本方案描述了通过不同物种的β2-微球蛋白（β2m）潜在替换，获得稳定的主要组织相容性复合体（MHC）I类分子的实验方法。研究了由同源和异源β2m稳定的MHC I类分子的结构差异。
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方法文章
蝙蝠主要组织相容性复合体I类分子与异源β2-微球蛋白结合后的稳定性与结构研究
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
主要组织相容性复合体（MHC）在抗原肽呈递以及针对传染病和肿瘤发生的T细胞免疫应答中发挥关键作用。不同物种来源的异源β2-微球蛋白（β2m）替代形成的杂合MHC I复合物可在体外实现稳定。当同源β2m不可获得时，这是一种研究哺乳动物MHC I的可行方法。同时已有研究表明，哺乳动物β2m的替代对肽段呈递的影响不显著。然而，目前关于杂合MHC I与异源β2-微球蛋白（β2m）复合物的构建方法与技术体系尚缺乏系统总结。本文介绍了评估异源β2m替代在MHC I研究中可行性的若干方法，包括表达载体的构建、包涵体的纯化与MHC复合物的复性、蛋白质热稳定性的测定、晶体筛选及结构解析。本研究为理解MHC I的功能与结构提供了技术参考，同时也对传染病及肿瘤免疫治疗过程中T细胞应答的评估具有重要意义。
引言
主要组织相容性复合体（MHC）存在于所有脊椎动物中，是一组决定机体对感染性病原体产生细胞介导免疫反应的基因。MHC I 类分子将内源性肽段（例如病毒感染后产生的病毒成分）呈递给 CD8+ T 细胞表面的 T 细胞受体（TCR），从而介导细胞免疫并参与免疫调节1。对 MHC I 分子与肽段结合的结构研究，可提供关于肽段结合基序及 MHC I 分子呈递特征的信息，这些信息在评估 CD8+ T 细胞免疫应答和疫苗研发中发挥着关键作用。
自从Bjorkman等人首次对MHC I类分子进行结晶并确定其结构以来2，MHC I类分子的晶体结构分析极大地促进了人们对肽段如何与MHC I类分子结合的理解，并有助于阐明轻链与重链及肽段之间的相互作用。一系列后续研究表明，尽管编码轻链的基因不位于MHC区域内，但轻链是MHC I类分子组装过程中的关键蛋白3,4。它在多个表面与MHC I类分子的三个结构域发生相互作用。当缺乏轻链时，MHC I类分子无法在抗原呈递细胞表面正确表达，也无法与TCR相互作用以发挥其免疫学功能。
MHC I 由一条重链（H 链）和一条轻链（即 β2
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方案
1. 表达载体的构建
- 从 NCBI 数据库中获取蝙蝠的 MHC I 类基因序列（包括预测基因）。
- 从免疫多态性数据库（IPD）（www.ebi.ac.uk/ipd/mhc）和 UniProt 数据库（www.uniprot.org）中获取高等哺乳动物 MHC I 类重链序列。
- 为了获得可溶性 MHC 复合物，对序列进行定点突变以去除胞质区和跨膜区。
- 将编码蝙蝠 Ptal-N*01:01（GenBank 编号 KT98792919）（残基 1–277）和蝙蝠 β2m（GenBank 编号 XP_006920478.1）（残基 1–98）的胞外域基因分别克隆至 pET-28a 载体（Novagen，中国北京）中。
- 将优化后的（适用于 Escherichia coli）序列插入至经修饰的 pET-28a 载体的 NcoI 和 EcoR1 位点之间。
- 按照先前描述的方法构建人源 β2m 表达质粒20。
2. 肽的合成
- 多肽预测
- 如先前所述10，为了筛选可能与 Pt....
