本方案提供了一种在小鼠中分析动脉粥样硬化负荷的逐步操作流程。研究人员可利用本方案比较不同动物中动脉粥样硬化病变的数量、位置和大小。
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摘要
摘要
载脂蛋白 E (Apoe)- 或低密度脂蛋白受体（Ldlr缺乏载脂蛋白E（ApoE）或低密度脂蛋白受体（LDLR）的高脂血症小鼠是动脉粥样硬化研究中最常用的两种模型。它们被用于研究多种遗传因素和不同细胞类型对动脉粥样硬化病变形成的影响，并用于测试新疗法的开发。分离， 切除 整个 主动脉， 油红O染色动脉粥样硬化病变的定性和定量分析是常用的形态计量学方法，用于 评估 动脉粥样硬化负荷。本方案的目的是进行描述 一种优化的逐步手术方法，用于解剖、灌注固定、分离、染色、成像及分析小鼠主动脉中脂质沉积斑块的动脉粥样硬化病变，采用油红O染色。因为 a动脉粥样硬化病变可发生于整个主动脉树的任何部位，该全主动脉油红O染色方法的优势在于可于单只小鼠中对整个主动脉及其所有分支中的脂质沉积斑块进行全面评估。除油红O染色外，新鲜分离的全主动脉还可用于多种体外和体内实验以及细胞分离。
引言
冠心病是美国主要的死亡原因之一，通常由动脉粥样硬化引起，该过程会导致动脉壁内斑块积聚1。易发生高脂血症的 Apoe- 和 Ldlr- 缺陷型小鼠在动脉粥样硬化的研究及其并发症和治疗方法的开发中具有核心地位2，3，4，5。通过主动脉展平标本对动脉粥样硬化病变进行定量分析，是评估不同细胞类型中基因操作影响的重要终点指标。该方法也有助于研究旨在影响动脉粥样硬化疾病起始、进展和消退的新型疗法。动脉粥样硬化病变可出现在主动脉及其分支的任何部位（例如胸部的头臂动脉、颈动脉和锁骨下动脉，以及膈肌以下的肾动脉、髂总动脉和股动脉）6。对动脉粥样硬化负荷进行全面评估并制定恰当治疗策略，需要对不同解剖部位的疾病负荷进行评估，而这一挑战常被忽视。
本方案描述了如何对单只小鼠的动脉粥样硬化病变进行系统性分析，起始于未剖开的完整主动脉，继而进行内膜面制备。对未剖开的完整主动脉进行油红O染色，可快速定性评估整个主动脉及其分支中富含脂质的斑块；而内膜面制备则可对小鼠主动脉中动脉粥样硬化病变的分布情况进行定量评估。
该技术使用8周龄的小鼠，其具有平滑肌细胞特异性的TGFβR2基因敲除，并处于Apoe-/-高脂血症背景（MYH11-CreERT2;Tgfbr2f/f;mT/mGf/f;Apoe-/-；下文简称为TGFβR2iSMC-Apoe小鼠），同时以同窝出生的Apoe-/-小鼠作为对照（MYH11-CreERT2;mT/mGf/f;Apoe-/-；下文简称为Apoe-/-小鼠）。动物在高胆固醇 高脂饮食（HCHFD）下饲养16周，作为研究材料7。在实验结束时，完整未切开的主动脉（包括所有主要分支）用油红O染色并成像，以定性评估富含脂质的斑块。通过展平制备法将主动脉切开，对所有动脉粥样硬化病变进行成像和定量分析。本方案可用于研究Apoe-/-或Ldlr-/-高脂血症小鼠模型中的动脉粥样硬化病变发展，并可拓展至一般的主动脉相关血管生物学应用。
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方案
mT/mG（货号 007676）和 Apoe-/-（货号 002052）小鼠购自杰克逊实验室。Myh11-CreERT2 小鼠由 Stefan Offermanns 惠赠（可在杰克逊实验室以货号 019079 获得）。Tgfbr2fl/fl 小鼠由范德堡大学 Harold L. Moses 提供。所有动物实验均依照耶鲁大学机构动物护理和使用委员会批准的方案进行。
1. 小鼠
- 生成 MYH11-CreERT2;mT/mGf/f;ApoE-/- 和 MYH11-CreERT2Tgfbr2f/f;mT/mGf/f;Apoe-/- 小鼠，如先前所述7. 将突变品系回交至C57BL/6J背景十代以上 代际
