本文介绍的方案提供了关于实时同步进行脑电图（EEG）和行为学评估的信息。我们详细阐述了该方案所涉及的全部步骤，为神经科学多个领域的研究人员，特别是学习与记忆领域的研究者，提供了一种具有吸引力的解决方案。
方法文章
同步监测无线电生理信号与记忆行为学测试作为研究海马神经发生的一种工具
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
通过脑电图（EEG）获得的脑电波振幅已被广泛认可为动物和人类认知能力、记忆和学习的基础。成年神经发生机制也与记忆和学习能力的提升相关。传统上，研究人员通过行为学任务来评估啮齿类动物模型中的学习和记忆参数。因此，同时监测行为变化和脑电活动在关联脑部活动与任务相关行为的数据方面具有重要意义。然而，开展这两项研究所需的大多数设备要么结构复杂，要么价格昂贵，或采用有线连接系统，限制了动物的自然活动。在本研究中，采用无线电生理设备记录脑电图，同时执行新物体识别任务（NORT），并通过视频追踪系统同步监测动物行为。两组记录数据均通过时间戳进行离线分析，并经同步处理以关联脑电信号与动物行为。研究对象为经过中期环境富集处理的成年Wistar大鼠。在双侧半球的额区、中央区和顶区，成对植入六枚颅骨螺钉电极，并以位于鼻骨后方的电极作为参考电极。新物体识别任务（NORT）的实验流程包括：先让动物在10分钟内接触两个相同物体；在2小时和24小时后，将其中一个物体替换为新物体。通过行为追踪软件（BTS）和脑电数据记录系统监测动物对每个物体的探索时间。对与行为数据同步的脑电图分析包括估算α和β频段的相对功率，并比较在三个实验阶段中新物体识别与熟悉物体探索之间的差异。在本论文中，我们详细讨论了电极的制备过程、硬膜外电极植入手术、环境富集方案、新物体识别任务（NORT）流程、行为追踪系统（BTS）的设置、脑电图与行为追踪系统（BTS）的耦合以实现同步实时监测，以及基于自动事件检测的脑电数据处理方法。
引言
行为学测试在神经科学研究中至关重要，因其能在活体环境下产生大量信息。为此，研究人员已广泛使用多种行为学测试来分析感觉运动功能、社会互动、类焦虑和类抑郁行为、物质依赖以及各种认知功能1。即使是经验最丰富的观察者，手动记录行为学测试也可能困难、耗时且不准确。尽管已有部分努力致力于开发用于行为记录的免费开源软件（例如用于性行为研究的 sexrat male2 应用程序），但目前已有多种替代方案可实现从鱼类3到啮齿类动物4,5,6等不同动物物种的自动且实时的行为记录。视频追踪是一种在多种应用中用于快速准确记录行为的有价值方法7。在行为记录领域中一个更具潜力的方向是探索行为表现过程中的神经活动。同时记录神经元活动（从单个细胞到大脑主要区域）与行为任务，有助于揭示大脑如何产生特定的行为模式8。行为是由一系列微小成分组成的序列，这些成分可能揭示神经活动与运动或动作之间的关联。如果能够在多个时间尺度上同步记录神经元活动和行为模式，则有望阐明每种脑状态与特定行为之间的对应关系（有关行为记录的深入探讨，参见 Datta 等人于2019年的综述8）。因此，在所需尺度上（从单个神经元到大脑大范围区域）同步记录行为与神经活动，被认为是一种极为有用的工具。目前已有多种系统旨在将行为记录与其他测量手段（如神经活动）相结合4,5。
尽管脑电图（electroencephalography）被认为是临床和神经科学研究领域中应用最广泛的技术之一，但其记录设备相对较大的体积和有限的移动性，使得该技术在活体模型检测中具有独特性与挑战性9。针对这一问题，已有若干解决方案被提出，例如使用电缆和旋转装置，使动物能够在实验区域内自由活动。然而，基于电缆的系统在研究过程中常带来诸多问题，例如在将动物从一个笼子转移到另一个笼子时，常出现电缆阻碍或缠绕动物的情况。为提高记录的灵活性，已开发出用于无线电生理记录的遥测设备10,11。但此类系统由于记录通道数量较少且采样率较低，表现出明显的局限性11。在本研究中，我们采用了一种 commercially available 的无线系统，该系统通过 Wi-Fi 连接将动物的脑电信号传输至自由活动啮齿类动物记录系统12。该装置重量为 6 克，最多可支持 16 个通道，采样速率为 1 kSps。该系统可在尽量减少干扰的情况下，在动物自然环境中进行脑电（EEG）或神经元放电记录，相较于市场上传统的电生理系统，具有更高的经济性。此外，我们还利用视频追踪软件对数据进行同步，以实现脑电活动与行为模式之间的关联分析。该同步过程通过两个系统生成的时间戳对数据和事件进行离线对齐与插值完成，并在 MATLAB 中进行处理。
