蝙蝠主要组织兼容性复杂类 I 的稳定性和结构与异质β2- 微球蛋白

Summary

该协议描述了通过从不同物种获得2-微球蛋白（β 2米）替代的潜在β获得稳定的主要组织相容性复合物（MHC）I类的实验方法。调查了由同源和异质_{β 2}米稳定下来的MHC I的结构比较。

Abstract

主要的组织相容性复合物（MHC）在抗原肽的表达和T细胞对传染病和肿瘤发展的免疫反应中起着关键作用。杂交MHC I与异种_{β 2-}微球蛋白（β 2米）从不同物种的替代可以稳定体外。这是研究哺乳动物MHC I的可行方法，当同源_{β 2}米不可用时。同时，指出哺乳动物_{β 2}米替代不会显著影响肽的表达。然而，对于与异种_{β 2-}微球蛋白（β 2_米）复合的混合MHC I的方法和技术的总结有限。在此，提出了在MHC I研究中评估异质_{β 2}米替代的可行性的方法。这些方法包括准备表达结构:净化包容机构和重新折叠 MHC 综合体;确定蛋白质热稳定性;晶体筛选和结构确定。本研究为了解MHC I的功能和结构提供了建议，对传染病和肿瘤免疫治疗期间的T细胞反应评价也具有重要意义。

Introduction

主要的组织相容性复合物（MHC）存在于所有脊椎动物中，是一组基因，决定细胞介质对传染性病原体的免疫力。MHC类I向^CD8+T 细胞表面的T细胞受体（TCR）展示内源肽，如病毒感染时产生的病毒成分，以调节细胞免疫和参与免疫调节^1。MHC I 与肽结合的结构研究提供了有关 MHC I 分子的肽结合主题和表现特征的信息，在评估 CD8⁺ T 细胞免疫反应和疫苗开发中起着至关重要的作用。

自比约克曼等人首次对MHC I分子进行结晶和结构测定^以来，MHCI分子的晶体结构分析极大地促进了对肽如何与MHC I分子结合的理解，有助于理解轻链与重链和肽的相互作用。一系列后续研究表明，虽然编码光链的基因与MHC无关，但光链是MHC I分子^3、4组位的关键蛋白质。它与多个表面上的 MHC I 类分子的三个域相互作用。当光链缺失时，MHC I类分子不能正确表达在抗原呈现细胞表面，也不能与TCR相互作用以发挥其免疫功能。

MHC I由重链（H链）和轻链（即_{β 2-}微球蛋白（β 2米）组成，通过与合适的肽⁵结合组装而成。H 链的细胞外部分由 α1、α2 和 α3 域⁶组成。α1 和 α2 域形成肽结合槽 （PBG）。_{β 2}米链作为MHC I装配综合体的结构子团，稳定了复合物的构象，是MHC I H链折叠^7、8、9的分子伴奏。一系列研究表明，MHC I H链来自各种哺乳动物，如蝙蝠（脊柱菌）（Ptal-N*01:01）10，恒河猴（灵长类动物）（马穆） -B*17）¹¹ （马木-A*01）¹² （马穆-A*02）^13，鼠标 （罗登蒂亚） （H-2K^{d）14，015，}狗 （卡尼沃拉） （DLA-88*50801）^16，牛 （阿蒂奥达蒂拉） （博拉-A11）¹⁷和马 （佩里索德） （Eqca-N*00602 和 Eqca-N*00601）¹⁸可与异质β₂米（表1）相结合。这些混合分子经常用于结构和功能研究。然而，杂交MHC I与异质_{β 2m}的功能和结构研究方法尚未总结。同时，不同税种之间₂米β互换的结构基础仍不明朗。

在此，总结了MHC I表达、重新折叠、结晶、晶体数据收集和结构测定的过程。此外，通过比较由同源和异质_{β 2}米稳定下来的MHC I的结构构象，分析不同物种_{β 2}米的潜在替代。这些方法将有助于进一步的MHC I结构研究和^CD8+T 细胞免疫反应评估癌症和传染病。

