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方法文章

蝙蝠主要组织相容性复合体I类分子与异源β2-微球蛋白结合后的稳定性与结构研究

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DOI：

10.3791/61462

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2021年3月10日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Laboratory Medicine and Life Sciences, Wenzhou Medical University, 2NHC Key Laboratory of Biosafety, National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, 3Faculty of Health Sciences, University of Macau, 4CAS Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 5Savaid Medical School, University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了通过不同物种的β2-微球蛋白（β2m）潜在替换，获得稳定的主要组织相容性复合体（MHC）I类分子的实验方法。研究了由同源和异源β2m稳定的MHC I类分子的结构差异。

摘要

主要组织相容性复合体（MHC）在抗原肽呈递以及针对传染病和肿瘤发生的T细胞免疫应答中发挥关键作用。不同物种来源的异源β2-微球蛋白（β2m）替代形成的杂合MHC I复合物可在体外实现稳定。当同源β2m不可获得时，这是一种研究哺乳动物MHC I的可行方法。同时已有研究表明，哺乳动物β2m的替代对肽段呈递的影响不显著。然而，目前关于杂合MHC I与异源β2-微球蛋白（β2m）复合物的构建方法与技术体系尚缺乏系统总结。本文介绍了评估异源β2m替代在MHC I研究中可行性的若干方法，包括表达载体的构建、包涵体的纯化与MHC复合物的复性、蛋白质热稳定性的测定、晶体筛选及结构解析。本研究为理解MHC I的功能与结构提供了技术参考，同时也对传染病及肿瘤免疫治疗过程中T细胞应答的评估具有重要意义。

引言

主要组织相容性复合体（MHC）存在于所有脊椎动物中，是一组决定机体对感染性病原体产生细胞介导免疫反应的基因。MHC I 类分子将内源性肽段（例如病毒感染后产生的病毒成分）呈递给 CD8+ T 细胞表面的 T 细胞受体（TCR），从而介导细胞免疫并参与免疫调节1。对 MHC I 分子与肽段结合的结构研究，可提供关于肽段结合基序及 MHC I 分子呈递特征的信息，这些信息在评估 CD8+ T 细胞免疫应答和疫苗研发中发挥着关键作用。

自从Bjorkman等人首次对MHC I类分子进行结晶并确定其结构以来2，MHC I类分子的晶体结构分析极大地促进了人们对肽段如何与MHC I类分子结合的理解，并有助于阐明轻链与重链及肽段之间的相互作用。一系列后续研究表明，尽管编码轻链的基因不位于MHC区域内，但轻链是MHC I类分子组装过程中的关键蛋白3,4。它在多个表面与MHC I类分子的三个结构域发生相互作用。当缺乏轻链时，MHC I类分子无法在抗原呈递细胞表面正确表达，也无法与TCR相互作用以发挥其免疫学功能。

MHC I 由一条重链（H 链）和一条轻链（即 β2-微球蛋白（β2m））组成，并通过与合适的肽段结合而组装形成5。H 链的胞外区包含 α1、α2 和 α3 三个结构域6。其中 α1 和 α2 结构域共同构成肽结合沟槽（PBG）。β2m 链在 MHC I 组装复合物中作为结构亚基，可稳定复合物的构象，并作为分子伴侣协助 MHC I H 链的正确折叠7,8,9。一系列研究表明，来自多种哺乳动物的 MHC I H 链，如蝙蝠（翼手目）（Ptal-N*01:01）10、恒河猴（灵长目）（Mamu-B*17）11（Mamu-A*01）12（Mamu-A*02）13、小鼠（啮齿目）（H-2Kd）14,15、犬（食肉目）（DLA-88*50801）16、牛（偶蹄目）（BoLA-A11）17 以及马（奇蹄目）（Eqca-N*00602 和 Eqca-N*00601）18，均能与异源 β2m 结合（表 1）。这些杂合分子常被用于结构与功能研究。然而，针对含异源 β2m 的杂合 MHC I 分子的功能与结构研究方法尚未系统总结。同时，不同物种间 β2m 可互换的结构基础仍不明确。

