星形胶质细胞在大脑皮层中均匀分布，这使得在细胞水平上分析其复杂形态具有挑战性。本方案采用基于子宫内电穿孔的多色标记方法，以标记单个皮层星形胶质细胞，并结合用户友好的图像分析流程，对其体积和形态进行分析。
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方法文章
子宫内电穿孔法将多靶点基因组整合彩色（MAGIC）标记递送至个体小鼠皮层星形胶质细胞
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
位于小鼠大脑皮层中的原浆性星形胶质细胞（PrA）在成年阶段紧密相邻，形成一个看似连续的三维网络结构。迄今为止，尚无任何免疫染色策略能够将成熟动物体内或皮层发生过程中这类细胞单独标记并实现其形态的分割。皮层PrA起源于背侧大脑皮层的前体细胞，可通过子宫内电穿孔技术将整合型载体靶向导入这些前体细胞。本文介绍了一种利用多地址基因组整合彩色标记（MAGIC Markers）策略对这些细胞进行标记的实验方案，该方法依赖于piggyBac/Tol2转座系统以及Cre/lox重组机制，可随机表达定位于特定亚细胞区域的不同荧光蛋白（蓝色、青色、黄色和红色）。这种多色命运图谱标记策略能够在胶质发生开始之前，对邻近的皮层前体细胞进行原位多色组合标记，并在单细胞水平上从胚胎期到成年期全程追踪其子代细胞，包括星形胶质细胞。通过调节电穿孔载体的浓度，可实现半稀疏标记，结合多地址基因组整合彩色标记（MAGIC Markers或MM）所提供的多种荧光对比，即使在解剖结构高度密集的情况下，也能区分单个星形胶质细胞，明确其占位范围和复杂形态。本文提供了完整的实验流程，包括电穿孔操作的具体步骤、共聚焦显微镜下多通道图像堆栈的采集，以及计算机辅助的三维形态分割方法，使研究者能够评估单个PrA的体积与形态特征。总之，MAGIC Markers的电穿孔技术为在不同发育阶段对大量星形胶质细胞进行个体化标记及其解剖学特征分析提供了一种便捷的方法。该技术将有助于在多种小鼠模型中分析皮层星形胶质细胞的形态学特性，而无需构建复杂的转基因报告基因小鼠杂交品系。
引言
星形胶质细胞在大脑发育和生理过程中发挥多种重要功能1除了在血脑屏障中发挥调节营养物质摄取和血流的作用外，它们还积极参与突触的形成与功能，并产生能够改变神经元活动和行为的神经调节物质。2此外，星形胶质细胞功能障碍与多种神经系统疾病相关3大脑皮层中的星形胶质细胞具有复杂的形态，能够与神经元突起形成广泛接触。这些接触对于神经环路功能至关重要，同时通过细胞黏附蛋白调控星形胶质细胞的形态发生以及突触形成。4神经科学家需要便捷且可靠的工具来研究其感兴趣的神经系统模型中星形胶质细胞的发育与形态发生。然而，由于星形胶质细胞彼此之间紧密相邻 它们的 由于邻近细胞及其均匀的三维排列，使用免疫标记物来单独识别皮层星形胶质细胞并全面评估其形态具有挑战性。
目前，有两种主要的基因工程策略可用于在原位对皮层星形胶质细胞进行标记和个体化：转基因小鼠品系中的稀疏报告基因激活，或通过报告质粒电穿孔实现的体细胞转基因技术。第一种策略依赖于将带有loxP位点的报告小鼠品系与特异性在星形胶质细胞中表达他莫昔芬诱导型Cre重组酶（例如Aldh1l1-CreERT25）的小鼠进行杂交。该策略存在若干缺点。首先，培育转基因小鼠需要大量动物，且通常需进行多次实验以确定合适的他莫昔芬剂量，从而实现对皮层星形胶质细胞的足够稀疏标记。若要在感兴趣的遗传性小鼠模型中分析皮层星形胶质细胞表型，则需要更多的杂交步骤和更多的实验动物。此外，已知孕期注射他莫昔芬会干扰分娩过程，使得该方法难以应用于星形胶质细胞发育最早阶段的研究。体内DNA电穿孔是一种无需使用他莫昔芬的替代策略，所需动物数量最少6。