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结果
先前的研究报道，HeV 来源的 HeV1 肽（DFANTFLP）可被 Ptal-N*01:01 呈递10,19. 此处，该肽段与同源蝙蝠 β 的 Ptal-N*01:01 结合能力2m (bβ2m）和异源的 人 β
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讨论
通过来自不同分类群的异源替换构建杂合蛋白复合物，是在同源复合物不可获得时（如MHC I及其配体）进行功能与结构研究的常用策略。然而，关于该方法与技术的系统性总结较为有限。本文中，通过bβ稳定化的蝙蝠MHC I结构Ptal-N*01:012m 或 hβ2m 进行了分析。β 的关键氨基酸2m 与 Ptal-N*01:01 的结合在蝙蝠与人类之间是保守的。进一步分析发现，参与 β 的关键残基2m与MHC I类分子重链的结合在哺乳动物中是保守的，但在鸡、鱼类和两栖类中具有多态性。这些数据表明异源β2m 替换是研究哺乳动物 MHC I 的一种可行方法。然而，哺乳动物与鸟类、鱼类或两栖类之间的替换可能不可行。
结构研究在理解MHC I类分子呈递肽段的分子机制中发挥着关键作用。在MHC I类分子的结构研究中，通常采用异源β2m替代的方法14,16
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披露
作者声明无任何利益冲突。
致谢
本研究由中华人民共和国南京大学医药生物技术国家重点实验室开放基金（项目编号：KF-GN-201905）和国家自然科学基金（项目编号：81971501）资助。William J. Liu 受国家自然科学基金优秀青年科学基金项目（81822040）和北京市科技新星计划（Z181100006218080）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10 kDa MMCO 膜 | Merck millipore | PLGC07610 | |
| 30% 丙烯酰胺 | LABLEAD | A3291-500ml*5 | |
| 5×蛋白质 SDS 上样缓冲液 | Novoprotein | PM099-01A | |
| AMICON ULTRA-15 15 mL-10 kDa 截留分子量 | Merck millipore | UFC901096 | |
| 氨苄青霉素 | Inalco | 1758-9314 | |
| APS | Sigma | A3678-100G | |
| BL21(DE3) 菌株 | TIANGEN | CB105-02 | |
| DMSO | MP | 219605580 | 应佩戴合适的手套及眼睛/面部防护装备。若接触眼睛，应立即用大量清水冲洗并寻求医疗建议。 |
| DTT | Solarbio | D1070 | 应佩戴手套和护目镜，并在通风良好的环境中操作。若接触眼睛，应立即用大量清水冲洗并寻求医疗建议。 |
| EDTA-2Na | KeyGEN BioTECH | KGT515500 | |
| 甘油 | HUSHI | 10010618 | |
| GSH | Amresco | 0399-250G | |
| GSSG | Amresco | 0524-100G | |
| 盐酸胍 | Amresco | E424-5KG | |
| hβ2m | our lab | Zhang, S. 等. 通过两种 HIV 来源肽复合物揭示 HLA-A*0301 和 HLA-A*1101 跨等位基因呈递的结构基础. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011)。 | |
| IPTG | Inalco | 1758-1400 | |
| L-盐酸精氨酸 | Amresco | 0877-5KG | |
| NaCl | Solarbio | S8210 | |
| 蛋白质 Marker | Fermentas | 26614 | |
| SDS | Boao Rui Jing | A112130 | |
| Superdex Increase 200 10/300 GL | GE Healthcare | 28990944 | |
| TEMED | Thermo | 17919 | 应佩戴手套和护目镜，并在通风良好的环境中操作。 |
| Tris-HCl | Amresco | 0497-5KG | |
| Triton X-100 | Bioruler | RH30056-100mL | |
| 胰蛋白胨 | Oxoid | LP0042 | |
| 酵母提取物 | Oxoid | LP0021 |
参考文献
- Vyas, J. M., Van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. The known unknowns of antigen processing and presentation. Nature Reviews Immunology. 8 (8), 607-618 (2008).
- Bjorkman, P. J., et al. Structure of the human class I histocompatibility antigen, HLA-A2. Nature. ....
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重印与许可