本文总结了MHC I类分子的表达、复性、结晶、晶体数据收集及结构解析的实验流程。此外，通过比较同源和异源β2m稳定下的MHC I类分子结构构象，分析了来自不同物种的β2m可能的替代作用。这些方法将有助于进一步开展MHC I类分子的结构研究，以及在癌症和传染病中对CD8+ T细胞免疫应答的评估。

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方案

1. 表达载体的构建

  1. 从 NCBI 数据库中获取蝙蝠的 MHC I 类基因序列（包括预测基因）。
  2. 从免疫多态性数据库（IPD）（www.ebi.ac.uk/ipd/mhc）和 UniProt 数据库（www.uniprot.org）中获取高等哺乳动物 MHC I 类重链序列。
  3. 为了获得可溶性 MHC 复合物，对序列进行定点突变以去除胞质区和跨膜区。
  4. 将编码蝙蝠 Ptal-N*01:01（GenBank 编号 KT98792919）（残基 1–277）和蝙蝠 β2m（GenBank 编号 XP_006920478.1）（残基 1–98）的胞外域基因分别克隆至 pET-28a 载体（Novagen，中国北京）中。
  5. 将优化后的（适用于 Escherichia coli）序列插入至经修饰的 pET-28a 载体的 NcoI 和 EcoR1 位点之间。
  6. 按照先前描述的方法构建人源 β2m 表达质粒20。

2. 肽的合成

  1. 多肽预测
    1. 如先前所述10，为了筛选可能与 Ptal-N*01:01 结合的多肽，可利用与蝙蝠相关的亨德拉病毒（hendra virus, HeV）的蛋白质序列进行候选多肽的预测。基于在线服务器提供的结构模型，使用 NetMHCpan 4.0 服务器（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/）21 和 Rosetta FlexPepDock22 对所选多肽片段的潜在结合能力进行预测。此外，也可使用其他软件和数据库，如 BIMAS、免疫表位数据库（Immune Epitope Database, IEDB）、NetCTL 1.2 和 SYFPEITHI，这些工具均整合了对多肽–MHC I 类分子结合亲和力、抗原加工相关转运蛋白（TAP）转运效率、蛋白酶体C端切割以及多肽–HLA I 类分子复合物解离半衰期的预测功能。
    2. 为预测高亲和力多肽，应同时使用 NetMHCpan 和 Rosetta FlexPepDock 服务器。
      注意：遗憾的是，两种方法的预测结果均未与实验数据匹配。这可能表明当前的MHC多肽结合预测模型并不适用于蝙蝠等非人非鼠类哺乳动物，其多肽结合机制可能存在差异。因此，需要结合多种预测软件及实验结果进行综合分析，以获得高亲和力多肽。
  2. 多肽的制备与保存
    1. 无需自行合成多肽，建议使用专业服务提供商。在完成多肽预测后，商业化采购具有较高结合评分的多肽。所有多肽的纯度经高效液相色谱（HPLC）和质谱分析确认均>95%。
    2. 将所购多肽以冻干粉形式于 −80 °C 保存，使用前用二甲基亚砜（DMSO）溶解。

