子宫内电穿孔法将多靶点基因组整合彩色（MAGIC）标记递送至个体小鼠皮层星形胶质细胞

摘要

星形胶质细胞在大脑皮层中均匀分布，这使得在细胞水平上分析其复杂形态具有挑战性。本方案采用基于子宫内电穿孔的多色标记方法，以标记单个皮层星形胶质细胞，并结合用户友好的图像分析流程，对其体积和形态进行分析。

摘要

位于小鼠大脑皮层中的原浆性星形胶质细胞（PrA）在成年阶段紧密相邻，形成一个看似连续的三维网络结构。迄今为止，尚无任何免疫染色策略能够将成熟动物体内或皮层发生过程中这类细胞单独标记并实现其形态的分割。皮层PrA起源于背侧大脑皮层的前体细胞，可通过子宫内电穿孔技术将整合型载体靶向导入这些前体细胞。本文介绍了一种利用多地址基因组整合彩色标记（MAGIC Markers）策略对这些细胞进行标记的实验方案，该方法依赖于piggyBac/Tol2转座系统以及Cre/lox重组机制，可随机表达定位于特定亚细胞区域的不同荧光蛋白（蓝色、青色、黄色和红色）。这种多色命运图谱标记策略能够在胶质发生开始之前，对邻近的皮层前体细胞进行原位多色组合标记，并在单细胞水平上从胚胎期到成年期全程追踪其子代细胞，包括星形胶质细胞。通过调节电穿孔载体的浓度，可实现半稀疏标记，结合多地址基因组整合彩色标记（MAGIC Markers或MM）所提供的多种荧光对比，即使在解剖结构高度密集的情况下，也能区分单个星形胶质细胞，明确其占位范围和复杂形态。本文提供了完整的实验流程，包括电穿孔操作的具体步骤、共聚焦显微镜下多通道图像堆栈的采集，以及计算机辅助的三维形态分割方法，使研究者能够评估单个PrA的体积与形态特征。总之，MAGIC Markers的电穿孔技术为在不同发育阶段对大量星形胶质细胞进行个体化标记及其解剖学特征分析提供了一种便捷的方法。该技术将有助于在多种小鼠模型中分析皮层星形胶质细胞的形态学特性，而无需构建复杂的转基因报告基因小鼠杂交品系。

引言

星形胶质细胞在大脑发育和生理过程中发挥多种重要功能¹除了在血脑屏障中发挥调节营养物质摄取和血流的作用外，它们还积极参与突触的形成与功能，并产生能够改变神经元活动和行为的神经调节物质。²此外，星形胶质细胞功能障碍与多种神经系统疾病相关³大脑皮层中的星形胶质细胞具有复杂的形态，能够与神经元突起形成广泛接触。这些接触对于神经环路功能至关重要，同时通过细胞黏附蛋白调控星形胶质细胞的形态发生以及突触形成。⁴神经科学家需要便捷且可靠的工具来研究其感兴趣的神经系统模型中星形胶质细胞的发育与形态发生。然而，由于星形胶质细胞彼此之间紧密相邻 它们的 由于邻近细胞及其均匀的三维排列，使用免疫标记物来单独识别皮层星形胶质细胞并全面评估其形态具有挑战性。

目前，有两种主要的基因工程策略可用于在原位对皮层星形胶质细胞进行标记和个体化：转基因小鼠品系中的稀疏报告基因激活，或通过报告质粒电穿孔实现的体细胞转基因技术。第一种策略依赖于将带有loxP位点的报告小鼠品系与特异性在星形胶质细胞中表达他莫昔芬诱导型Cre重组酶（例如Aldh1l1-CreERT2⁵）的小鼠进行杂交。该策略存在若干缺点。首先，培育转基因小鼠需要大量动物，且通常需....

方案

本文所述所有动物实验均按照机构指南进行。动物实验方案已获得查尔斯·达尔文动物实验伦理委员会（CEEACD/N°5）批准。

1. 用于MAGIC Markers在体电穿孔的无内毒素质粒制备

1. 细菌转化
   1. 在冰上解冻保存于 -70 °C 的 DH5 alpha 感受态细胞。
   2. 将含有适当抗生素（100 µg/mL 氨苄青霉素或 50 µg/mL 卡那霉素）的琼脂平板在 37 °C 预热。
   3. 向 10 µL 已解冻的 DH5 alpha 感受态细胞中加入 1 µL 含 5–50 ng MAGIC Markers 质粒 DNA 的溶液，冰上孵育 10 分钟，期间不混合。
   4. 进行热激转化：将样品置于 42 °C 水浴中 45 秒，然后立即放回冰上，静置 3–5 分钟。
   5. 在无菌条件下，加入 230 µL SOC 培养基，于 37 °C 振荡孵育 1 小时。
   6. 将样品全部涂布于琼脂平板上，于 37 °C 过夜培养。
2. 质粒培养
   1. 次日早晨，在无菌条件下，从琼脂平板上挑取单克隆菌落，接种至含有 2 mL LB 培养基（含适当抗生素）的 14 mL 离心管中，于 37 °C、300 rpm 振荡培养箱中培养一天。
   2. 当天结束时，取步骤 1.2.1 中的 2 mL ....