注意：Myh11-CreERT2 Cre 小鼠品系为研究血管稳态和血管病理过程中平滑肌细胞的作用提供了强有力的工具。Cre 等位基因插入于 Y 染色体上，因此雌性小鼠不表达该构建体。
2. 小鼠基因分型、他莫昔芬诱导及高胆固醇高脂饮食喂养
- 使用小鼠耳部DNA和PCR分析进行小鼠基因分型。应按照制造商说明书，使用血液和组织DNA提取试剂盒（材料表）分离小鼠耳部DNA。PCR引物列于表1中。
- 通过腹腔注射他莫昔芬（1 mg/天，连续5天）诱导6周龄的MYH11-CreERT2;mT/mGf/f;Apoe-/-和MYH11-CreERT2;Tgfbr2f/f;mT/mGf/f;Apoe-/-雄性小鼠发生Cre-Lox重组。
- 将8周龄雄性小鼠（他莫昔芬处理后2周）置于高胆固醇高脂肪饮食（HCHF饮食 ，40% kcal脂肪，1.25%胆固醇，0%胆酸）中饲养16周，以诱导动脉粥样硬化。
3. 试剂与解剖工具的准备
- 储备油红O溶液的配制：将1 g油红O溶解于100 mL异丙醇中。
- 工作用油红O溶液的配制：将24 mL储备油红O溶液与16 mL去离子水混合2O. 使用0.45 μm无菌注射器滤器过滤稀释的Oil Red O溶液（该溶液仅在1–2 h内有效）。
- 60% 异丙醇溶液配制：将 60 mL 异丙醇与 40 mL dH₂O 混合2O.
- 4% 甲醛在1x DPBS中的配制：将10 mL 16%甲醛与30 mL 1x DPBS混合稀释。
- 用70%乙醇清洁所有解剖工具（图1).
4. 安乐死（图2A）
- 在处死小鼠前称量其体重。
- 通过腹腔注射氯胺酮和赛拉嗪处死小鼠（每毫升含10 mg/mL氯胺酮和2 mg/mL赛拉嗪）。
- 将小鼠置于仰卧位（腹部朝上）。
5. 打开胸腔和腹腔并进行心脏灌注（图2B）
- 用10 mL注射器吸取10 mL的1×DPBS，接上25 G针头并戴上针帽。该注射器将用于灌注心脏。
- 用镊子（Style 5）提起皮肤，使用精细剪刀从腹部基部向上剪至颈部顶端。
- 切开肋骨下方的腹壁。
- 用镊子（Style 5）提起胸骨，剪断膈肌，随后剪除肋骨以暴露胸腔。
- 在心脏右心房处做一个小切口。
- 通过心尖部左心室穿刺，缓慢注入10 mL的1×DPBS进行灌注。充分灌注后，肝脏和肾脏颜色变为浅棕色。
- 使用无纺布海绵吸收多余血液和液体，清洁胸腔。
6. 主动脉及其分支的分离（图2C）
- 使用镊子（Style 5）和精细剪刀去除器官（即肺、肝、脾以及胃肠道和生殖器官），并剪断锁骨，同时保持心脏、肾脏和主动脉原位完整。
注意：务必避免撕裂心脏或任何主要血管。 - 将小鼠置于体视显微镜下。
- 使用镊子（Style 4）和弹簧剪刀解剖主动脉及其分支，包括无名动脉、颈动脉、锁骨下动脉、肾动脉、髂总动脉和股动脉。
注意：在解剖主动脉分支时，应用湿润的无纺布海绵覆盖主动脉，以防脱水。 - 使用镊子（Style 4）和弹簧剪刀仔细解剖并清除主动脉及主动脉分支周围的外膜脂肪和结缔组织。
注意：由于在高脂血症动脉瘤小鼠模型中炎症反应显著，去除外膜较为困难。操作时需格外小心，避免撕裂或损伤主动脉及其分支。此步骤需要熟练技巧和耐心。
7. 心脏和主动脉的固定（图2D,E）
- 准备一个10 mL注射器，装入10 mL含4%甲醛的1× DPBS溶液，并用25 G针头盖紧。
警告：甲醛具有危害性。使用该化学品前请阅读材料安全数据表（MSDS）。佩戴手套和护目镜，并在通风橱内配制稀释液。
注意：4%甲醛溶液会随时间降解。固定时应使用新鲜配制的4%甲醛溶液。 - 通过左心室心尖穿刺，缓慢注入10 mL 4%甲醛溶液以固定血管树。
注意：甲醛固定会影响多种后续应用，例如细胞培养、流式细胞术分析和单细胞RNA测序分析。若主动脉将用于上述任一应用，请跳过此步骤。 - 使用无纺布海绵清洁胸腔内的多余液体，以吸收残留物质。