成年神经发生是指在动物齿状回中新生细胞的增殖、存活及其向神经元的分化过程13,14。该过程被认为与记忆和学习能力的改善相关，通过丰富环境（EE）条件可增强啮齿类动物的成年神经发生15。丰富环境是指将啮齿类动物以小群体方式饲养于大型笼具中，并提供玩具和管道等物品，使动物接触新颖而复杂的刺激，但这些刺激不具有生物学意义15。尽管丰富环境能够促进海马神经发生，但其效果受多种因素影响，如动物年龄、品系、特定刺激条件或神经发生检测方法等。在中年小鼠中，已有研究报道，在暴露于丰富环境饲养7天后，海马齿状回（DG）中出现了新生颗粒细胞（GC）16。一些尝试选择性消除成年大鼠神经发生的研究表明，约1–2周龄的新生颗粒细胞对学习反应是必需的17。在成年DG中新生成的GC约2至3周后，开始出现多种特征性结构，例如树突棘，这些结构对兴奋性突触传递至关重要18。Zhao等人进行了定量分析，显示树突棘生长的高峰期出现在出生后的前3–4周19。多项体内电生理研究表明，仅需三周的丰富环境饲养即可引起DG突触传递的改变，并提高细胞兴奋性20。此外，已有报道指出，在BrdU注射后1–4周暴露于丰富环境，可显著增加小鼠DG颗粒层中BrdU/NeuN双标细胞的密度21。这些作者认为，丰富环境暴露后1至3周之间存在一个关键时期，因为在该阶段观察到了新神经元数量的显著增加21。关于人类成年海马神经发生（AHN）的研究一直存在争议，因缺乏直接证据。然而，最近一项研究报告了人类成年大脑中AHN的发育阶段，在DG中鉴定出数千个未成熟神经元，从而证明了AHN在人类衰老过程中的重要性22。基于上述证据，对动物模型中AHN的研究比以往任何时候都更加重要（有关AHN的深入探讨，参见Leal-Galicia等人的2019年综述15）。
如前所述，海马体已被证实与学习和记忆能力的基本功能密切相关。记忆的形成经历三个不同的过程：编码（记忆获取）、巩固（记忆存储）和提取（记忆识别）23。人类的识别记忆通常通过视觉成对比较任务进行测试24。人类及动物记忆与遗忘模型的基础是行为学测试，这些测试用于评估识别先前呈现刺激的能力25,26，视觉成对比较任务在人类中的应用即为此类测试之一。因此，用于评估啮齿类动物识别先前呈现刺激能力——即学习与记忆能力——最常用的行为学测试之一是自发性新物体识别任务（NORT）23,27。NORT 的实验方案通常包括：在获取阶段，将两个相同的新物体放入熟悉的环境中，让动物自由探索10分钟。在经过一段特定时间（根据具体实验方案而定，通常为028至48小时29）后，将动物再次放入同一环境中，其中包含一个此前熟悉的物体和一个新物体。若动物已记住熟悉的物体，则会自发地更多探索新物体26。评估探索行为表现时通常使用偏好比率，即用对新物体或熟悉物体的探索时间除以总的物体探索时间。与其他识别记忆测试相比，NORT 具有若干优势：最重要的是，该任务无需外部动机、奖励或惩罚；不会引发应激状态；此外，无需预先训练即可诱发动物对物体的探索行为（有关 NORT 的更深入探讨，参见文献23）。
因此，作为成年海马体神经发生效应的学习与记忆研究中，多种数据模态的同步记录及其整合具有极高的吸引力，为该领域的研究人员提供了一种强有力的解决方案。本文将详细介绍同时进行行为视频追踪评估（新物体识别任务）和无线脑电图记录所涉及的全部流程。本文综述了电极制备过程、硬膜外（颅骨螺钉）电极植入手术、环境富集方案（用于诱导海马体神经发生）、后续的新物体识别任务（NORT）方案、行为追踪系统（BTS）设置、脑电图与行为追踪系统的耦合以实现同步实时监测，以及在MATLAB计算环境中进行的脑电图和行为数据的分析。
方案
所有操作均遵循《实验动物护理和使用指南》（NIH出版物N°. 8023，1978年修订）以及墨西哥当地法律，以减少动物使用数量，保障动物福利并禁止动物遭受痛苦。本研究中动物实验方案已获得伊比利亚美洲大学伦理委员会批准。