该方法可在胚胎期或出生后阶段实施，操作包括将报告质粒注射至啮齿类动物的侧脑室，随后施加电脉冲，在细胞膜上形成临时孔道，从而使DNA进入脑室壁周围的前体细胞。随后，电穿孔质粒所携带的报告基因被靶细胞的分子机制处理并表达7。已有两种电穿孔方法被用于标记小鼠皮层星形胶质细胞：1）出生后电穿孔标记星形胶质细胞（PALE），该方法依赖于在出生后早期阶段电穿孔1–2个单色游离型报告质粒4；2）StarTrack策略，基于胚胎期电穿孔（IUE）多个单色整合型报告质粒8,9,10。尽管这两种技术均能有效标记原生性星形胶质细胞（PrA），但仍存在一定局限性。在其初始版本中，两种方法均使用胶质纤维酸性蛋白（GFAP）启动子驱动星形胶质细胞中的基因表达，这可能导致标记偏向于放射状胶质细胞以及表达GFAP水平高于正常静息态PrA的软脑膜和反应性星形胶质细胞11,12。就PALE而言，其他缺点还包括电穿孔时间较晚，因而无法标记早期生成的PrA（或源自早期去极化的前体细胞），也无法研究星形胶质细胞发育的早期阶段；此外，所使用的游离型载体在出生后第一周PrA经历大规模增殖过程中会因连续分裂而逐渐稀释13,14。与PALE不同，StarTrack基于胚胎期电穿孔整合型报告质粒，可追踪胚胎期和出生后前体细胞对PrA的共同贡献。一种更新的StarTrack方案采用泛素C启动子（UbC-StarTrack），可在神经前体细胞的神经元和胶质细胞谱系（包括星形胶质细胞）中实现更广泛的荧光报告基因表达15,16,17。然而，在当前版本中，该方法的实施较为复杂，因其依赖于12种不同质粒的等摩尔混合物，这些质粒表达六种荧光蛋白（FP），且其激发和发射光谱存在部分重叠。
本文介绍了一种基于子宫内电穿孔的简单多色标记方法，该方法利用由强效且广泛活性启动子驱动的整合型报告基因构建体，实现对皮层星形胶质细胞的特异性标记14此外，还提供了一个简便的图像分析流程，该流程同时使用授权软件（如 Imaris）和开源软件（Vaa3D）。18,19,20) 提供了图像分析软件，分别用于分割星形胶质细胞的领地体积和分支结构。与先前描述的方法相比，该策略仅依赖于1–2个多色整合型转基因——多通路基因组整合彩色标记物（Multiaddressable Genome-Integrating Color Markers，MAGIC Markers 或 MM）21) 定位于细胞质和（可选）细胞核区室，其表达由合成启动子驱动 CAG 由巨细胞病毒增强子、鸡β-actin启动子和兔β-珠蛋白剪接受体位点组成的启动子22这使得能够在不依赖GFAP表达的情况下，对皮层星形胶质细胞从胚胎期到晚期出生后阶段进行标记和追踪14,23每个转基因均带有以下四种不同的荧光蛋白：eBFP、mTurquoise2/mCerulean、EYFP 和 tdTomato/mCherry，这些荧光蛋白的光谱重叠极小，可通过以下方法轻松规避：1）顺序通道采集；2）优化激发光强度和信号增益；3）使用特异性二向色镜滤光片以收集狭窄的荧光蛋白发射波段。MM 策略采用 Cre/lox 通过可自我切除的Cre重组酶（seCre）介导的重组，实现细胞群体中荧光蛋白（FP）的随机表达。单个MM转基因以相互排斥的方式表达FP，而多个转基因则产生FP组合，形成数十种不同的荧光色调。转基因的基因组整合由piggyBac（PB）或Tol2转座系统驱动24,25,26因此，通过子宫内电穿孔技术，MM工具包及其产生的多色“镶嵌”标记可实现对多个相邻皮层前体细胞的同时标记，并能够长期追踪其胶质细胞谱系后代，包括皮层星形胶质细胞。不同荧光蛋白（FP）表达所产生的颜色对比，有助于清晰界定前体细胞及其后代（PrA）的轮廓，进而利用IMARIS软件提取其占据体积的关键信息，以及通过Vaa3D软件分析其复杂形态。本文详细描述的多色标记策略是一种便捷且可靠的方法，可快速、简便地获取野生型小鼠在不同发育阶段皮层星形胶质细胞的表面结构与形态特征，且无需依赖转基因报告小鼠品系，易于推广应用于各类神经疾病小鼠模型中星形胶质细胞解剖学特征的研究。
