理时间依次错开。
  10. 准确孵育5分钟。孵育结束后，立即取出第一个样品，将其溶液转移至第三行的对应管（含盐酸胍粉末）。
    注意：通常情况下，使用1:50稀释的RNase混合酶孵育5分钟适用于大多数蛋白质，但此步骤需根据不同蛋白优化孵育时间或酶浓度，以确保交联的RNA片段大小合适（30–100 nt）。
  11. 立即以最大速度涡旋数秒，使盐酸胍粉末充分溶解，然后继续处理下一个样品。
  12. 所有样品转移至含盐酸胍粉末的管中后，再次涡旋，确保所有粉末完全溶解。
  13. 每管加入100 µL已洗涤的镍珠，在4 °C旋转孵育过夜。此孵育时间可缩短至2小时。

4. 磁珠上碱性磷酸酶处理

  1. 将恒温金属块设置为 37 °C。
  2. 将纯化离心柱放入 2 mL 离心管中，每个样品对应一个。将镍珠转移至离心柱中，使上清液滤出。随后，用 WB I 洗涤 1.5 mL 离心管，确保所有镍珠均被转移至离心柱中。
  3. 准备 2 mL 离心管，每份样品六个（用于收集每次洗涤液）。保持离心柱外壁干燥以维持液体流速。先用 500 µL WB I 洗涤镍珠 3 次，再用 500 µL NP-PNK 洗涤 3 次。
  4. 盖紧离心柱盖子，短暂离心以去除多余缓冲液。
  5. 将柱塞盖在离心柱上，将离心柱放入 1.5 mL 离心管中，并加入 60 µL 的反应混合液（见表 2）。
组分1x7.5x
5 x PNK 缓冲液1290
碱性磷酸酶430
RNase 抑制剂215
H2O42315
终体积60 µL450 µL

表2：碱性磷酸酶反应混合液。

  1. 将珠子在 37 °C 下孵育 1 小时。
  2. 用 500 µL WB I 缓冲液洗涤珠子 1 次，以灭活碱性磷酸酶，随后用 500 µL NP-PNK 缓冲液洗涤 3 次。务必用 NP-PNK 缓冲液充分冲洗柱子内壁，以去除任何痕量的盐酸胍。

5. 将 App-PE 连接子连接到 RNA 3' 末端的磁珠上连接反应

  1. 离心去除残留缓冲液，向各柱中加入60 µL 表3 所示的混合液（App-PE序列见表4）。在25 °C下孵育反应6 h。
组分1x7.5x
5 x PNK 缓冲液1290
App-PE 接头 (100 µM)0.64.5
T4 RNA 连接酶 2 截短型 K227Q322.5
RNase 抑制剂1.511.25
50% PEG 80001290
H2O30.9231.75
终体积60 µL450 µL

表3：App-PE连接子连接反应混合物。

寡核苷酸名称序列 (5'-3')
L5AainvddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrUrArArGrCrN-OH
L5AbinvddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrArUrUrArGrCrN-OH
L5AcinvddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrGrCrGrCrArGrCrN-OH
L5AdinvddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrCrGrCrUrUrArGrCrN-OH
L5BainvddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrArGrArGrCrN-OH
L5BbinvddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrGrUrGrArGrCrN-OH
L5BcinvddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrCrArCrUrArGrCrN-OH
L5BdinvddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrUrCrUrCrUrArGrCrN-OH
L5CainvddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrCrUrArGrCrN-OH
L5CbinvddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrUrGrGrArGrCrN-OH
L5CcinvddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrArCrUrCrArGrCrN-OH
L5CdinvddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrGrArCrUrUrArGrCrN-OH
L5DainvddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrCrGrUrGrArUrN-OH
L5DbinvddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrGrCrArCrUrArN-OH
L5DcinvddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrUrArGrUrGrCrN-OH
L5DdinvddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrArUrCrArCrGrN-OH
L5EainvddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrCrArCrUrGrUrN-OH
L5EbinvddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrGrUrGrArCrArN-OH
L5EcinvddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrUrGrUrCrArCrN-OH
L5EdinvddT-ACACrGrArCrGrCrUrCrUrUrCrCrGrArUrCrUrNrNrNrArCrArGrUrGrN-OH
App_PEApp-NAGATCGGAAGAGCACACGTCTG-ddC

表4：连接至捕获RNA的5’和3’末端所需的DNA和RNA接头序列。 这些接头通过无RNase的高效液相色谱法纯化。

  1. 用 500 µL 洗涤缓冲液 I 洗涤磁珠 1 次，再用 500 µL NP-PNK 缓冲液洗涤 3 次。将柱子放入新离心管中，离心去除残留缓冲液。

6. RNA 5’末端的磁珠上磷酸化

  1. 向各柱中加入 表 5 中指定的 80 µL 混合液。在 37 °C 下孵育反应 40 分钟。
    注意：样品现在具有高度放射性。因此，所有后续操作均应在防护屏后进行，废弃物应根据当地健康与安全规定进行处理。
组分1x7.5x
5 x PNK 缓冲液16120
32P-ɣATP (10 µCi/µL)322.5
T4 PNK322.5
H2O58435
终体积80 µL600 µL