Protocol

1. 表达结构的准备

1. 从NCBI数据库中检索MHC I类基因（包括预测基因）的序列。
2. 从免疫多态性数据库 （IPD） （www.ebi.ac.uk/ipd/mhc） 和 UniProt 数据库 （www.uniprot.org） 检索更高的哺乳动物 MHC I 重链序列。
3. 要获得可溶性 MHC 复合物，请将序列变异以去除细胞反子和跨膜区域。
4. 克隆编码蝙蝠Ptal-N*01:01（根银行号）的基因。KT987929¹⁹） （残留物 1-277） 和蝙蝠β₂米 （根银行号XP_006920478.1） （残留 1-98） 成 pET-28a 矢量（中国北京诺维根）。
5. 在经过改良的 pET-28a 矢量的NcoI和EcoR1站点之间插入优化的（用于大肠杆菌）序列。
6. 构造人类_{β 2}米表达质粒，如先前描述的^20。

2. 肽合成

1. 肽预测
   1. 如前¹⁰条所述，要筛选可能与Ptal-N*01:01结合的肽，使用蝙蝠相关病毒亨德拉病毒（HeV）的蛋白质体预测候选肽。为了从在线服务器的结构模型获得高亲和力肽，NetMHCpan 4.0服务器^{（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/）21} 和罗塞塔FlexPepDock²² 预测了所选肽部分的潜在结合。此外，其他软件和数据库，包括 BIMAS ，免疫表皮数据库（ IEDB ）、 NetCTL 1 . 2 和 SYFPEITHI 也可用于此，它们都集成了肽 - MHC I 类结合亲和力的预测、与抗原处理（ TAP ）传输效率相关的运输器、蛋白酶 C 端和肽 - HLA 类 I 分子的半衰期分离。
   2. 要预测高结合度肽，请同时使用 NetMHCpan 和罗塞塔 FlexPepDock 服务器。
      注:不幸的是，两个生成的预测都与实验数据不符。这可能表明，目前的MHC结合肽预测不适合非人类和非小鼠哺乳动物，如蝙蝠，这可能有不同的肽结合方式。因此，我们需要结合各种预测软件和实验结果进行综合分析，以获得高亲和力肽。
2. 肽制备和保存
   1. 与其生成自定义肽，不如使用专门的服务提供商。购买所有肽商业遵循肽预测工具，具有较高的绑定分数。HPLC 和质谱确定肽纯度为 +95%。
   2. 将所有购买的肽作为冷冻干燥粉末储存在+80°C，并在使用前溶解在二甲基硫化物（DMSO）中。