- 用镊子（Style 4）夹住心脏，配合显微弹簧剪刀将心脏与主动脉分离。
注意：若计划在此步骤后进行整体Oil Red O染色，建议在原位（而非离体）切开主动脉，并直接进入第8节操作。这有助于使整体主动脉平铺展开。 - 使用镊子（Style 4）和弹簧剪刀，从颈动脉上方1 mm处至股动脉末端，分离并切除主动脉及其主要分支。
- 将血管转移至石蜡培养皿或1.5 mL微量离心管中，并加入1× DPBS至完全浸没主动脉。
注意：本方案可在此处暂停。
8. 未打开的完整主动脉的油红O染色与成像（图3）
- 使用微型图钉将血管固定在石蜡培养皿上（图3A）。
- 用1×DPBS冲洗血管一次。
- 向培养皿中倒入25 mL新鲜的油红O溶液（图3B）。
注意：（1）异丙醇为危险性易燃液体，使用时应佩戴适当的个人防护装备。（2）油红O溶液容易产生沉淀，沉淀颗粒可能干扰后续染色。使用前必须通过0.45 μm滤膜过滤以去除沉淀。（3）建议每次实验前新鲜配制油红O溶液，未用完的溶液应丢弃。（4）除油红O外，苏丹IV也是一种用于脂质、甘油三酯和脂蛋白染色的化学试剂。但油红O因染色后呈现更强烈的红色，使脂肪更易于观察，已逐渐取代苏丹IV。 - 在室温（RT）下染色60分钟。油红O可将富含脂质的斑块染成红色，而无斑块区域则呈浅色。
- 在室温下用60%异丙醇洗涤一次，持续20分钟。
注意：过度冲洗可能导致斑块褪色。 - 用dH2O冲洗主动脉3次，每次5分钟，以去除残留的异丙醇。
- 在体视显微镜下，使用镊子（Style 4）和弹簧剪刀小心清除主动脉周围的所有外膜脂肪组织（图3C,D）。
注意：染色后彻底清除主动脉及其分支周围的外膜脂肪组织至关重要，因为被油红O染色的外膜脂肪组织会产生假背景，干扰斑块形态测量和斑块面积定量。操作时注意不要损伤主动脉壁。清洁过程中应向石蜡皿中加入足够的dH2O，以完全覆盖染色后的主动脉。此步骤需要练习和耐心。 - 将血管转移至洁净的玻璃载玻片上。
- 使用连接在光学显微镜上的相机采集数字显微图像。保存高分辨率图像，建议采用TIFF（标签图像文件格式）（图3E）。
注意：此处可暂停实验流程。为防止主动脉干燥，可将血管转移至1.5 mL微量离心管中，并加入1×DPBS浸没组织，于4 °C保存。
9. 主动脉内面朝上固定（图4，图5）
- 将容器转移至石蜡培养皿中，并加入 1× DPBS 至完全覆盖主动脉。
- 在分叉后 1–2 mm 处切断主动脉弓的颈总动脉、锁骨下动脉以及腹主动脉的髂动脉。切断肾动脉。（图 4A）
- 使用显微解剖弹簧剪刀沿主动脉标本的内侧弯曲线纵向剪开（图 4B1），并单独剪开髂动脉（图 4B2）。
- 使用显微解剖弹簧剪刀沿主动脉弓的三个分支（即无名动脉、左颈总动脉、左锁骨下动脉）的外侧弯曲面剪开，直至内侧弯曲面基底部（X 标记处）（图 4B3–B8）。
- 用细小图钉将主动脉平铺固定（腔面朝上）于石蜡皿中，并加入 1× DPBS 至完全覆盖主动脉，以防干燥（图 4C）。
注意：（1）应确保卷曲的主动脉充分展平，并以正面朝上方式固定，避免拉伸。此步骤所需时间取决于动脉粥样硬化严重程度，可能需要数天。（2）对于 Apoe-/- 或 Ldlr-/- 动物的主动脉，建议平铺固定 24 小时。（3）本方案可在此处暂停。 - 用 70% 乙醇和精密擦拭纸清洁玻璃载玻片（图 5A）。
- 将主动脉转移至一张洁净的玻璃载玻片上，并在另一张洁净的玻璃载玻片上滴加 15 滴最佳切割温度（OCT）包埋剂（图 5B）。
- 小心将含有 OCT 包埋剂的玻璃载玻片覆盖在主动脉上，避免在载玻片上产生气泡（图 5C）。
- 在载玻片上标记样本名称（图 5D）。
注意：贴附好的展平主动脉载玻片可在 4 °C 的保湿盒中保存数月。
10. 主动脉内表面成像及病灶定量（图6）
- 使用连接到光学显微镜的相机获取数字显微图像。保存高分辨率图像，建议采用标记图像文件格式（TIFF）图6A).