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方案
本文所述所有动物实验均按照机构指南进行。动物实验方案已获得查尔斯·达尔文动物实验伦理委员会（CEEACD/N°5）批准。
1. 用于MAGIC Markers在体电穿孔的无内毒素质粒制备
- 细菌转化
- 在冰上解冻保存于 -70 °C 的 DH5 alpha 感受态细胞。
- 将含有适当抗生素（100 µg/mL 氨苄青霉素或 50 µg/mL 卡那霉素）的琼脂平板在 37 °C 预热。
- 向 10 µL 已解冻的 DH5 alpha 感受态细胞中加入 1 µL 含 5–50 ng MAGIC Markers 质粒 DNA 的溶液，冰上孵育 10 分钟，期间不混合。
- 进行热激转化：将样品置于 42 °C 水浴中 45 秒，然后立即放回冰上，静置 3–5 分钟。
- 在无菌条件下，加入 230 µL SOC 培养基，于 37 °C 振荡孵育 1 小时。
- 将样品全部涂布于琼脂平板上，于 37 °C 过夜培养。
- 质粒培养
- 次日早晨，在无菌条件下，从琼脂平板上挑取单克隆菌落，接种至含有 2 mL LB 培养基（含适当抗生素）的 14 mL 离心管中，于 37 °C、300 rpm 振荡培养箱中培养一天。
- 当天结束时，取步骤 1.2.1 中的 2 mL 起始培养物接种至含抗生素的 300 mL LB 培养基中，于 37 °C、300 rpm 振荡培养箱中过夜培养。
- 质粒 DNA 制备
- 次日早晨，使用无内毒素大提试剂盒，按照生产商说明书纯化 MAGIC Markers 质粒 DNA（即 PB-CAG-Cytbow 和 Tol2-CAG-Nucbow，以及由 CAG 启动子驱动的表达 PB 和 Tol2 转座酶及 Cre 重组酶的质粒）。
- 用 200 µL 无菌水洗脱 DNA，并使用分光光度计测定其浓度，随后于 -20 °C 保存。
2. 体内电穿孔MAGIC标记物（MM IUE）的制备
- 溶液配制
- 将 30 mL 0.9% 生理盐水溶液在 37 °C 水浴中预热，并在整个手术过程中保持温热。
- 配制含有 PB-CAG-Cytbow 和 Tol2-CAG-Nucbow（终浓度均为 0.8 µg/µL）、PB 和 Tol2 转座酶（终浓度均为 0.4 µg/µL）、CAG-seCre（终浓度 0.16 µg/µL）以及 0.01% 快绿染料的质粒混合液，溶剂为不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS。
注：为实现星形胶质细胞的解剖学重建，可省略 Tol2-CAG-Nucbow 构建体。然而，该质粒有助于区分紧密相邻的星形胶质细胞双联体，以及在使用 MAGIC Markers 探测星形胶质细胞间克隆关系时具有重要作用14。 - 配制麻醉溶液：将 100 µL 氯胺酮（100 mg/mL）和 100 µL 赛拉嗪（20 mg/mL）溶于 2 mL 生理盐水中。
- 将 0.3 mg/mL 的丁丙诺啡储备液用生理盐水按 1:10 稀释，配制镇痛溶液。
- 手术材料准备
- 使用高温玻璃珠灭菌器或等效设备对手术器械（见材料表）进行灭菌。
- 在 35 mm 培养皿中滴加一滴电极胶。
- 将微移液管插入微注射仪支架中，轻折其尖端，并吸取 DNA 溶液。
- 在 3 cm 培养皿盖内滴加 1 µL 0.01% 快绿溶液作为参考，使用精细镊子轻折微移液管尖端以调节其直径，使微注射仪产生的液滴体积与参考液滴相当，从而确保每次注射可递送约 1 µL 的 DNA 溶液。
- 妊娠雌鼠准备