3. 净化包容机构

1. 大肠杆菌的转化
   1. 将含有蝙蝠MHC I Ptal-N*01:01 H链的10克质粒，或人类_{β 2}米或蝙蝠_{β 2}米转化为100μL的BL21（DE3） 大肠杆菌。在冰中沐浴30分钟。
   2. 90 秒在 42 °C 下的热冲击，然后在冰中沐浴 2 分钟。
   3. 加入800μL的裂解肉汤（LB:酵母提取物，tryptone和NaCl;见 材料表）步骤3.1.2和摇动在200旋转每分钟（rpm）在37°C的摇摆平台上20分钟。
   4. 将100μL的细菌悬浮物涂抹在含有相应抗生素耐药性的板材上（安非他明:100 ng/mL），这与以前的结构相同。
2. 接种文化
   1. 挑选一个最近转化的细菌克隆成3毫升LB与抗生素介质（安普西林:100 ng/mL）和培养在37°C，同时在200 rpm的摇动平台上摇动激活细菌。文化可以在深夜接种，准备第二天早上上岗。
   2. 提前一晚，将500μL的活性细菌存量转移到50毫升LB中，用抗生素介质（安普西林:100 ng/mL），并在37°C下孵育过夜，在200 rpm时摇晃。为方便准备下一次接种，请将剩余的活性细菌库存冻结在+80°C（500微升培养物，500微升40%甘油）中，直到需要下一次准备。
   3. 要生成大量的重组蛋白，请将细菌制剂以 1:100 的比例与抗生素介质（安普西林:100 ng/mL）一起转移到 2 L LB 中，在 200 rpm 下摇动时在 37 °C 下孵化。培养，直到达到0.6在600nm的吸收。在烧瓶中加入1 mM异丙基-1-β-D-银河苷（IPTG）（改变不同MHC的IPTG浓度，大多在0.1 mM-1m之间）到烧瓶中，以诱导蛋白质表达。
3. 收获细菌
   1. 将细菌转移到离心瓶和离心机在5000 x g 20分钟在4°C。 从现在起，所有步骤应在4°C下执行。
   2. 将细菌重新悬浮在60mL的磷酸盐缓冲盐酸（PBS）中，并通过超声波细胞干扰剂释放表达重组蛋白。
      注:一般来说，我们在这台机器上设置的程序是超声波6S，间隔12S，300W，99次）。
4. 净化包容机构
   1. 离心声波细菌悬浮在12，000 x g 30分钟。丢弃超纳坦，在适当数量的洗涤缓冲区（0.5% 特里顿-100，50 mM 特里斯 pH 8.0，300 mM NaCl，10 mM EDTA，10 mM DTT）中重新悬浮颗粒。再次重复此过程。
   2. 离心机在12，000 x g 10-20分钟。丢弃超纳坦并重新悬浮在悬浮缓冲器中的包容体（50 mM 特里斯 pH 8.0，100 mM NaCl，10 mM EDTA，10 mM DTT）。取出 20 μL 样本（悬念缓冲区中的内含物），用于 SDS-PAGE 以测试内含物的纯度。
   3. 将剩余的预制在 12，000 x g 下，时间为 10-20 分钟。丢弃超纳坦。称重含有内含物的颗粒，并将溶解缓冲液（6 M瓜-HCl、10%甘油、50 m M特里斯 pH 8.0、100 mM NaCl、10 mM EDTA）添加到最终浓度为 30 mg/mL。在 4 °C 下使用磁搅拌器缓慢搅拌，直到内含物溶解在溶解缓冲区。
   4. 离心机 12，000 x g，10-20 分钟。丢弃沉淀物。将内含物存储在 +20 °C 或 +80 °C。
      注:在进行内含物的净化之前，确认重组蛋白的诱导和表达是成功的。在蛋白凝胶上运行来自每个培养物的样本（在 IPTG 感应前后采集）:15% SDS-PAGE（SDS-PAGE 浓缩口香糖:H₂O、30% 丙烯酰胺、1 M 特里斯-HCL pH 6.8、10% SDS、10% APS 和 TEMED;SDS-PAGE 分离凝胶:H₂O、30% 丙烯酰胺、1.5 M 特里斯-HCl pH 8.8、10% SDS、10% APS 和 TEMED;见材料表）为β 2米，10%SDS-PAGE为H链。