- 将染色后主动脉全层的正面图像转移至配备 ImageJ 软件的计算机中。
- 在 ImageJ 中，选择“自由手绘选择”工具，按住“Alt”键（Windows 计算机）或“Shift”键（Mac），手动圈选所有经 Oil Red O 染色的斑块（深红色斑点）。然后，在“分析”菜单中点击“测量”，在结果窗口中显示病变区域图6B 左侧。
注意：动脉粥样硬化病变定量分析存在若干潜在问题：（1）在第8.7步中可能残留附着于主动脉的少量染色外膜脂肪组织，会导致假性背景信号，干扰斑块定量；（2）在第6.4步和第8.7步中若去除部分主动脉壁或损伤主动脉，可能影响斑块定量结果；（3）在载片后（第9.8步）主动脉出现气泡或皱褶，会干扰斑块的准确测量；（4）动脉粥样硬化斑块为三维结构，而在二维平面上进行的测量可能无法真实反映斑块的实际范围。除对主动脉全长进行表面斑块面积分析外，建议分别对主动脉根部、头臂动脉、升主动脉及腹主动脉的斑块大小进行独立分析8. - 用鼠标圈选主动脉的外边界线，然后在“Analyze”菜单中点击“Measure”，以在结果窗口中显示主动脉面积（图6B 右侧
- 将所有测量数据导出至 Excel 文件。
- 计算斑块面积占总主动脉面积的比值，并将该值标准化为总油红O染色面积的百分比。
- 计算8个斑块区域的比值–10 Apoe-/- 和 8–10 TGFβR2iSMC-Apoe 小鼠。数据以均值 ± 标准误（SEM）表示（图6C).
- 对斑块面积比率数据与另一小鼠组进行比较时，采用非配对 Student’s t 检验进行统计分析。当 p < 0.05 时，认为均值间的差异具有统计学意义。 < 0.05.
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结果
在本实验方案中，TGFβR2iSMC-Apoe 小鼠在高胆固醇高脂肪饮食喂养4个月后，对其动脉粥样硬化病变进行了分析7。除了广泛的动脉粥样硬化外，这些小鼠还出现了胸腹主动脉瘤，与既往报道一致。与 Apoe-/- 小鼠相比，TGFβR2iSMC-Apoe 小鼠的主动脉壁动脉粥样硬化更为严重，导致病变组织难以分离（图2C,D,E）。此外，动脉瘤在肾上主动脉以下区域尤为广泛，与人类晚期主动脉瘤高度相似。
TGFβR2 小鼠经 HCHFD 饲喂后主动脉 Oil Red O 染色的代表性未打开图像iSMC-Apoe 小鼠如图所示 图3E图像显示了TGFβR2iSMC-Apoe 小鼠出现升主动脉和腹主动脉瘤，并在主动脉分支（此处为无名动脉、颈动脉、锁骨下动脉、髂动脉、股动脉和肾动脉）中表...