结果

在胚胎期大脑皮层前体细胞中进行MAGIC标记物的电穿孔，可实现从大脑皮层发育早期到晚期各个阶段星形胶质细胞的标记（图1）。这些星形胶质细胞在出生后不同阶段（P4、P7、P21）广泛分布于整个大脑皮层，并存在于所有皮层层次中。通过使用20倍、0.8 NA（或更高数值孔径）物镜获取的拼接共聚焦图像，并以Z轴堆栈重建的方式进行评估（图2）。利用MAGIC标记物的组合标记方法，可对单个皮层星形胶质细胞进行区分，并获取其体积和形态学相关信息。使用商业图像分析软件，对共聚焦图像堆栈中每一层光学切片上的单个星形胶质细胞轮廓进行勾画，以分割并重建每个星形胶质细胞所占据的 territory 结构（图3）。从相同的Z轴图像堆栈中，使用开源软件对单个皮层星形胶质细胞的分支形态进行分割，从而提取星形胶质细胞主要突起的骨架结构（图4）。这些分割与追踪工具提供了对单个皮层星形胶质细胞从出生后早期到晚期其 territory 体.......

讨论

在皮质前体细胞中对 MAGIC 标记物进行子宫内电穿孔（IUE）（图 1），可在不同出生后阶段（P4-P7-P21，图 2）实现对出生后大脑皮层中星形胶质细胞的全程标记。有趣的是，IUE 的时间点并非关键因素，因为在 E13.5 至 E15.5 期间进行电穿孔，所得的皮层星形胶质细胞标记模式相似¹⁴。然而，标记的锥体神经元在皮层实质中的位置会随电穿孔时间点的不同而变化。事实上，在 E15 进行 IUE 主要标记第 2–3 层的神经元，而在 E13 进行 IUE 则可标记从第 5 层到第 2–3 层所有皮层层次中的锥体神经元^6,27。在 MM IUE 后同时标记皮层锥体神经元是该方法的主要局限性，因为在神经元标记密集的皮层层次中，神经元结构会干扰星形胶质细胞突起的识别，从而阻碍星形胶质细胞形态的半自动分割。若此问题显著，可参考 PALE 方法，在出生后阶段进.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.1 细菌转化
氨苄青霉素	Euromedex	EU0400-C
DH5 alpha 感受态细胞	Fisher Scientific	11563117
冰盒	Dutscher	139959
卡那霉素	Sigma	60615
LB 琼脂	Sigma	L2897
SOC 培养基	Fisher Scientific	11563117
无菌培养皿 - 10 cm	Thermo Fisher	150350
水浴锅	VWR	462-0556H
1.2 质粒培养
14 ml 培养管	Dutscher	187262
玻璃锥形瓶 - 2L	Fisher Scientific	11383454
LB 培养基	Sigma	L3522
1.3 质粒DNA制备
NucleoBond Xtra Maxi Plus EF	Macherey-Nagel	740426.10
2.1 溶液的配制
26 G × 1/2 针头	Terumo	8AN2613R1
30 G × 1/2 针头	Terumo	8AN3013R1
快绿	Sigma Aldrich	F7272
NaCl	VWR	27810.295
一次性聚丙烯注射器，1 mL	Dutscher	50002
2.2 手术材料的准备
Adson 镊子 - DeBakey 型 - 12.5 cm	FST	11617-12
弧形尖端镊子 - 10 cm	FST	11071-10
玻璃珠灭菌器 Steri 250	Sigma	Z378569
玻璃微量移液管，直径 1 mm	FHC	10-10-L
Graefe 镊子 - 钛合金，1 mm 尖端，微弯 - 10 cm	FST	11651-10
Graefe 镊子 - 钛合金，1 mm 尖端，直头 - 10 cm	FST	11650-10
Iris 剪刀 - 精细直头 - 9 cm	FST	14060-09
实验室胶带	Fisher Scientific	11730454
显微注射仪	INJECT+MATIC	无目录号
Olsen-Hegar 持针器 - 12 cm	FST	12002-12
光纤	VWR	631-1806
塑料涂层白纸	Distrimed	700103
Signagel 电极凝胶	Free-Med	15-60
无菌培养皿 - 35 mm	Dutscher	056714
灭菌器，玻璃干珠式，Steri 250	Sigma	Z378569
2.3 孕鼠的准备
酒精棉片	Alcomed	1731000
Buprecare	Axience	0.3 mg/ml
纱布	tRAFFIN	70189
氯胺酮	Merial	Imalgene 1000
眼用凝胶	tvm lab	Ocry-gel
RjOrl:SWISS 小鼠	Janvier Labs
Vetadine，10% 溶液	Vetoquinol	4337400113B
加热垫	Harvard Apparatus	72-0493
赛拉嗪	Bayer	Rompun 2%
3.2 电穿孔
可吸收缝线，4-0 规格，45 cm，单针，19 mm 长，3/8 圆弧，反向	Novosyn	C0068220
电穿孔仪 Sonidel	Sonidel	NEPA 21
无菌移液管（ individually wrapped）	Dutscher	043202S
带 3 mm 铂盘电极的镊子	Sonidel	CUY650P3
4.1 组织取材与切片
24 孔板	Falcon	353047
琼脂糖	Lonza	50004
Antigenfix	Microm Microtech	U/P0014
盖玻片	Dutscher	100266
Dolethal	Vetoquinol	DOL202
DPBS (10X)，无钙，无镁	Fisher Scientific	11540486
指甲油	EMS	72180
载玻片	Dutscher	100001
Vectashield	Vectorlabs	H-1000
振动切片机	Leica	VT1000S
5. 多通道共聚焦成像
20X 油镜，NA 0.85	Olympus
共聚焦激光扫描显微镜	Carl Zeiss	LSM880
共聚焦激光扫描显微镜	Olympus	FV1000
Plan Apochromat 20x/0.8 M27	Carl Zeiss
6. 星形胶质细胞区域体积分割
IMARIS 8.3 及更高版本	Bitplane
7. 星形胶质细胞分支结构追踪
三维可视化辅助分析软件套件（Vaa3D）	HHMI - Janelia Research Campus / Allen Institute for Brain Science