表5：磷酸化反应混合液。

  1. 加入 1 µL 的 100 mM ATP，使反应继续进行 20 分钟。这将确保几乎所有 5’ 末端都带有磷酸基团，以促进 5’ 连接子的连接。
  2. 为每个样本准备五个 2 mL 离心管。
  3. 用 500 µL WB I 缓冲液洗涤磁珠 1 次，再用 500 µL NP-PNK 缓冲液洗涤 3 次。注意：这些洗脱液具有高放射性，应妥善处理。
  4. 将柱子转移至最终收集管中，离心去除残留缓冲液。

7. 磁珠上连接5’接头

注意：5’接头包含一段用于测序后鉴定各样本的RNA条形码。因此，必须准确记录每个样本所使用的接头。

  1. 向各列中加入 78 µL 表 6 中所述的混合物。向每管中加入 2 µL 5’接头（100 µM；见表 4），并在 18 °C 下孵育过夜。
组分1x7.5x
5 x PNK缓冲液16120
ATP (10 mM)860
RNase抑制剂215
T4 RNA连接酶430
H2O48360
终体积78 µL585 µL

表6：5’接头连接反应体系。

  1. 次日，用 500 µL 洗涤缓冲液 I（WB I）洗涤磁珠 1 次，再用 500 µL 洗涤缓冲液 II（WB II）洗涤 3 次，并将柱子转移至新的 2 mL 离心管中。

8. 洗脱、SDS-PAGE 和 RNA 提取

  1. 将离心机设置为 4 °C。每个样本准备两排 1.5 mL 离心管用于洗脱。
  2. 用快速离心将含有镍珠的柱子中的空体积液体甩出。将柱子置于第一排洗脱管中，加入 200 µL 洗脱缓冲液。静置 2 分钟，然后通过快速离心将缓冲液强制穿过柱子。
  3. 将柱子转移至第二排试管，重复步骤8.2。此时每个样本总共含有400 µL洗脱液，分装于两个1.5 mL离心管中。
    1. 将所有洗脱液合并转移至一个5 mL离心管中。加入2 µL浓度为20 mg/mL的糖原。因此，若使用七个样本，此时5 mL离心管中合并的洗脱液体积为2.8 mL。
  4. 每份样品加入 100 µL 三氯乙酸（TCA）[例如 向5 mL离心管中加入7个样品的700 µL TCA（2.8 mL混合洗脱液），充分涡旋振荡30秒。
  5. 冰上孵育20分钟。
  6. 17,000 × g 离心 30 分钟 g，4 °C，台式离心机中离心。
  7. 小心地从锥形管中移去上清液，用盖革计数器检查移液管，确保沉淀物未被意外吸出。如果沉淀物已被吸出，将上清液重新返回管中，并再次离心10分钟。
    ​注意：上清液可能仍具有高放射性，务必使用适当的屏蔽防护。
  8. 将沉淀物在2 mL预冷的丙酮中完全重悬。
  9. 17,000 × g 离心 15 分钟 g，4 °C。
  10. 用 P1000 移液器尽可能吸除丙酮 尽可能彻底。随后短暂离心管子以收集乙腈小液滴，并用P10移液器移除。在通风橱中干燥2分钟。
    注意：丙酮上清液可能仍具有放射性，务必使用适当的屏蔽防护。
  11. 将样品重悬于30 µL的1×蛋白上样缓冲液中。为确保沉淀完全重悬，用P200移液器吸取溶液，并使用盖革计数器检测1.5 mL离心管中残留的放射性，以确认绝大部分放射性已转移至上样缓冲液中，而非残留在1.5 mL离心管内。
  12. 将样品在 65 °C 下加热 10 分钟。上样至 1 mm 厚、4–12% 预制 Bis-Tris 凝胶，在 MOPS 缓冲液中以 125 V 电压电泳运行 1.5 小时。
  13. 凝胶电泳结束后，打开凝胶夹心板。凝胶应保留在底板上，弃去上板。
  14. 将凝胶用保鲜膜包裹，然后用胶带固定在避光暗盒内侧。确保暗盒内装有信号增强屏以提高信号强度。
  15. 将放射自显影胶片与凝胶接触，并将暗盒置于 -80 °C 进行曝光。曝光时间将因不同交联效率的蛋白质而异。
    1. 放置胶片时，必须能够将其与暗盒重新对齐，以便在后续步骤中切出目标条带。为确保这一点，应使用荧光尺，并确保凝胶位于暗盒的一角，同时胶片也放置在最边缘的对应角落以覆盖该区域。
      注意：通常情况下，当上样缓冲液中的洗脱液在盖革计数器上显示的读数至少约为 250 cps 时，可获得足够信号进行 3 小时的曝光；否则需进行过夜曝光。
  16. 显影胶片。剪去覆盖在凝胶上的保鲜膜，但不要移动凝胶，否则图像将与凝胶位置发生偏移。
    注意：凝胶可能具有高放射性。切割凝胶条带时务必使用适当的屏蔽防护。
  17. 将薄膜覆盖在凝胶上，切下目标条带。将凝胶切片放入2 mL离心管中。
  18. 使用P1000移液器枪头捣碎凝胶切片，加入600 µL蛋白酶K缓冲液和200 µg蛋白酶K（本方案使用10 µL浓度为20 mg/mL的蛋白酶K溶液）。在55 °C下剧烈振荡孵育2小时。
  19. 随后，使用洁净的手术刀切去P1000吸头末端，将上清液和凝胶碎片转移至置于2 mL离心管中的离心柱中。
  20. 以 17,000 x g 离心柱子 1 分钟 ­g 在室温下收集流穿液，其中含有放射性标记的分离RNA。
  21. 进行苯酚：氯仿抽提。
    1. 加入50 µL 3 M乙酸钠，pH = 5.2 加入500 µL苯酚:氯仿，充分涡旋混匀。在17,000 x g下离心5分钟。 g去除上层水相，转移至新的1.5 mL离心管中。
    2. 加入 500 µL 氯仿，剧烈涡旋振荡 10–15 秒。在 17,000 x g 条件下离心 5 分钟 g 室温下移除水相，转移至新的1.5 mL离心管中。
    3. 加入1 µL 20 mg/mL糖原和1 mL预冷的96%乙醇，在-80 °C沉淀30分钟，或在-20 °C过夜沉淀。
    4. 4 °C 条件下以 17,000 x g 离心 30 分钟 g. 去除上清液，加入500 µL 70%乙醇，于4 °C以17,000 x g离心5 min g. 移除所有乙醇，短暂离心以收集残留液，并用P10移液器吸除多余液体。
    5. 在通风橱中干燥沉淀约 3 分钟。用 20 µL DEPC 处理水重悬。
  22. 将RNA在-80 °C下保存过夜，或立即进行逆转录步骤。