- 称量 RjOrl:SWISS 妊娠小鼠的体重。
- 按每克体重 12.5 µL 的剂量进行腹腔注射麻醉溶液。等待 5 分钟后，通过轻捏脚趾确认小鼠是否进入睡眠状态。
- 当动物对捏压无反应时，按每克体重 1.6 µL 的剂量皮下注射镇痛溶液。
- 在每只眼睛上滴加一滴眼用凝胶，防止手术期间角膜干燥，并将动物仰卧置于加热垫上。
- 轻柔剃除腹部毛发，使用浸有碘伏的棉垫清洁皮肤，再用酒精棉片对剃毛区域进行消毒。
- 在已剃毛、清洁并消毒的区域周围放置无菌纱布，建立无菌手术区域。
3. 体内电穿孔（IUE）
- 脑室内注射
- 从腹部下端开始，沿中线切开一道长约2 cm的纵向切口，依次切开皮肤及下方肌肉。通过轻柔移动胚胎囊暴露子宫角，观察宫颈位置，并计数宫颈两侧的胚胎囊数量。
- 调整待电穿孔E15.5胚胎的大脑方向，以便观察前囟点 ，该位置易于识别，因其与沿大脑裂走行的三条主要血管交汇处一致。
- 在前囟点（透过颅骨可见）与眼睛之间假想一条连线；将微移液管插入该假想线与大脑纵裂之间，踩下注射器脚踏开关，向目标半球的侧脑室注入1 µL DNA溶液。
注：若注射位置正确，充满DNA溶液的侧脑室会呈现蓝色，表明已成功注入。
- 电穿孔
- 将电极（见材料表）预先浸入电极凝胶后，置于注射后胚胎的两侧，阳极覆盖注射半球。踩下电穿孔仪脚踏开关，施加四次50 ms的35 V脉冲，每次间隔950 ms。
- 用预温的生理盐水润湿胚胎。
注：整个手术过程中应持续用预温生理盐水保持胚胎湿润，防止子宫干燥。 - 对每个胚胎重复步骤3.1.2–3.2.2。
- 完成所有目标胚胎的电穿孔后，用镊子轻柔地将子宫角推回腹腔原位。缝合期间向腹腔内注入预温生理盐水，防止子宫干燥。
- 先用连续可吸收缝线闭合腹肌，再用4-0缝线进行约10针间断缝合关闭皮肤。
- 将动物放入清洁笼中，侧卧于干净纸巾上，每5–10分钟翻转至另一侧，直至其自主活动并苏醒。
- 术后次日评估动物状态，尤其观察是否筑巢。
注：无需术后特殊处理。若未筑巢，且出现疼痛迹象（如精神萎靡、毛发蓬乱）和/或严重出血，应立即实施安乐死。
4. 组织收获与切片
- 组织采集
- 在预定的取材时间，通过腹腔注射戊巴比妥钠（100 mg/kg 体重）进行终末麻醉。本实验中，取材时间分别为出生后（P）第 P4、P7 和 P21 天。
- 使用预冷的基于多聚甲醛的溶液进行心脏灌注。
- 取出脑组织，并在基于多聚甲醛的溶液中于 4 °C 下固定过夜。
- 组织学
- 次日早晨，用 1× PBS 漂洗脑组织，每次 10 分钟，共漂洗 3 次。
- 将脑组织包埋于溶解在 1× PBS 中的 3% 琼脂糖中。
- 使用振动切片机切割成 80 µm 的切片。
- 将切片收集至预先加入 1× PBS 的 24 孔板中。
- 将切片置于载玻片与盖玻片之间的封片剂（见材料表）中封片。为最佳保存荧光蛋白并实现长期储存，将封好的载玻片保存于 -20 °C。
5. 多通道共聚焦成像
- 显微镜设置
- 配置共聚焦显微镜，分别使用 440 nm、515 nm 和 559 nm 激光线激发 mCerulean/mTurquoise2、EYFP 和 tdTomato/mCherry。
- 使用 20× 0.8 数值孔径（NA）或更高数值孔径的物镜，并根据奈奎斯特（Nyquist）标准调整 XY 采样和 Z 轴步长。
注意：使用更高分辨率（例如 60× 1.4 NA 油镜）成像并结合去卷积算法，可实现星形胶质细胞树突更精细结构的重建。然而，实验人员应意识到，传统的光学成像可能无法分辨最细微的星形胶质细胞突起。
- 图像采集
- 在电穿孔区域中找到最亮的星形胶质细胞。
- 由于靠近表面的标记细胞可能比切片深层的细胞更亮，因此应在表面细胞上调整采集参数，以避免图像饱和。