3. 包涵体的纯化

  1. 转化 E. coli
    1. 转化含有蝙蝠MHC I Ptal-N*01:01重链或人β的质粒10 ng2m 或 bat β2m 转入 100 µL BL21(DE3) E. coli在冰中孵育30分钟。
    2. 42 °C 热激 90 秒，随后冰浴 2 分钟。
    3. 加入800 µL的溶菌肉汤（LB：酵母提取物、胰蛋白胨和NaCl；参见 材料表）至步骤 3.1.2，在 37 °C 下于摇动平台上以每分钟 200 转（rpm）的速度振荡 20 分钟。
    4. 将100 µL细菌悬液接种至含有相应抗生素抗性（氨苄青霉素：100 ng/mL）的平板，该抗生素浓度与先前构建体所用相同。
  2. 接种培养物
    1. 挑取单个新转化的细菌克隆，接种于3 mL含抗生素（氨苄青霉素：100 ng/mL）的LB培养基中，于37 °C、200 rpm振荡培养以活化细菌。培养物可在前一晚较晚时间接种，以便次日早晨进行诱导。
    2. 提前一晚将500 µL活化菌种转移至含抗生素的50 mL LB培养基中（氨苄青霉素：100 ng/mL），于37 °C、200 rpm振荡培养过夜。为便于下次接种时使用，将剩余的活化菌种以1 mL分装（500 μL菌液与500 μL 40%甘油混合）后置于−80 °C保存，待下次使用时取出。
    3. 将细菌培养物按1:100的比例转移至含有抗生素（氨苄青霉素：100 ng/mL）的2 L LB培养基中，于37 °C、200 rpm振荡培养，直至菌液在600 nm处的吸光度达到0.6。加入1 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）以诱导蛋白表达（针对不同MHC分子可调整IPTG浓度，通常在0.1 mM–1 mM之间）。
  3. 收获细菌
    1. 将细菌转移至离心管中，在5000 x g 4 °C下孵育20分钟。此后所有步骤均应在4 °C下进行。
    2. 将细菌重悬于60 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中，并使用超声波细胞破碎仪释放表达的重组蛋白。
      注意：通常情况下，本仪器设置的程序为超声6秒，间隔12秒，功率300 W，循环99次。
  4. 包涵体的纯化
    1. 将超声处理后的细菌悬液在12,000 x g下离心 g 孵育30分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于适量体积的洗涤缓冲液（0.5% Triton-100，50 mM Tris pH 8.0，300 mM NaCl，10 mM EDTA，10 mM DTT）中。重复此步骤一次。
    2. 以 12,000 x g 离心 g 孵育10–20分钟。弃去上清液，将包涵体重悬于重悬缓冲液（50 mM Tris pH 8.0，100 mM NaCl，10 mM EDTA，10 mM DTT）中。取20 µL样品（重悬于缓冲液中的包涵体）进行SDS-PAGE，以检测包涵体的纯度。
    3. 将剩余的制备物在12,000 x g条件下离心 g 孵育10–20分钟。弃去上清液。称量含有包涵体的沉淀，加入溶解缓冲液（6 M Gua-HCl、10%甘油、50 mM Tris pH 8.0、100 mM NaCl、10 mM EDTA），使终浓度为30 mg/mL。在4 °C下使用磁力搅拌器缓慢搅拌，直至包涵体完全溶解于溶解缓冲液中。
    4. 离心 12,000 x g 10–20 分钟。 弃去沉淀物。 将包涵体在 −20 °C 或 −80 °C 下保存。
      注意：在进行包涵体纯化之前，需确认重组蛋白的诱导和表达已成功。取诱导前后的各培养物样品进行蛋白凝胶电泳分析，采用15% SDS-PAGE（SDS-PAGE浓缩胶：H2O，30% 丙烯酰胺，1 M Tris-HCl（pH 6.8），10% SDS，10% 过硫酸铵（APS）和 TEMED；SDS-PAGE 分离胶：H2O，30% 丙烯酰胺，1.5 M Tris-HCl（pH 8.8），10% SDS，10% 过硫酸铵（APS）和 TEMED；见 材料表 β的）2m，用于H链的10% SDS-PAGE

4. MHC 复合物的复性

注意：包涵体复性效率会影响所获得蛋白质的产量。折叠过程与聚合过程相互竞争，因此通常认为在低蛋白浓度下进行复性是最有效的方法。本文中，包涵体的浓度为 30 mg/mL。