9. 逆转录

  1. 向20 µL RNA中加入2 µL的10 µM RT引物（PE_reverse；见表 7）和4 µL的5 mM dNTPs。
寡核苷酸名称序列 (5'-3')
P5 forwardAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
BC1CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
BC3CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
BC4CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
BC5CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
BC7CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
BC8CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAGCTTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
BC9CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
BC10CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
PE_reverseCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

表7：PCR引物（包含条形码序列）及逆转录引物。

  1. 转移至预热至 85 °C 的金属浴中孵育 3 分钟，然后立即置于冰上快速冷却 5 分钟。短暂离心收集管内液体，随后加入 8 µL 的 5× 逆转录酶缓冲液、2 µL 的 100 mM DTT 和 2 µL 的 RNase 抑制剂。
  2. 在 50 °C 下孵育混合物 3 分钟，然后加入 2 µL 逆转录酶，并在 50 °C 下继续孵育 1 小时。
  3. 在 65 °C 下孵育 15 分钟以灭活逆转录酶。
  4. 将离心管转移至预热至 37 °C 的金属浴中，静置 3 分钟以平衡温度。
  5. 加入 2 µL 的 RNase H，并在 37 °C 下孵育 30 分钟。
  6. 使用 SPRI 磁珠纯化 cDNA。
    1. 加入两倍体积（84 µL）的磁珠。混匀后孵育 15 分钟。将磁珠置于磁力架上，静置 1 分钟以吸附磁珠。
    2. 移除并弃去上清液，加入 200 µL 的 70% 乙醇。磁珠保持在磁力架上不移动。用乙醇洗涤磁珠 30 秒。
    3. 移除乙醇，并重复洗涤步骤一次。使用 P10 吸头彻底去除残留的乙醇。
    4. 将磁珠置于通风橱中干燥 2 分钟。从磁力架上取下磁珠，加入 12 µL 水重悬，再放回磁力架。小心吸取 11 µL 上清液转移至新管中。
  7. 将 cDNA 在 -20 °C 冻存，或立即进行后续 PCR 步骤。

10. qPCR 反应

  1. 在进行cDNA最终扩增的PCR之前，需先进行定量聚合酶链式反应（qPCR），以确定扩增cDNA的最佳循环次数，防止文库过度扩增。
  2. 根据表8在冰上配制qPCR反应体系。所有引物信息见表7。
组分1x
2x qPCR 反应预混液5
0.1 µM P5 引物（正向）0.8
0.1 µM BC 引物（反向）0.8
cDNA（或水作为阴性对照）1
H2O2.4
终体积10 µL

表8：qPCR反应体系。

  1. 为了准确量化扩增所需的循环次数，cDNA 应设置三个技术重复，同时设置三个阴性对照（即 水）。
  2. 用光学透明封膜密封反应板，并按照试剂盒制造商的说明运行 qPCR。
  3. 采用绝对定量方法分析样品，确定达到指数增长拐点时的循环数（n）（示例见图 4C）。该循环数将用于其余 cDNA 的最终扩增。

11. PCR 反应与凝胶回收

  1. 根据表 9在冰上配制 PCR 反应体系。所有引物信息见表 7。
    注意：仅使用 5 µL cDNA 文库。
组分1x
10 x 高保真聚合酶缓冲液5
10 µM P5 引物（正向）1
10 µM BC 引物（反向）1
5 mM dNTPs2.5
高保真聚合酶1
cDNA5
H2O34.5
终体积50 µL