1. 通用设置
- 根据制造商的说明，在计算机上安装行为追踪软件。
- 将摄像头正上方固定于设备上方，使其朝下对准。摄像头应连接至计算机。
- 安装摄像头所需的驱动软件（遵循制造商的说明）。
- 如果摄像头配有变焦镜头，请调整镜头，使其在摄像头显示画面中完美适配。
- 根据制造商的软件说明，关闭摄像头的自动对焦（AF）模式。
- 确保摄像头能够正常实时工作，并测试视频采集模式，直至准备就绪可用。
2. 环境富集方案（见图1）
注意：本实验使用三个月大的雄性Wistar大鼠，在自然明暗条件下饲养。
- 在透明亚克力方形实验箱（500 × 500 × 500 mm）中放置木屑垫料。
- 在实验箱内放置三种不同类型供啮齿类动物互动的玩具（例如活动轮、双层结构、台阶等）。
- 添加四根2英寸长和四根弯曲的灰色不透明PVC管。
- 提供食物和饮水装置，使动物可自由取用（ad libitum）。
- 每笼饲养三只动物，置于动物房常规条件下。
- 根据相应实验方案要求的时间将动物留置于该实验箱中。本实验中，动物应在箱内饲养20天。
注意：电极植入手术后，动物不再返回环境富集处理条件，而是转入单笼饲养，直至完成新物体识别测试。
3. 电极制造过程
- 剪取一段长约 2 cm 的铜线，并用砂纸打磨每端约 0.5 cm 处。
- 将铜线一端缠绕固定在小型螺钉（电极）头部，并确保其牢固连接，此步骤至关重要。必须保证两种材料之间接触良好，以避免脑电（EEG）信号中产生伪迹。
- 将另一端插入连接器的端部触点，并使用精细镊子加固，确保其固定稳妥。该触点将与放大器电缆相连接。
- 使用万用表测量从端部触点至螺钉之间的导电性。此步骤可确保电极连接正确安装。
4. 硬脑膜外（颅骨螺钉）电极植入手术
注意：在经过20天的环境富集处理后，动物将按照以下所述步骤接受手术：
- 向动物腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪混合物（90/10 mg/kg，i.p.）。
注意：为避免气道阻塞，请等待大鼠停止活动后，再将其从饲养笼中取出并置于平坦表面上。 作为预先镇痛措施，皮下注射非甾体抗炎药（美洛昔康 1 mg/kg，s.c.）和口服抗生素（恩诺沙星 2.5 mg/kg，p.o.）。 - 当大鼠完全麻醉后，剃除其头部区域的毛发。
注意：在继续手术前，务必确认动物已完全麻醉。可轻轻夹捏其一条腿或尾巴进行测试。若动物对刺激有反应，则需等待数分钟后再次测试。若无反应，则进行下一步操作。如有条件，强烈推荐使用气体麻醉（如异氟烷），因其更易于精确调控，安全性更高。 - 将动物固定于立体定位仪上，首先用耳杆固定双耳（注意避免损伤内耳结构），然后将门齿置于门齿杆上，并固定鼻杆。
注意：在整个手术过程中应为动物提供加热垫，因为本实验所用麻醉剂通常会引起低体温和呼吸问题。 - 使用氯己定或含碘消毒液进行头部皮肤清洁，交替进行三次消毒擦拭，每次后用生理盐水或酒精冲洗。
- 在头部皮肤下皮下注射利多卡因（20 mg/mL，0.5 mL）。
- 每5–10分钟向动物双眼滴注一次眼用溶液或生理盐水，以防止角膜干燥。
- 使用手术刀从前往后方向做一条长约2 cm的切口，充分暴露颅骨顶部区域。
- 使用止血钳牵开皮肤，并刮除覆盖在颅骨表面的软组织。
- 识别并记录前囟（bregma）的坐标位置。
- 以前囟为起点，参照立体定位Paxinos与Watson图谱30，定位并标记七个电极植入点（坐标）的位置。
注意：本实验中，F3、F4螺钉（前囟前2.0 mm，中线外侧2.25 mm）；C3、C4螺钉（前囟后3.0 mm，中线外侧2.75 mm）；P3、P4螺钉（前囟后7.0 mm，中线外侧2.75 mm）被植入。第七个螺钉位于鼻骨后方（NZ），作为接地参考电极（见图2）。 - 使用可调速钻具，在每个标记点处用2号钻头（长度44.5 mm）钻孔，注意不要完全穿透颅骨。
- 将电极插入孔中，并小心旋入颅骨。
- 重复步骤4.10 和4.11 ，直至全部七个螺钉均被正确固定。