- 对三个通道分别调整采集参数，同时使用 HiLo 查找表（LUT）确保避免像素饱和，该查找表将零值显示为蓝色，最大像素值显示为红色。
注意：一张适当平衡的图像应仅显示少量蓝色像素，几乎不出现红色像素。 - 利用显微镜的电动载物台，采集 1,024 × 1,024 像素的拼接 Z 层图像序列（Z-stacks），相邻图像之间重叠 10%，以便后续对电穿孔区域或感兴趣区域进行马赛克重建。
6. 星形胶质细胞区域体积分割
注意：此步骤使用商业软件程序完成（例如，IMARIS）。
- 数据集的准备
- 通过选择完全包含在成像组织切片内的标记星形胶质细胞，在三维重建图像（250 × 250 像素）中裁剪出目标细胞。
注意：如果计算机性能允许，也可直接处理更大的数据体积。 - 在 Surpass 视图的 Object 工具栏中点击 Blue Surface 按钮，为每个星形胶质细胞创建一个新的 Surface。
- 为获得更好的可视化对比度，首先通过点击 Edit | Show Display Adjustment 选项并拖动滑块，调整颜色对比度的最小值和最大值。如有需要，可在 Display Adjustment 窗口中直接点击通道名称，更改通道颜色以选择新的显示颜色。
注意：为避免视觉偏差，建议始终使用相同的颜色显示方案。 - 点击 Edit | Image Properties，手动输入体素尺寸（单位为微米）。若体素尺寸不准确，将导致体积计算结果错误。
- 保存新设置。
- 通过选择完全包含在成像组织切片内的标记星形胶质细胞，在三维重建图像（250 × 250 像素）中裁剪出目标细胞。
- 表面分割
- 使用 Blue Icon 添加一个表面。此时在 Scene 列表中会出现一个 Surface 图标和对应框体。Volume 框体可用于显示或隐藏数据集。
- 选中表面行，点击 Skip Automatic Creation | Edit Manually。
- 点击 Contour | Visibility，然后选择 None。接着切换到 Select 视图，点击 Draw 按钮。
- 点击 Mode 以选择绘图模式。
- 使用快速高效的 Isoline 半自动绘图工具。通过移动鼠标指针沿细胞轮廓进行定义。若 isoline 预览未能准确匹配星形胶质细胞轮廓，请调整鼠标指针位置。通过左键单击确认预览结果。如需修正可能的错误，可在 Board 窗口中删除当前 Z 平面的轮廓，或按 Ctrl + Z 撤销操作。
- 使用 Slice | Position 在 Z 平面间导航，通过更改 Z 平面编号进入下一个平面，并开始绘制新的轮廓。建议优先从细胞中部开始，再逐步向两端延伸。
- 当包含星形胶质细胞的所有 Z 平面均完成轮廓绘制后，点击 Create Surface。在创建表面之前，需检查所有组件是否已连接。若未连接，请选择最大组件或将相关部分连接后再导出体积数据。
- 检查 Data Panel 中显示的定量数据，并以电子表格格式导出统计结果，保存体积数值及其单位。
- 将表面另存为新名称，以便后续访问。
7. 星形胶质细胞分支的示踪
注意：此步骤使用开源软件程序 Vaa3D 完成。
- 数据集的准备
- 加载图像堆栈，并寻找孤立的星形胶质细胞或颜色分明的邻近星形胶质细胞。
注意：可通过提高物镜的数值孔径（NA）和采样率来改善重建分辨率。然而，由于共聚焦显微镜的分辨率限制，最细小的星形胶质细胞突起无法被准确追踪。应避免对超出所获取图像分辨率的结构进行过度分割。 - 使用 Fiji，在每个星形胶质细胞周围裁剪出 250 × 250 像素的图像堆栈。
- 由于 Vaa3D 追踪仅针对单一颜色通道进行，请选择一个通道并关闭其他通道。
- 将图像转换为 RGB 模式，并以 .tiff 格式保存。
- 加载图像堆栈，并寻找孤立的星形胶质细胞或颜色分明的邻近星形胶质细胞。
- 树突状结构追踪