  1. 配制复性缓冲液。
    1. 根据目标蛋白的不同调整复性缓冲液的组成。例如，pH值、离子强度、氧化还原条件以及配体的存在均会影响蛋白复性效果。最常见的是使用基于Tris或HEPES的缓冲液，pH呈中性，NaCl浓度为50–500 mM，但具体条件仍需根据目标蛋白进行优化。以下是本文所使用的复性缓冲液配方。
    2. 配制折叠缓冲液：100 mM Tris-HCl（pH 8.0）、400 mM L-arginine、2 mM EDTA-2Na。
    3. 将缓冲液置于250–300 mL锥形瓶中冷却至4 °C，然后加入5 mM还原型谷胱甘肽（GSH）和0.5 mM氧化型谷胱甘肽（GSSG）。在4 °C下使用磁力搅拌器缓慢搅拌10–20分钟，随后加入包涵体和多肽。
  2. MHC I类重链和β2微球蛋白的注射与稀释2m
    注意：复性温度可能有所不同，但通常为了最大限度地减少聚集，最佳温度为 4 °C。我们采用稀释法对蛋白质进行复性。
    1. 使用1 mL注射器的针头，注入1 mL hβ2m 包涵体或 bβ2将包涵体分别加入两种复性缓冲液（每种1升）。注入时靠近快速旋转的搅拌棒，以实现快速而有效的稀释。β2m 相对容易重折叠，即使在没有 H 链的情况下仍能保持稳定。
    2. β之后2m 已溶解在复性溶液中后，将肽段（5 mg/mL）溶解于 DMSO 中，并迅速向复性溶液中注入 200 µL。缓慢搅拌 10–20 分钟，再加入 H 链。
    3. 采用与上述β链相同的操作步骤注射H链2m. H 链极不稳定，因此加样顺序非常重要。将 3 mL H 链包涵体分别加入两种不同的复性缓冲液（每种 1 升）中，同时加入 hβ2m 或 bβ2分别为 m。与一次性加入全部蛋白相比，分次连续加入小份蛋白可提高MHC的复性产率。在4 °C下孵育8–10 h以完成复性。
  3. 复性蛋白的浓度
    1. 使用带有10 kDa截留分子量（MMCO）膜的加压超滤装置浓缩复性后的蛋白质。该方法操作简便，且可与缓冲液置换结合进行。向超滤装置中加入置换缓冲液（20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 8.0），浓缩至终体积为30–50 mL。
    2. 将复性溶液转移至离心管中，以12,000 x g 4 °C下离心15分钟以去除沉淀物。
    3. 小心转移上清液，并进一步浓缩至终体积约1 mL。
    4. 以 12,000 x g 离心g 孵育10–20分钟。将上清液转移至无菌离心管中，并使用10/300 GL凝胶过滤柱纯化蛋白质。
    5. 在峰值处收集样品，并使用SDS-PAGE（15%聚丙烯酰胺凝胶）进行分析。
    6. 收集MHC复合物峰，并浓缩至终浓度为15 mg/mL。
    7. 将复合物稀释至7.5 mg/mL和15 mg/mL以进行结晶。

5. 结晶、数据收集与处理

  1. 采用悬滴气相扩散法对MHC-肽复合物进行结晶。
  2. 使用商业化晶体筛选试剂盒（例如Crystal Screen试剂盒I/II、Index Screen试剂盒、PEGIon试剂盒I/II以及PEGRx试剂盒）对Ptal-N*01:01/肽复合物进行筛选。
  3. 将所得溶液密封，并在4或18°C条件下与100 µL储液进行平衡。
  4. 在培养过程中分别于3天、1周、2周、1个月、3个月和6个月观察晶体生长情况。使用显微镜检查晶体板中每个液滴是否形成晶体。
    注意：Ptal-N*01:01/HeV1(bβ2m)晶体在含0.2 M NaCl、0.1 M Bis-Tris（pH 5.5）和25%（w/v）聚乙二醇3,350、蛋白浓度为7.5 mg/mL的条件下观察到。Ptal-N*01:01/HeV1(hβ2m)晶体在含0.1 M HEPES（pH 7.0）、2%（w/v）聚乙二醇3,350、蛋白浓度为7.5 mg/mL的条件下观察到。
  5. 进行低温保护时，将晶体转移至含有20%甘油的保存溶液中，随后在100 K的氮气流中快速冷却。
  6. 在中国上海同步辐射设施（上海，中国）的BL19U光束线上收集X射线衍射数据。