表9：PCR反应体系。

  1. 按照如下条件进行PCR反应：95 °C 预变性2 min；n个循环（98 °C 变性20 s，52 °C 退火30 s，72 °C 延伸1 min）；最后72 °C 延伸5 min。扩增χCRAC文库的循环数（n）由第10节所述的qPCR结果确定。
  2. 加入1 µL外切核酸酶I，在37 °C孵育60 min。
  3. 使用SPRI磁珠纯化扩增后的cDNA，磁珠用量为两倍体积（即 100 µL），操作步骤同上。用11 µL洗脱液洗脱。
  4. 加入3 µL 6x上样缓冲液，在预浇制的6% TBE凝胶中以100 V电泳1 h，电泳缓冲液为1x TBE。使用适合定量短DNA片段的DNA分子量标准。
  5. 电泳结束后，将凝胶从胶盒中取出，放入一个合适且防漏的容器中，加入足量1x TBE缓冲液以完全覆盖凝胶（例如 约50 mL）。加入适量SYBR Safe染料（例如 对于50 mL缓冲液，加入5 µL 10,000倍稀释的染料）。
  6. 室温下轻柔振荡染色15 min。倒掉含SYBR的1x TBE缓冲液，更换为新鲜的1x TBE缓冲液，室温下轻柔振荡洗涤10 min。
  7. 倒掉1x TBE缓冲液，将凝胶放入透明文件袋中，并将文件袋裁剪至合适大小。
  8. 使用磷屏成像仪等适当方法对凝胶成像，切取大小约为175 bp至400 bp之间的DNA条带，将凝胶切片放入1.5 mL离心管中。
  9. 使用P1000吸头彻底捣碎凝胶切片，加入400 µL H2O。在恒温金属浴中37 °C振荡孵育1 h。
  10. 将样品置于干冰上冷冻10 min，然后放回37 °C恒温金属浴中振荡孵育1 h。
  11. 取一个滤柱，插入两层玻璃微纤维滤膜，制成过滤装置，并将该装置放入1.5 mL离心管中。
  12. 用洁净的手术刀切去P1000吸头末端，吸取捣碎后的TBE凝胶悬液，然后将其加入第11.12步制备的过滤装置中。在17,000 x g条件下离心30 s。
  13. 向滤出液中加入1 µL糖原、40 µL乙酸钠（pH = 5.2） 和1 mL 96%乙醇。在-80 °C孵育30 min。
  14. 在17,000 x g、4 °C条件下离心30 min。弃去上清，用500 µL 70%乙醇洗涤沉淀。
  15. 离心5 min，彻底去除乙醇，然后在通风橱中干燥沉淀3 min。
  16. 用10 µL H2O重悬DNA沉淀，并测定DNA浓度。

结果

为了验证χCRAC方法的有效性，对表达HTP标记Nrd1蛋白的酵母菌株进行了时间进程实验。方法工作原理的详细示意图见图1。与Nab3类似，Nrd1参与多种RNA转录本的核内RNA降解过程37。Corden实验室先前的研究表明，当细胞经历葡萄糖饥饿时，Nrd1与其RNA靶标的结合会发生显著变化28,38。因此，将处于含葡萄糖培养基（SD-TRP）中指数生长期的细胞转移至无葡萄糖的相同培养基（S-TRP）中，并在不同时间点监测Nrd1-RNA相互作用的动态变化。在转移前以及转移后1、2、4、8、14和20分钟，分别取样并在Vari-X-linker反应室（图3A）中进行交联。细胞培养所用培养基特意缺乏色氨酸，以减少这种芳香族氨基酸对紫外光的吸收。需要注意的是，最好使用经过滤除菌的合成培养基， 因为高压灭菌可能导致糖类发生焦糖化反应，从而 降低交联效率。

图4A 显示了一次χCRAC实验的代表性放射自显影结果。请注意，在本示例中，样品并未混合，而是分别单独上样于凝胶中。建议在初步实验测试中采用此方法，以验证在所有检测的时间点下，目标蛋白均能有效交联RNA。在预期分子量位置观察到一个特别强的信号，对应于RNA结合蛋白（RBP）与极短的放射性标记RNA结合的产物，这些RNA片段过短，不适合测序。因此，选择收集该条带上方呈弥散分布的信号，即蛋白与较长RNA片段交联的部分。切割片段时，范围包括蛋白条带上方约30 kDa的区域。图4B 显示了切除后的放射自显影图，其中与短RNA交联的蛋白仍保留在凝胶中，而原先弥散的信号已被成功切除。

逆转录完成后，必须通过 PCR 扩增 cDNA 文库。然而，必须避免文库的过度扩增，因为这可能导致聚合酶优先扩增某些序列，从而引入偏差，并产生 PCR 假象。过度扩增的文库还会包含大量重复序列，浪费测序仪的读长。为了计算最终文库扩增所需的理想 PCR 循环数，取一份 cDNA 样品，使用 P5 和 BC 寡核苷酸通过 qPCR 进行扩增。选择文库首次达到荧光峰值的循环数作为 PCR 扩增循环数。图 4C 展示了一个典型 cDNA 文库的 qPCR 结果示例，其峰值循环数为 16。该数值随后用于最终的 χCRAC PCR 扩增。为了处理测序数据，我们使用了本实验室先前开发的软件（pyCRAC）以及用于分析动力学 CRAC 数据的相应分析流程（Nues 等，2017；https://git.ecdf.ed.ac.uk/sgrannem/pycrac，https://bitbucket.org/sgrann/kinetic_crac_pipeline/src/default/）。这些开源软件工具可实现数据的解复用和修剪、去除 PCR 重复序列、识别具有统计学显著性的峰、将读段聚类为连续序列，并识别结合基序39。这些工具的具体操作细节可在其各自的网页中找到。