- 在 Vaa3D 中打开 RGB 图像。进入 Image | Data | Geometry，然后选择 image resampling，并调整 X/Y 和 Z 方向的体素大小。
注意：在重建星形胶质细胞树突结构时，应注意不要追踪超出图像分辨率所能支持的细节。 - 点击 Visualize | 3D viewer for the entire image 打开一个 3D 窗口。在 3D 图像上右键单击，选择 1-right-click to define marker。将光标指向星形胶质细胞的中心，然后右键单击以设置标记。
注意：点击 Escape 键可重新访问 3D 视图。 - 进入 Advanced | 3D tracing | Vaa3D-Neuron2-auto-tracing。
- 在新打开的窗口中，选择要应用插件的通道。
- 选择一个背景阈值（通常在 30 至 90 之间）。如有需要，针对每个星形胶质细胞调整该值。
- 取消勾选 2D 下的 Radius，并保持 Auto-down sample 和 auto-resample 处于勾选状态。
- 将 cnn_type 设为 3，length_thresh 设为 1，SR_ratio 设为 0.1。
- 点击 ok 后，确认插件是否基于原始文件名自动生成两个文件。文件名将分别添加后缀 –ini.swc 和 -coordinateX–coordinateY-coordinateZ-app2.swc。请手动为这些文件添加独特的标签，以免在继续运行插件时覆盖已有文件。
- 打开 Object Manager，进入 Neuron | Line structure，选中已追踪的星形胶质细胞，点击 Display Mode，并选择 Always line mode。
- 返回 3D 窗口，此时将显示星形胶质细胞的骨架结构。
注意：如果分割结果与信号不匹配，请重复步骤 7.2.3–7.2.10，并调整阈值直至匹配。务必重新输入其他参数，因为重启插件后这些参数会被重置。 - 右键单击 skeleton，首先选择 neuron | line#1…APP2_Tracing，以访问将在新窗口 Surface| Object Annotation 中显示的定量测量数据。
注意：由于光学显微镜分辨率有限，Number of branches（分支数量）和 Number of bifurcations（分叉数量）等项目下显示的测量值仅能粗略估计星形胶质细胞树突结构的复杂程度。
- 在 Vaa3D 中打开 RGB 图像。进入 Image | Data | Geometry，然后选择 image resampling，并调整 X/Y 和 Z 方向的体素大小。
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结果
在胚胎期大脑皮层前体细胞中进行MAGIC标记物的电穿孔，可实现从大脑皮层发育早期到晚期各个阶段星形胶质细胞的标记（图1）。这些星形胶质细胞在出生后不同阶段（P4、P7、P21）广泛分布于整个大脑皮层，并存在于所有皮层层次中。通过使用20倍、0.8 NA（或更高数值孔径）物镜获取的拼接共聚焦图像，并以Z轴堆栈重建的方式进行评估（图2）。利用MAGIC标记物的组合标记方法，可对单个皮层星形胶质细胞进行区分，并获取其体积和形态学相关信息。使用商业图像分析软件，对共聚焦图像堆栈中每一层光学切片上的单个星形胶质细胞轮廓进行勾画，以分割并重建每个星形胶质细胞所占据的 territory 结构（图3）。从相同的Z轴图像堆栈中，使用开源软件对单个皮层星形胶质细胞的分支形态进行分割，从而提取星形胶质细胞主要突起的骨架结构（图4）。这些分割与追踪工具提供了对单个皮层星形胶质细胞从出生后早期到晚期其 territory 体...