6. 结构测定与分析

  1. 利用高分辨率结构数据，使用 Denzo 程序和 HKL2000 软件包处理并标定数据集的强度  (https://hkl-xray.com/)23。
  2. 在蛋白质数据库（Protein Data Bank, PDB）中选择一个更优的初始模型，使用 CCP4 中的 Phaser MR 程序通过分子置换法确定结构24（http://www.ccp4.ac.uk/）。所用模型为蛋白质数据库（PDB）编号 5F1I 的结构坐标。
  3. 使用优化后的X射线模型进行初始联合精修。分别单独使用 Phenix refine 进行X射线数据精修，以及使用联合模式进行中子与X射线联合精修。
  4. 每轮精修后，在 Coot25（https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/）中手动检查模型与 Fo − Fc 和 2Fo − Fc 正电子密度图的符合情况。这有助于正确放置水分子和某些D原子。所有结构图均通过 PyMOL（http://www.pymol.org/）生成。

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结果

先前的研究报道，HeV 来源的 HeV1 肽（DFANTFLP）可被 Ptal-N*01:01 呈递10,19. 此处，该肽段与同源蝙蝠 β 的 Ptal-N*01:01 结合能力2m (bβ2m）和异源的 人 β

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讨论

通过来自不同分类群的异源替换构建杂合蛋白复合物，是在同源复合物不可获得时（如MHC I及其配体）进行功能与结构研究的常用策略。然而，关于该方法与技术的系统性总结较为有限。本文中，通过bβ稳定化的蝙蝠MHC I结构Ptal-N*01:012m 或 hβ2m 进行了分析。β 的关键氨基酸2m 与 Ptal-N*01:01 的结合在蝙蝠与人类之间是保守的。进一步分析发现，参与 β 的关键残基2m与MHC I类分子重链的结合在哺乳动物中是保守的，但在鸡、鱼类和两栖类中具有多态性。这些数据表明异源β2m 替换是研究哺乳动物 MHC I 的一种可行方法。然而，哺乳动物与鸟类、鱼类或两栖类之间的替换可能不可行。

结构研究在理解MHC I类分子呈递肽段的分子机制中发挥着关键作用。在MHC I类分子的结构研究中，通常采用异源β2m替代的方法14,16

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披露

作者声明无任何利益冲突。

致谢

本研究由中华人民共和国南京大学医药生物技术国家重点实验室开放基金（项目编号：KF-GN-201905）和国家自然科学基金（项目编号：81971501）资助。William J. Liu 受国家自然科学基金优秀青年科学基金项目（81822040）和北京市科技新星计划（Z181100006218080）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10 kDa MMCO 膜Merck milliporePLGC07610
30% 丙烯酰胺LABLEADA3291-500ml*5
5×蛋白质 SDS 上样缓冲液NovoproteinPM099-01A
AMICON ULTRA-15 15 mL-10 kDa 截留分子量Merck milliporeUFC901096
氨苄青霉素Inalco1758-9314
APSSigmaA3678-100G
BL21(DE3) 菌株TIANGENCB105-02
DMSOMP219605580应佩戴合适的手套及眼睛/面部防护装备。若接触眼睛，应立即用大量清水冲洗并寻求医疗建议。
DTTSolarbioD1070应佩戴手套和护目镜，并在通风良好的环境中操作。若接触眼睛，应立即用大量清水冲洗并寻求医疗建议。
EDTA-2NaKeyGEN BioTECHKGT515500
甘油HUSHI10010618
GSHAmresco0399-250G
GSSGAmresco0524-100G
盐酸胍AmrescoE424-5KG
hβ2mour labZhang, S. 等. 通过两种 HIV 来源肽复合物揭示 HLA-A*0301 和 HLA-A*1101 跨等位基因呈递的结构基础. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011)。
IPTGInalco1758-1400
L-盐酸精氨酸Amresco0877-5KG
NaClSolarbioS8210
蛋白质 MarkerFermentas26614
SDSBoao Rui JingA112130
Superdex Increase 200 10/300 GLGE Healthcare28990944
TEMEDThermo17919应佩戴手套和护目镜，并在通风良好的环境中操作。
Tris-HClAmresco0497-5KG
Triton X-100BiorulerRH30056-100mL
胰蛋白胨OxoidLP0042
酵母提取物OxoidLP0021

参考文献

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MHC I 2 X
蝙蝠主要组织相容性复合体I类分子与异源β2-微球蛋白结合后的稳定性与结构研究
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