4. MHC复合物的重新折叠

注:被重新折叠的内含体的效率将影响获得的蛋白质的产量。折叠与聚合竞争，因此人们普遍认为低蛋白浓度的折叠是最成功的方法。本文中，包容体浓度为30毫克/mL。

1. 准备重新折叠缓冲区。
   1. 根据蛋白质变化重新折叠缓冲的成分。例如，pH 值、离子强度、重氧化条件和配体的存在将影响重新折叠结果。最常见的是使用三叶草或基于 HEPES 的缓冲区，在中性 pH 度下，NaCl 浓度为 50-500 mM，但这也取决于目标蛋白质。以下是本文中使用的重新折叠缓冲公式。
   2. 准备折叠缓冲区与 100 m 特里斯 - Hcl ph 8.0， 400 mm L - 精氨酸， 2 mm Edta - 2na 。
   3. 在 250-300 mL 烧瓶中将缓冲区冷却至 4°C，然后添加 5 mM 减少谷胱甘肽 （GSH） 和 0.5 mm 氧化谷胱甘肽 （GSSG）。在加入内含物和肽之前，在 4 °C 下使用磁搅拌器缓慢搅拌 10-20 分钟。
2. MHC H 链的注射和稀释，β₂米
   注:执行重新折叠的温度可能会有所不同，但一般来说，为了尽量减少聚合，最好是 4 °C。我们用稀释来重新折叠蛋白质。
   1. 使用 1 mL 注射器中的针头，分别将 1 mL 的_h+2m 内含物或_b+2m 内含体注射到两个重新折叠缓冲区（每个 1 升）中。在剧烈旋转的搅拌杆附近注入，以获得快速高效的稀释。_{β 2}米重折叠相对容易，即使在没有H链的情况下保持稳定。
   2. _{β 2}米后溶解在重新折叠溶液中，溶解DMSO中的肽（5毫克/mL），并快速将200μL注入重新折叠溶液中。在添加 H 链之前，缓慢搅拌 10-20 分钟。
   3. 将 H 链注入上述相同的程序，β₂米。H链非常不稳定:因此，注射顺序是相当重要的。将 3 mL 的 H 链内含物分别注入两个不同的重新折叠缓冲区（每升 1 升），带_h+2米或_b+2米。连续注射小点，而不是单次应用全部蛋白质量，可提高重新折叠MHC的产量。允许重新折叠在 4 °C 下进行 8-10 小时。
3. 重新折叠的蛋白质浓度
   1. 使用超滤在加压室与10 kDa MMCO膜浓度的重新折叠蛋白。此方法很方便，可与缓冲器交换相结合。将交换缓冲区（20 mM 三轮车，50 mM NaCl pH 8.0）添加到会议厅，并集中到 30-50 mL 的最终体积。
   2. 将重新折叠溶液转移到离心管中，在 4 °C 下以 12，000 x g 旋转 15 分钟，以去除沉淀物。
   3. 小心地转移超强剂，并进一步集中到最终的体积为~1 mL。
   4. 离心机在12，000 xg 10-20分钟。将超纳坦转移到无菌管中，使用 10/300 GL 尺寸排除柱净化蛋白质。
   5. 在峰值时收集样品，并使用 SDS-PAGE（15% 聚丙烯酰胺凝胶）进行分析。
   6. 收集 MHC 复杂峰值，并集中到 15 毫克/mL 的最终浓度。
   7. 将复合物稀释至 7.5 毫克/mL 和 15 毫克/mL 以进行结晶。

5. 结晶、数据收集和处理

1. 使用坐落蒸汽扩散技术对复杂的 MHC 和肽进行结晶。
2. 使用商业水晶套件（例如水晶屏幕套件 I/II、索引屏幕套件、PEGIon 套件 I/II 和 PEGRx 套件）筛选 Ptal-N*01:01/肽复合物。
3. 在 4 或 18 °C 时密封生成的溶液并平衡 100μL 的储层溶液。
4. 观察3天、1周、2周、1个月、3个月和6个月的晶体生长。使用显微镜观察晶体板中的每一滴是否有晶体。
   注:Ptal-N*01:01/HeV1（b+2m）晶体在浓度为7.5毫克/mL的0.2M纳克、0.1米比斯-特里斯（pH 5.5）和25%（w/v）聚乙烯乙二醇3，350中观察到。Ptal-N*01:01/HeV1（h+2m）晶体在浓度为7.5毫克/mL的0.1 M HEPES、pH 7.0、2%w/v聚乙二醇3，350中观察到。
5. 为了保护低温，将晶体转移到含有20%甘油的储存液中，然后在100K气氮流中快速冷却。
6. 从上海同步辐射设施（中国上海）的光束线BL19U收集X射线衍射数据。