我们还开始开发用于哺乳动物细胞的χCRAC实验方案。大多数哺乳动物细胞系以单层形式培养，而我们交联仪中带有紫外透射袋的托盘并不适用于贴壁细胞的实验。为解决这一问题，我们设计了一个可使用户对1–2个含有贴壁细胞的培养皿（直径150 mm，深度25 mm）进行紫外照射的平台（图3B）。作为初步测试，我们通过交联并捕获稳定表达的GFP-RBM7蛋白（使用抗GFP抗体及基于传统CLIP的纯化方法），评估了该交联仪在哺乳动物细胞中的效率。如图5A所示，该交联仪在254 nm紫外照射条件下，能够以与广泛使用的紫外照射装置相当的效率，从单层培养的哺乳动物细胞中回收蛋白-RNA复合物。然而，常规用于紫外交联实验的标准细胞培养塑料器皿通常无法透过254 nm紫外光。因此，在我们的交联仪中，细胞仅能从上方的紫外灯阵列接收到照射。为克服此限制，我们开发了一种可用于细胞培养和交联的紫外透射石英培养皿。使用该石英器皿后，仅需2秒紫外照射即可实现蛋白-RNA复合物的高效回收（图5B）。当该方法与CLIP等适用于哺乳动物细胞的RNA结合蛋白（RBP）捕获技术联用时，如此短的交联时间可用于时间序列实验，以获取RBP在应对基因毒性应激、蛋白因子快速耗竭，或在转录同步化或细胞周期同步化过程中的时空RNA结合动态谱型。

图6展示了经χCRAC分析流程处理的Nrd1数据的多个示例。该图使用分析流程生成的bedgraph文件以及我们开发的Python GenomeBrowser软件包（https://pypi.org/project/GenomeBrowser/1.6.3/）制作，旨在简化生成可用于发表的高质量基因组浏览器图像。灰色矩形代表表达非编码RNA的基因组区域，例如隐秘不稳定转录本（CUTs）、稳定但未表征的转录本（SUTs）40以及Xrn1敏感的不稳定转录本（XUTs）41。图6中的数据显示，Nrd1结合了其中许多非编码RNA转录本，这与该蛋白参与此类转录本降解的观点一致42。图6A展示了IV号染色体上约15 kb的区域。在此区域，Nrd1对编码高亲和力葡萄糖转运蛋白HXT6和HXT7的转录本结合显著增强，而这两个基因在葡萄糖饥饿期间均会上调。NNS复合物介导的转录终止可能影响这些基因在葡萄糖饥饿期间的诱导动力学。图6B展示了Nrd1交联至Imd3转录本的一个示例，该转录本已知受Nab3调控43。在此情况下，数据表明在葡萄糖饥饿期间其结合显著减少。先前的研究显示 在葡萄糖饥饿期间Nab3对Tye7转录本的结合减少44。与此观察结果一致，χCRAC数据显示，在葡萄糖饥饿期间Nrd1的结合减少，且Nrd1对Tye7的交联在胁迫8分钟后达到最低水平（图4C）。然而，这种效应似乎仅为暂时性，因为在葡萄糖饥饿14分钟后，Nrd1的结合恢复至初始水平。

figure-results-1
图 1：χCRAC 实验流程的示意图。标记菌株培养至所需密度，RBP 表示 RNA 结合蛋白。随后，取一个参考样本，并用 254 nm 紫外光进行交联。剩余细胞通过过滤收集，然后迅速转移至诱导应激的培养基中。在本研究所描述的 χCRAC 实验中，在转移后 1、2、4、8、14 和 20 分钟（1）分别取样并进行交联。接着，利用高严谨性的两步亲和纯化方法纯化目标 RBP（2）。随后，将捕获的交联 RNA 部分消化，5’端进行放射性标记，并连接接头（3）。5’端接头包含独特的“测序读段内”条形码序列，以便在测序后通过生物信息学方法区分各个样本。然后将 RBP-RNA 复合物洗脱、混合并共同沉淀（4），通过 SDS-PAGE 分离，并通过放射自显影进行可视化（5）。随后，从放射自显影图像中所示红色虚线框标记的位置，切下包含放射性信号（位于主条带上方）的单一凝胶条带（5）。将凝胶条带用蛋白酶 K 处理，随后提取 RNA（6），将其反转录为 cDNA 并通过 PCR 扩增（7）。PCR 步骤中引入了额外的条形码（P7 寡核苷酸引入的黄色模块），使得多个文库可在单个测序通道中多重检测。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-2
图 2：交联与真空过滤。（A）交联装置。将细胞悬液倒入位于仪器右上方的漏斗中（另见图 3A的特写），并置于中间层托盘中的紫外光透射袋内。该袋子两侧各有一个快门，直到用户指令仪器开始照射步骤前，快门始终保持关闭状态。细胞由上下托盘中的紫外灯同时照射。仪器配备有254 nm和365 nm的紫外灯，其中后者适用于PAR-CLIP实验。仪器通过右上方的触摸屏面板操作，可设定紫外剂量或照射时间。（B）交联完成后，细胞从仪器左侧排出。通过真空抽滤收集细胞悬液，并导入玻璃烧瓶中，随后可转移至真空过滤装置进行收获。（C）真空过滤装置。该装置通过夹子开合，并在其中插入滤膜。为避免更换滤膜造成时间损失，在极短时间序列实验中并行使用了四个过滤装置。（D）过滤后，培养基上清液被排入烧瓶中以待后续处理。在真空过滤装置下方安装有阀门，以便在移除滤膜时维持系统内的真空状态。请点击此处查看本图的放大版本。