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讨论
在皮质前体细胞中对 MAGIC 标记物进行子宫内电穿孔（IUE）（图 1），可在不同出生后阶段（P4-P7-P21，图 2）实现对出生后大脑皮层中星形胶质细胞的全程标记。有趣的是，IUE 的时间点并非关键因素，因为在 E13.5 至 E15.5 期间进行电穿孔，所得的皮层星形胶质细胞标记模式相似14。然而，标记的锥体神经元在皮层实质中的位置会随电穿孔时间点的不同而变化。事实上，在 E15 进行 IUE 主要标记第 2–3 层的神经元，而在 E13 进行 IUE 则可标记从第 5 层到第 2–3 层所有皮层层次中的锥体神经元6,27。在 MM IUE 后同时标记皮层锥体神经元是该方法的主要局限性，因为在神经元标记密集的皮层层次中，神经元结构会干扰星形胶质细胞突起的识别，从而阻碍星形胶质细胞形态的半自动分割。若此问题显著，可参考 PALE 方法，在出生后阶段进...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢S. Fouquet以及巴黎视觉研究所和蒙彼利埃神经科学研究所（MRI和RAM）的影像与动物实验中心设施提供的技术支持。本研究得到了法兰西岛大区和法国癌症研究ARC基金会向S.C.提供的博士后奖学金，以及巴黎-萨克雷大学（跨学科博士倡议项目）向L.A.提供的资助；E.H.的研究由欧洲研究理事会（ERC-SG 336331，项目负责人J. Valette）资助；同时获得法国国家科研署（ANR）合同编号ANR-10-LABX-65（LabEx LifeSenses）、ANR-11-EQPX-0029（Equipex Morphoscope2）、ANR-10-INBS-04（France BioImaging）的经费支持；还获得了法国医学研究基金会（参考编号DBI20141231328）、欧洲研究理事会（ERC-CoG 649117，项目负责人J. Livet）以及ATIP-Avenir计划（项目负责人K. Loulier）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.1 细菌转化 | |||
| 氨苄青霉素 | Euromedex | EU0400-C | |
| DH5 alpha 感受态细胞 | Fisher Scientific | 11563117 | |
| 冰盒 | Dutscher | 139959 | |
| 卡那霉素 | Sigma | 60615 | |
| LB 琼脂 | Sigma | L2897 | |
| SOC 培养基 | Fisher Scientific | 11563117 | |
| 无菌培养皿 - 10 cm | Thermo Fisher | 150350 | |
| 水浴锅 | VWR | 462-0556H | |
| 1.2 质粒培养 | |||
| 14 ml 培养管 | Dutscher | 187262 | |
| 玻璃锥形瓶 - 2L | Fisher Scientific | 11383454 | |
| LB 培养基 | Sigma | L3522 | |
| 1.3 质粒DNA制备 | |||
| NucleoBond Xtra Maxi Plus EF | Macherey-Nagel | 740426.10 | |
| 2.1 溶液的配制 | |||
| 26 G × 1/2 针头 | Terumo | 8AN2613R1 | |
| 30 G × 1/2 针头 | Terumo | 8AN3013R1 | |
| 快绿 | Sigma Aldrich | F7272 | |
| NaCl | VWR | 27810.295 | |
| 一次性聚丙烯注射器，1 mL | Dutscher | 50002 | |
| 2.2 手术材料的准备 | |||
| Adson 镊子 - DeBakey 型 - 12.5 cm | FST | 11617-12 | |
| 弧形尖端镊子 - 10 cm | FST | 11071-10 | |
| 玻璃珠灭菌器 Steri 250 | Sigma | Z378569 | |
| 玻璃微量移液管，直径 1 mm | FHC | 10-10-L | |
| Graefe 镊子 - 钛合金，1 mm 尖端，微弯 - 10 cm | FST | 11651-10 | |
| Graefe 镊子 - 钛合金，1 mm 尖端，直头 - 10 cm | FST | 11650-10 | |
| Iris 剪刀 - 精细直头 - 9 cm | FST | 14060-09 | |
