在动脉瘤高脂血症小鼠模型中对油红O染色的完整主动脉病变进行成像与分析

摘要

本方案提供了一种在小鼠中分析动脉粥样硬化负荷的逐步操作流程。研究人员可利用本方案比较不同动物中动脉粥样硬化病变的数量、位置和大小。

摘要

载脂蛋白 E (Apoe)- 或低密度脂蛋白受体（Ldlr缺乏载脂蛋白E（ApoE）或低密度脂蛋白受体（LDLR）的高脂血症小鼠是动脉粥样硬化研究中最常用的两种模型。它们被用于研究多种遗传因素和不同细胞类型对动脉粥样硬化病变形成的影响，并用于测试新疗法的开发。分离， 切除 整个 主动脉， 油红O染色动脉粥样硬化病变的定性和定量分析是常用的形态计量学方法，用于 评估 动脉粥样硬化负荷。本方案的目的是进行描述 一种优化的逐步手术方法，用于解剖、灌注固定、分离、染色、成像及分析小鼠主动脉中脂质沉积斑块的动脉粥样硬化病变，采用油红O染色。因为 a动脉粥样硬化病变可发生于整个主动脉树的任何部位，该全主动脉油红O染色方法的优势在于可于单只小鼠中对整个主动脉及其所有分支中的脂质沉积斑块进行全面评估。除油红O染色外，新鲜分离的全主动脉还可用于多种体外和体内实验以及细胞分离。

引言

冠心病是美国主要的死亡原因之一，通常由动脉粥样硬化引起，该过程会导致动脉壁内斑块积聚¹。易发生高脂血症的 Apoe- 和 Ldlr- 缺陷型小鼠在动脉粥样硬化的研究及其并发症和治疗方法的开发中具有核心地位^{2，3，4，5}。通过主动脉展平标本对动脉粥样硬化病变进行定量分析，是评估不同细胞类型中基因操作影响的重要终点指标。该方法也有助于研究旨在影响动脉粥样硬化疾病起始、进展和消退的新型疗法。动脉粥样硬化病变可出现在主动脉及其分支的任何部位（例如胸部的头臂动脉、颈动脉和锁骨下动脉，以及膈肌以下的肾动脉、髂总动脉和股动脉）⁶。对动脉粥样硬化负荷进行全面评估并制定恰当治疗策略，需要对不同解剖部位的疾病负荷进行评估，而这一挑战常被忽视。

本方案描述了如何对单只小鼠的动脉粥样硬化病变进行系统性分析，起始于未剖开的完整主动脉，继而进行内膜面制备。对未剖开的完整主动脉进行油红O染色，可快速定性评估整个主动脉及其分支中富含脂质的斑块；而内膜面制备则可对小鼠主动脉中动脉粥样硬化病变的分布情况进行定量评估。

<....

方案

mT/mG（货号 007676）和 Apoe^-/-（货号 002052）小鼠购自杰克逊实验室。Myh11-CreER^T2 小鼠由 Stefan Offermanns 惠赠（可在杰克逊实验室以货号 019079 获得）。Tgfbr2^fl/fl 小鼠由范德堡大学 Harold L. Moses 提供。所有动物实验均依照耶鲁大学机构动物护理和使用委员会批准的方案进行。

1. 小鼠

1. 生成 MYH11-CreER^T2;mT/mG^f/f;ApoE^-/- 和 MYH11-CreER^T2Tgfbr2^f/f;mT/mG^f/f;Apoe^-/- 小鼠，如先前所述⁷. 将突变品系回交至C57BL/6J背景十代以上 代际
   注意：Myh11-CreER^T2 Cre 小鼠品系为研究血管稳态和血管病理过程中平滑....