figure-results-3
图3：悬浮细胞与贴壁细胞的交联。（A）用于悬浮细胞的Vari-X-linker交联装置及其交联剂。将细胞培养物倒入位于托盘右上方的样品入口（漏斗）中。（B）可用于放置塑料或石英培养皿的托盘，适用于贴壁细胞或少量悬浮细胞的交联。请点击此处查看此图的放大版本。

figure-results-4
图4：文库制备。（A）Nrd1-HTP χCRAC 实验中的一张放射自显影图示例。强而集中的信号代表与极短RNA交联的蛋白质，其上方的弥散条带则代表与长度足以用于测序的RNA交联的蛋白质。（B）在凝胶切胶后拍摄的放射自显影图中，如图所示切取弥散条带。（C）χCRAC cDNA文库的一个代表性qPCR结果。在此例中，cDNA的扩增在16个循环时达到峰值，因此最终扩增使用16个循环。误差棒表示三次技术重复qPCR的标准化偏差。（D）6% TBE凝胶上cDNA文库的磷屏成像示例。（E）基于芯片毛细管电泳的cDNA长度与质量分析。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-5
图 5：高浓度RNase处理的iCLIP实验用于检测哺乳动物细胞中的交联效率。图中显示了GFP-RBM7 iCLIP实验的放射自显影结果，用于评估不同交联能量下核糖核蛋白（RNP）回收的效率。免疫沉淀使用与磁珠偶联的抗GFP抗体，在稳定表达GFP-RBM7的交联细胞上进行。免疫沉淀产物经高浓度RNase I孵育，以将结合的RNA剪切为短而均一的片段。RNP通过32P标记结合SDS-PAGE进行检测，表现为一条清晰的条带，迁移位置接近未交联蛋白。定量分析结果表示对放射性标记的RBM7-RNA信号进行密度测定后，归一化至抗GFP蛋白印迹信号的结果。（A）常用UVP交联仪与本研究使用的交联仪（Vari-X-linker；VxL）的交联时间梯度实验。（B）本研究交联仪在石英（左）和塑料（右）培养器皿上的交联时间梯度实验。请点击此处查看该图的放大版本。

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图6：基因组浏览器图谱示例，展示χCRAC技术揭示Nrd1对其靶标动态、时序性结合的能力。 每个方框显示单个基因组区域的图谱。箭头指示基因所在的链（向左箭头 = 负链；向右箭头 = 正链）。每个子图的y轴上标注了时间点（分钟），以t0、t1、t2等表示。图中还标出了染色体的罗马数字编号及基因组坐标。（A）在葡萄糖剥夺条件下，Nrd1结合到两个高亲和力葡萄糖转运蛋白HXT6和HXT7，这两个基因在此条件下均上调表达。（B）观察到Nrd1结合到Imd3（Nab3的一个已验证靶标44），但其结合强度在葡萄糖饥饿后逐渐降低。（C）Nrd1对Tye7的结合表现出动态且瞬时的特征：在葡萄糖饥饿后结合水平下降，并在应激8分钟后达到最低点，随后在14分钟后恢复至基础水平。测序读段经标准化处理，以“每百万读段数”（RPM；y轴）表示。灰色方框表示编码非编码RNA的区域。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

χCRAC 方法结合新型交联和细胞收集装置具有巨大潜力，因其适用于多种模式生物，故应普遍受到RNA领域的关注。χCRAC可在多个研究领域中得到应用。例如，该方法可用于测量蛋白质逐级组装形成大型大分子复合物（如剪接体和核糖体）的过程，这一过程通常涉及蛋白质与RNA分子之间的动态相互作用。目前，我们已常规使用该方法监测细胞在经历多种应激条件时，RNA降解因子与其底物之间的相互作用。这使我们能够确定这些因子在适应性应答的哪个阶段最为活跃、它们结合的底物是什么，以及这些相互作用的动态变化情况。此类数据将有助于研究人员确定各个因子在适应环境变化过程中所起的相对作用。

χCRAC 利用双亲和纯化标签（HTF 或 HTP）在高严谨性和变性条件下纯化蛋白质。这可确保共纯化的 RNA 高度富集于与目标蛋白共价交联的 RNA。然而，依赖亲和标签存在缺点。例如，标签可能干扰蛋白功能，从而导致其 RNA 结合相互作用组的检测结果产生偏差。此外，对于某些模式生物，可能无法使用标签，因为尚无可用的遗传工具将 DNA 片段整合到基因组中或转化表达质粒。然而，可以简便地修改 χCRAC 方案的某些部分，使其与基于抗体纯化 RBP 的 CLIP 类方法兼容。事实上，本研究已证明，可以将基于 iCLIP 的纯化方法与我们的交联剂相结合。目前，我们正在开发 CLIP 方案，以研究人类 RNA 结合蛋白与新生 RNA 转录本之间的时间关联性。