| 实验室胶带 | Fisher Scientific | 11730454 | |
| 显微注射仪 | INJECT+MATIC | 无目录号 | |
| Olsen-Hegar 持针器 - 12 cm | FST | 12002-12 | |
| 光纤 | VWR | 631-1806 | |
| 塑料涂层白纸 | Distrimed | 700103 | |
| Signagel 电极凝胶 | Free-Med | 15-60 | |
| 无菌培养皿 - 35 mm | Dutscher | 056714 | |
| 灭菌器，玻璃干珠式，Steri 250 | Sigma | Z378569 | |
| 2.3 孕鼠的准备 | |||
| 酒精棉片 | Alcomed | 1731000 | |
| Buprecare | Axience | 0.3 mg/ml | |
| 纱布 | tRAFFIN | 70189 | |
| 氯胺酮 | Merial | Imalgene 1000 | |
| 眼用凝胶 | tvm lab | Ocry-gel | |
| RjOrl:SWISS 小鼠 | Janvier Labs | ||
| Vetadine，10% 溶液 | Vetoquinol | 4337400113B | |
| 加热垫 | Harvard Apparatus | 72-0493 | |
| 赛拉嗪 | Bayer | Rompun 2% | |
| 3.2 电穿孔 | |||
| 可吸收缝线，4-0 规格，45 cm，单针，19 mm 长，3/8 圆弧，反向 | Novosyn | C0068220 | |
| 电穿孔仪 Sonidel | Sonidel | NEPA 21 | |
| 无菌移液管（ individually wrapped） | Dutscher | 043202S | |
| 带 3 mm 铂盘电极的镊子 | Sonidel | CUY650P3 | |
| 4.1 组织取材与切片 | |||
| 24 孔板 | Falcon | 353047 | |
| 琼脂糖 | Lonza | 50004 | |
| Antigenfix | Microm Microtech | U/P0014 | |
| 盖玻片 | Dutscher | 100266 | |
| Dolethal | Vetoquinol | DOL202 | |
| DPBS (10X)，无钙，无镁 | Fisher Scientific | 11540486 | |
| 指甲油 | EMS | 72180 | |
| 载玻片 | Dutscher | 100001 | |
| Vectashield | Vectorlabs | H-1000 | |
| 振动切片机 | Leica | VT1000S | |
| 5. 多通道共聚焦成像 | |||
| 20X 油镜，NA 0.85 | Olympus | ||
| 共聚焦激光扫描显微镜 | Carl Zeiss | LSM880 | |
| 共聚焦激光扫描显微镜 | Olympus | FV1000 | |
| Plan Apochromat 20x/0.8 M27 | Carl Zeiss | ||
| 6. 星形胶质细胞区域体积分割 | |||
| IMARIS 8.3 及更高版本 | Bitplane | ||
| 7. 星形胶质细胞分支结构追踪 | |||
| 三维可视化辅助分析软件套件（Vaa3D） | HHMI - Janelia Research Campus / Allen Institute for Brain Science |
参考文献
- Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nature Reviews Neuroscience. 14 (5), 311-321 (2013).
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- Blanco-Suárez, E., Caldwell, A. L. M., Allen, N. J. Role of astrocyte-synapse interactions in CNS disorders: Astrocyte-synapse disease. The Journal of Physiology. 595 (6), 1903-1916 (2017).
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