6. 结构确定和分析

1. 使用 Denzo 程序和 HKL2000 软件包 （https://hkl-xray.com/） 23，具有高分辨率结构数据、处理和扩展集合的强度。
2. 在蛋白质数据库 （PDB） 中选择更好的初始模型后，在 CCP4 24（http://www.ccp4.ac.uk/）中使用分子替换与程序相位 MR 进行分子替换确定结构。所使用的模型是与蛋白质数据库 （PDB） 代码 5F1I 的结构坐标。
3. 使用精制的 X 射线模型进行初始联合改进。单独使用菲尼克斯精炼和联合模式进行X射线单独和联合中子和X射线精炼。
4. 每次改进后，手动检查模型对 Fo - Fc 和 2Fo - Fc 正核密度图在 Coot²⁵ （https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/）。这有助于正确放置水和某些D原子。所有结构图均由PyMOL（http://www.pymol.org/）创建。

Results

先前的工作报告说，HeV衍生的 HeV1 （DFANTFLP） 肽是由 Ptal-N*01:01^10，19.在这里，评估了这种肽与Ptal-N*01:01的结合能力，同源蝙蝠_{β 2}米（b+2米）和异质人类β 2

Discussion

在无法使用同源复合物（如 MHC I 及其配体）时，通过不同分类的异质替代构建混合蛋白复合物是功能和结构研究的常见策略。然而，关于方法和技术的总结有限。在这里，分析了蝙蝠MHC I，Ptal-N*01:01，稳定在_b+2米或_h+2m的结构。发现与Ptal-N*01:01结合的_{β 2}米键氨基酸在蝙蝠和人类之间保存。经进一步分析，与MHC I H链_{β 2}米结合的关键残留物在哺乳动物中保存，但在鸡、鱼和两栖动物中多态性。这些数据表明，异质_{β 2}米替代是研究哺乳动物MHC I的可行方法。然而，哺乳动物和鸟类、鱼类或两栖动物之间的替代可能不可行。

结构研究在理解MHC I分子肽表达的分子机制方面发挥着关键作用。异质_{β 2}米替代通常用于MHC I结构研究14，16，17，18，26，27，28。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 kDa MMCO 膜	Merck millipore	PLGC07610
30% 丙烯酰胺	LABLEAD	A3291-500ml*5
5&次;蛋白 SDS 加载	新蛋白	PM099-01A
AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa 截留	默克 millipore	UFC901096
氨苄青霉素	Inalco	1758-9314
APS	Sigma	A3678-100G
BL21（DE3） 菌株	TIANGEN	CB105-02
DMSO	MP	219605580	戴上合适的手套和眼睛/面部防护装置。如果接触到眼睛，请立即用大量清水冲洗并就医。
DTT	Solarbio	D1070	应佩戴手套和护目镜，并在通风的厨房中作。如果接触到眼睛，请立即用大量清水冲洗并就医。
EDTA-2Na	KeyGEN BioTECH	KGT515500
甘油	HUSHI	10010618
GSH	Amresco	0399-250G
GSSG	Amresco	0524-100G
盐酸胍	Amresco	E424-5KG
hβ2m	我们的实验室		Zhang， S. et al. 由两个 HIV 衍生的肽复合物揭示的 HLA-A*0301 和 HLA-A*1101 交叉等位基因呈递的结构基础。分子免疫学。49 （1-2），395-401，（2011 年）。
IPTG	Inalco 英纳克	1758-1400
L-精氨酸盐酸盐	Amresco	0877-5KG
NaCl	Solarbio	S8210
蛋白质标志物	发酵物	26614
SDS	博鳌瑞晶	A112130
Superdex 增加 200 10/300 GL	GE Healthcare	28990944
TEMED	Thermo	17919	应佩戴手套和护目镜，并在通风的厨房内作。
Tris-HCl	Amresco	0497-5KG
Triton X-100	Bioruler	RH30056-100mL
胰蛋白胨	Oxoid	LP0042
酵母提取物	Oxoid	LP0021