在对一种新蛋白进行χCRAC实验时，必须优化紫外光照射条件，以诱导最大程度的交联。这一点非常重要 ，因为过高的紫外光照射剂量会降低纯化步骤中RNA的回收率。表达重组RBP的细胞分别接受了不同剂量的紫外光照射：100 mJ/cm2、250 mJ/cm2、500 mJ/cm2 和 1 J/cm2。随后捕获核糖核蛋白复合物（RNP），对RNA进行片段化并放射性标记。之后，通过SDS-PAGE分离RNP，并进行放射自显影，以确定哪种照射剂量产生最强信号（即实现最大程度的交联）。

当实验条件优化后，在进行χCRAC时建议开展若干对照实验。首先，可使用经紫外照射且未加标签的样品来监测纯化磁珠的背景结合情况。其次，在开展转移实验（shift experiment）过程中应用χCRAC时，可通过将细胞重新转移回原始培养基中进行第二组时间序列实验，以探究细胞过滤操作本身是否会引起RNA水平或蛋白质-RNA相互作用的变化。

如引言中所述，大量近期发表的论文提出了对CLIP实验方案的多种优化措施。这包括使用荧光标记的接头，通过红外扫描检测蛋白-RNA复合物10，以及对核酸纯化和片段大小选择等步骤进行优化，以提高最终文库的复杂性12,45。我们目前正在实施其中一些改进，以进一步完善χCRAC实验流程。本文所呈现的方案已包含对原始CRAC和χCRAC方案的多项改进，可提高数据的复杂性。例如，过去在SDS-PAGE凝胶上分离交联的放射性蛋白-RNA复合物后，需将其转移至硝酸纤维素膜上，并从印迹膜中回收交联的RNA。然而，核糖核蛋白（RNP）的转移及后续RNA提取效率往往很低，尤其是在处理RNA聚合酶亚基等较大的RNA结合蛋白时。这可能导致交联RNA的回收率显著降低。在当前的方案中，交联RNA直接从SDS-PAGE凝胶切片中提取，如图1所示，从而提高了交联RNA的回收效率。此外，在cDNA的PCR扩增后，最初使用3%的低熔点琼脂糖凝胶进行产物分离，并从中回收175–300 bp的PCR片段。然而，这类凝胶容易过载，导致DNA分离效果极差。改用预制TBE凝胶后，PCR产物的片段大小分离更加稳定，回收效果也更好。