结果

在本实验方案中，TGFβR2^iSMC-Apoe 小鼠在高胆固醇高脂肪饮食喂养4个月后，对其动脉粥样硬化病变进行了分析⁷。除了广泛的动脉粥样硬化外，这些小鼠还出现了胸腹主动脉瘤，与既往报道一致。与 Apoe^-/- 小鼠相比，TGFβR2^iSMC-Apoe 小鼠的主动脉壁动脉粥样硬化更为严重，导致病变组织难以分离（图2C,D,E）。此外，动脉瘤在肾上主动脉以下区域尤为广泛，与人类晚期主动脉瘤高度相似。

TGFβR2 小鼠经 HCHFD 饲喂后主动脉 Oil Red O 染色的代表性未打开图像^iSMC-Apoe 小鼠如图所示 图3E图像显示了TGFβR2^iSMC-Apoe 小鼠出现升主动脉和腹主动脉瘤，并在主动脉分支（此处为无名动脉、颈动脉、锁骨下动脉、髂动脉、股动脉和肾动脉）中表.......

讨论

载脂蛋白E（Apoe）和低密度脂蛋白受体（Ldlr）缺陷型小鼠是研究动脉粥样硬化发生与治疗的有用模型。研究人员可通过主动脉全长油红O染色，评估遗传因素和治疗干预对动脉粥样硬化相关疾病起始、进展及消退的影响⁹。主动脉油红O染色及病变定量分析是动脉粥样硬化研究的金标准终点指标。该技术成本低廉，且无需特殊设备¹⁰。然而，获得高质量的油红O染色组织并不容易。根据以往经验，本实验方案中有三个关键步骤，整个操作过程需要反复练习和足够的耐心。第一个关键步骤是在油红O染色前后，能够完整解剖、取出并彻底清除主动脉及其分支周围的全部血管周围脂肪组织（图2D，图3C,D）。第二个关键步骤是制备新鲜配制并经过滤的油红O染液。最后，重要的是在将主动脉组织贴附于玻璃载玻片前，需确保其展平地贴附在石蜡盘上（图4C，

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL Eppendorf管	丹维尔	C2170
10 mL 注射器	BD	302995
16% 甲醛	Polysciences	18814-10
70% 乙醇	VWR	RC2546.70-5	清洁解剖工具
黑色解剖蜡	CR Scientific	C3541
玉米油	Sigma	C8267	他莫昔芬溶剂
DNeasy 血液 & 组织试剂盒	QIAGEN	69506	从小鼠耳部提取DNA
杜尔贝科’磷酸盐缓冲液（1X DPBS），pH 7.4	Gibco	14190-144
精细剪刀	Fine Science Tools	14059-11	剪开小鼠皮肤并打开胸腔
Fisherbrand 经济型普通玻璃显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-550-A3
高胆固醇高脂饮食	研究饮食	D12108	诱导动脉粥样硬化
成像软件	美国国立卫生研究院	Image J	主动脉病变定量分析
异丙醇	VWR	JT9079-5
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A	清洁玻璃显微镜载玻片
麦克弗森-范恩微型解剖弹簧剪	ROBOZ	RS-5602	分离心脏与主动脉，并切开主动脉及其分支
显微镜控制软件	奥林巴斯	DP 控制器	用于主动脉成像
微型固定针	Fine Science Tools	26002-10
25G针头	BD	305124
非织造海绵	McKesson	94442000
油红O	Sigma	O-0625	对动脉粥样硬化病变进行染色
Pall Acrodisc 无菌注射器滤器（含Super滤膜）	VWR	28143-312	过滤工作用油红O溶液
弹簧剪	Fine Science Tools	15021-15	解剖并清洗主动脉
统计软件	GraphPad	Prism 8	统计分析
体视显微镜	尼康	SMZ1000	主动脉夹层分离
体视显微镜	Olympus	SZX16	用于主动脉成像
他莫昔芬	Sigma	T5648	诱导 Cre-loxP 重组
Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂，Sakura Finetek	VWR	25608-930
镊子式 4	电子显微镜科学公司	0302-4-PO	剪开小鼠皮肤并打开胸腔
镊子式 5	电子显微镜科学公司	0302-5-PO	解剖并清洗主动脉