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讨论
载脂蛋白E（Apoe）和低密度脂蛋白受体（Ldlr）缺陷型小鼠是研究动脉粥样硬化发生与治疗的有用模型。研究人员可通过主动脉全长油红O染色，评估遗传因素和治疗干预对动脉粥样硬化相关疾病起始、进展及消退的影响9。主动脉油红O染色及病变定量分析是动脉粥样硬化研究的金标准终点指标。该技术成本低廉，且无需特殊设备10。然而，获得高质量的油红O染色组织并不容易。根据以往经验，本实验方案中有三个关键步骤，整个操作过程需要反复练习和足够的耐心。第一个关键步骤是在油红O染色前后，能够完整解剖、取出并彻底清除主动脉及其分支周围的全部血管周围脂肪组织（图2D，图3C,D）。第二个关键步骤是制备新鲜配制并经过滤的油红O染液。最后，重要的是在将主动脉组织贴附于玻璃载玻片前，需确保其展平地贴附在石蜡盘上（图4C，
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
本工作部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目P30AR070253（P.-Y.C.）和HL135582（M.S.）提供的联合生物学联盟微基金的支持。我们感谢R. Webber和L. Coon在本研究中对实验小鼠的维护工作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL Eppendorf管 | 丹维尔 | C2170 | |
| 10 mL 注射器 | BD | 302995 | |
| 16% 甲醛 | Polysciences | 18814-10 | |
| 70% 乙醇 | VWR | RC2546.70-5 | 清洁解剖工具 |
| 黑色解剖蜡 | CR Scientific | C3541 | |
| 玉米油 | Sigma | C8267 | 他莫昔芬溶剂 |
| DNeasy 血液 & 组织试剂盒 | QIAGEN | 69506 | 从小鼠耳部提取DNA |
| 杜尔贝科’磷酸盐缓冲液（1X DPBS），pH 7.4 | Gibco | 14190-144 | |
| 精细剪刀 | Fine Science Tools | 14059-11 | 剪开小鼠皮肤并打开胸腔 |
| Fisherbrand 经济型普通玻璃显微镜载玻片 | Fisher Scientific | 12-550-A3 | |
| 高胆固醇高脂饮食 | 研究饮食 | D12108 | 诱导动脉粥样硬化 |
| 成像软件 | 美国国立卫生研究院 | Image J | 主动脉病变定量分析 |
| 异丙醇 | VWR | JT9079-5 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | 清洁玻璃显微镜载玻片 |
| 麦克弗森-范恩微型解剖弹簧剪 | ROBOZ | RS-5602 | 分离心脏与主动脉，并切开主动脉及其分支 |
| 显微镜控制软件 | 奥林巴斯 | DP 控制器 | 用于主动脉成像 |
| 微型固定针 | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| 25G针头 | BD | 305124 | |
| 非织造海绵 | McKesson | 94442000 | |
| 油红O | Sigma | O-0625 | 对动脉粥样硬化病变进行染色 |
| Pall Acrodisc 无菌注射器滤器（含Super滤膜） | VWR | 28143-312 | 过滤工作用油红O溶液 |
| 弹簧剪 | Fine Science Tools | 15021-15 | 解剖并清洗主动脉 |
| 统计软件 | GraphPad | Prism 8 | 统计分析 |
| 体视显微镜 | 尼康 | SMZ1000 | 主动脉夹层分离 |
| 体视显微镜 | Olympus | SZX16 | 用于主动脉成像 |
| 他莫昔芬 | Sigma | T5648 | 诱导 Cre-loxP 重组 |
| Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂，Sakura Finetek | VWR | 25608-930 | |
| 镊子式 4 | 电子显微镜科学公司 | 0302-4-PO | 剪开小鼠皮肤并打开胸腔 |
| 镊子式 5 | 电子显微镜科学公司 | 0302-5-PO | 解剖并清洗主动脉 |
参考文献
- Lusis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407, 233-241 (2000).
- Emini Veseli, B., et al. Animal models of atherosclerosis. European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).
- Plump, A. S., et al. Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells. Cell. 71, 343-353 (1992).
- Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E. Science. 258, 468-471 (1992).
- Ishibashi, S., et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. Journal of Clinical Investigation. 92, 883-893 (1993).
- Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arteriosclerosis Thrombosis. 14, 133-140 (1994).
- Chen, P. Y., et al. Smooth muscle cell reprogramming in aortic aneurysms. Cell Stem Cell. 26, 542-557 (2020).
- Andres-Manzano, M. J., Andres, V., Dorado, B. Oil Red O and Hematoxylin and Eosin Staining for Quantification of Atherosclerosis Burden in Mouse Aorta and Aortic Root. Methods in Molecular Biology. 1339, 85-99 (2015).
- Chen, P. Y., et al. Endothelial TGF-beta signalling drives vascular inflammation and atherosclerosis. Nature Metabolism. 1, 912-926 (2019).
- Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease. Nature Protocols. 8, 1149-1154 (2013).
- Ferruzzi, J., Madziva, D., Caulk, A. W., Tellides, G., Humphrey, J. D. Compromised mechanical homeostasis in arterial aging and associated cardiovascular consequences. Biomechanics and Modeling Mechanobiology. 17, 1281-1295 (2018).
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重印与许可