披露

A. Langford 和 W. Worboys 隶属于 UVO3 这家商业公司。他们未参与研究设计、数据收集与解释，也未参与决定是否将该工作提交发表。

致谢

本工作获得了以下资助：惠康信托基金（S.G. 获资助号 091549，S.M. 获资助号 109093/Z/15/A）、惠康信托细胞生物学中心核心资助（092076）、英国医学研究理事会非临床高级研究员奖学金（S.G. 获资助号 MR/R008205/1）、欧洲分子生物学组织长期博士后奖学金（R.A.C. 获资助号 ALTF 1070-2017）以及丹麦独立研究基金（T.H.J.）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1,4-二硫苏糖醇Merck10708984001哺乳动物细胞裂解缓冲液组分
1.5 mL 离心管Eppendorf0030 120.086通用反应管
2 mL 离心管Eppendorf0030 123.344用于放置层析柱及收集废液
32P-yATPPerkin ElmerNEG502Z-250用于RNA 5'端的放射性标记
4-12% Bis-Tris 凝胶InvitrogenNP0321BOXSDS-PAGE 凝胶
4X 上样缓冲液NovexNP0008蛋白质上样染料浓缩液
50 bp DNA 标准品New England BiolabsN3236用于从扩增的cDNA文库中切取目标区域的参照标准
50% 聚乙二醇（PEG）NEBB100045用于L5接头的连接反应
6% TBE 凝胶InvitrogenEC6265BOX用于cDNA文库的分离与纯化
丙酮ACROS Organics423245000用于TCA沉淀蛋白的洗涤
抗FLAG磁珠Sigma AldrichM8823-1ML用于纯化带有FLAG标签的RNA结合蛋白（RBPs）
ATP（100 mM）Thermo Fisher ScientificR0441用于将L5接头连接至捕获RNA的5'端
β-巯基乙醇Sigma AldrichM3148-100ML缓冲液组分
Biomax MS 增感屏Sigma AldrichZ363162-1EA用于增强放射自显影信号
氯仿Thermo Fisher Scientific1010219RNA纯化后用于苯酚-氯仿抽提
cOmplete 无EDTA蛋白酶抑制剂混合液Roche11873580001用于细胞裂解后抑制细胞内蛋白酶活性
Complete supplement mixture -TRPFormediumDCS0149用于合成定义培养基的配制
Costar Spin-X 0.22 µm 滤膜Sigma AldrichCLS8160用于凝胶提取后分离切下的cDNA片段
RQ1 DNasePromegaM6101细胞裂解后用于DNA消化
dNTPs（10 mM）Sigma Aldrich4638956001用于逆转录和PCR反应
乙醇Thermo Fisher Scientific10041814用于RNA纯化后的苯酚-氯仿抽提及DNA沉淀
乙二胺四乙酸InvitrogenAM9261用于蛋白酶K缓冲液的配制
外切核酸酶INew England BiolabsM0293用于PCR后引物的降解
玻璃微纤维滤膜Whatman1823-010用于凝胶提取后分离切下的cDNA片段
葡萄糖FormediumGLU03用于配制含葡萄糖的合成定义培养基
糖原（20 mg/mL）Roche10901393001用于蛋白质、RNA和DNA的沉淀
GST-TEV自制构建及纯化方案可应要求提供
盐酸胍Thermo Fisher Scientific10071503用于免疫沉淀的变性条件及洗涤缓冲液
IgG 磁珠GE Healthcare17-0969-01用于纯化带有蛋白A标签的RNA结合蛋白（RBPs）
咪唑Sigma AldrichI2399-100G用于从镍柱磁珠中洗脱捕获的蛋白质
异戊醇Thermo Fisher ScientificA393-500RNA纯化后用于苯酚-氯仿抽提
Luna Universal One-Step RT-qPCR 试剂盒NEBE3005S用于cDNA的qPCR检测，以确定所需PCR循环数
氯化镁Fluka Analytical63020-1L用于多核苷酸激酶（PNK）缓冲液
膜滤器Millipore酵母用AAWP09000或细菌用HAWP09000用于细胞的真空过滤
微量生物离心柱Biorad732-6204用于凝胶提取后收集洗脱液
Ni-NTA 磁珠Qiagen30210用于二次蛋白捕获
NP-40Sigma AldrichI8896-100ML缓冲液组分
Pfu 聚合酶PromegaM7741用于cDNA文库的扩增
苯酚Sigma AldrichP4682-400MLRNA纯化后用于苯酚-氯仿抽提
Pierce 离心柱Thermo Fisher Scientific69725用于柱上酶促反应
蛋白酶KRoche3115887001凝胶提取后用于降解RNA结合蛋白
石英培养皿UVO3N/A用于贴壁细胞的交联。可通过 https://www.vari-x-link.com 以400英镑购买
放射自显影胶片Amersham28906843用于放射自显影成像
RNAClean XP 磁珠BeckmannA63987SPRI磁珠，用于RNA和cDNA的纯化
核糖核酸酶HNew England BiolabsM0297逆转录后用于RNA的降解
RNase-ItAgilent400720用于RNA消化
rRNasinPromegaN2511用于抑制酶促反应中可能存在的污染性RNase
乙酸钠Sigma AldrichS2889-1KG用于RNA纯化后的苯酚-氯仿抽提及DNA沉淀
氯化钠Thermo Fisher Scientific7647-14-5缓冲液组分
脱氧胆酸钠Sigma AldrichD6750-100G哺乳动物细胞裂解缓冲液组分
十二烷基硫酸钠Sigma AldrichL3771-1KG用于蛋白酶K缓冲液
SUPERase-InInvitrogenAM2694用于细胞裂解后抑制细胞内RNase活性
SuperScript IVThermo Fisher Scientific18090010用于逆转录反应
T4 多核苷酸激酶（PNK）New England BiolabsM0201用于RNA 5'端的放射性标记
T4 RNA连接酶1New England BiolabsM0204用于将L5接头连接至RNA的5'端
T4 RNA连接酶2，截短型K222Q突变体NEBM0351S用于将App_PE接头连接至捕获RNA的3'端
TBE缓冲液（10X）Invitrogen15581-028用于TBE凝胶电泳
TEV蛋白酶自制在FLAG标签捕获后用于洗脱捕获的蛋白质
热敏感碱性磷酸酶PromegaM9910用于RNA的5'和3'端去磷酸化
三氯乙酸（100%）Sigma AldrichT0699-100ML用于沉淀RBP-RNA复合物
盐酸TrisInvitrogen15504-020缓冲液组分
吐温X-100Sigma AldrichT8787-100ML哺乳动物细胞裂解缓冲液组分
Vari FilterUVO3N/A用于真空收集细胞的装置。可通过 https://www.vari-x-link.com 以100英镑购买
Vari-X-LinkerUVO3N/A用于细胞交联的交联仪。可通过 https://www.vari-x-link.com 以16,000英镑购买
酵母氮源基础培养基FormediumCYN0410用于合成定义培养基的配制
氧化锆珠Thistle酵母用11079105Z或细菌用11079101Z用于通过珠击法进行细胞裂解

参考文献

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勘误


Formal Correction: Erratum: Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using χCRAC
Posted by JoVE Editors on 2/17/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using χCRAC. The Authors section was updated from:

Stuart W. McKellar1
Ivayla Ivanova1
Robert W. van Nues2
Ross A. Cordiner3
Will Worboys4
Andrew Langford4
Torben Heick Jensen3
Sander Granneman1
1Centre for Synthetic and Systems Biology, University of Edinburgh
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.

to:

Stuart W. McKellar1
Ivayla Ivanova1
Robert W. van Nues2
Ross A. Cordiner3
Mehak Chauhan1
Niki Christopoulou1
Will Worboys4
Andrew Langford4
Torben Heick Jensen3
Sander Granneman1
1Centre for Engineering Biology, University of Edinburgh
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.

标签

CRAC RNA Nrd1 RNA cDNA

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