- 先用一层牙科水泥固定全部7个螺钉。将各电极连接至接头，再用第二层牙科水泥完全覆盖导线及接头底部（以防止动物自行拉脱螺钉）。必要时可加第三层牙科水泥，但需保持脑电（EEG）接头清洁，以便后续连接设备时接触良好（见图3）。
注意：每植入一对双侧螺钉后，可立即用牙科水泥初步固定（可选步骤）。 - 术后将大鼠留置观察过夜。术后1–2小时内继续使用加热垫，并密切观察动物状态，以应对麻醉可能引起的低体温和呼吸问题。
- 皮下注射生理盐水50 mL/kg/24 h（维持剂量），以预防脱水。术后立即及术后24小时内，皮下注射非甾体抗炎药（美洛昔康 2 mg/kg，s.c.）和口服抗生素（恩诺沙星 5 mg/kg，p.o.）。
- 手术后将大鼠单独饲养，确保其充分恢复至少七天，之后再进行行为学测试。
- 在术后一周内定期（至少每天一次）轻柔地操作动物，以减少未来操作时的应激反应。单手握住大鼠的同时，用手指轻压其背部，沿毛发方向滑动手指。每日检查头部伤口、整体健康状况、行为表现及体重变化。
注意：若发现任何异常或疾病/应激迹象，应立即通知负责的兽医。在此恢复期结束后，开展新物体识别实验及脑电图记录技术。
5. 新物体识别测试（NORT）
注意：手术后七天开始进行行为学测试。本实验中的所有行为学操作均在14时00分至16时00分之间进行，该时间段对应大鼠的光照周期。
- 将由柔软织物制成的背心（在行为测试期间用于固定脑电图设备）穿在大鼠身上。在进行行为测试前，让大鼠适应2-3天。
- 在光线较暗的记录室内放置一个黑色亚克力材质的方形实验箱（500 × 500 × 500 mm）。
- 使用双面胶带将两个相同的新型物体固定在实验箱底部中央位置（以防止动物移动物体）。物体之间以及物体与箱壁之间的距离应相等。
- 每次试验前，需用50%乙醇彻底清洁每个物体，并在每次试验后清洁实验箱的底面（以避免留下嗅觉线索）。
注意：每次测试开始前，应至少提前半小时将动物从饲养室（动物房）转移至实验房间。记录结束后，让动物在实验室内再停留一小时，以避免因应激反应影响测试表现。 - 每次测试开始前连接脑电图设备。轻轻固定动物，将电缆牢固插入动物头部的连接器中，同时将脑电图设备固定在动物背部（参见 图4）。连接位置必须唯一且准确。
注意：测试前对动物进行温和的操作有助于减轻连接过程中的应激反应；否则，可能增加设备或动物受损的风险。请在使用前通过USB端口将设备电池完全充满。 - 新物体识别测试的各个阶段
- 适应期：连续两天，每天以5分钟为间隔多次抓取并处理动物，随后立即将动物放入无任何物体的实验箱中，自由探索10分钟。
注意：在执行任何学习与记忆测试前，需仔细处理大鼠，并将其连接至相应的脑电图设备，确保设备在测试开始前已牢固固定。 - 学习阶段：将动物放置于实验箱内，使其面朝与物体相对的箱壁一侧。允许动物自由探索10分钟。转至步骤6.13，使用行为追踪软件进行测试记录。
注意：确保脑电图设备牢固地固定在大鼠背部的背心上（以保障动物行为的准确追踪）。如有需要，可使用医用胶带进一步加固。 - 短期记忆测试（SMT）：将其中一个物体替换为在形状、颜色和质地方面完全不同的另一物体。在学习阶段结束后2小时，将动物再次放入实验箱，使其面朝与物体相对的箱壁一侧。允许动物自由探索10分钟。转至步骤6.13，使用行为追踪软件进行测试记录。
- 长期记忆测试（LMT）：将短期记忆测试中使用的物体替换为另一个在形状、颜色和质地方面完全不同的新物体。在学习阶段结束后24小时，将动物放入实验箱，使其面朝与物体相对的箱壁一侧。允许动物自由探索10分钟。转至步骤6.13，使用行为追踪软件进行测试记录。
- 适应期：连续两天，每天以5分钟为间隔多次抓取并处理动物，随后立即将动物放入无任何物体的实验箱中，自由探索10分钟。
6. 行为追踪软件设置
- 打开行为追踪软件。
- 使用机构的用户名和密码登录账户。
- 打开旋塞新实验空白”并为该方案命名（例如，“NORT”）。
- 选择“视频追踪模式。”
注意：本实验中，摄像头设置为实时流式传输视频跟踪画面。但也可选择预先录制的视频进行分析。 - 前往“仪器设备。通过调整橙色矩形至投影区域的边界来定义实验区域范围。通过将橙色圆形拟合到屏幕中摄像头投影的实验区域内物体的边缘，确定物体所在区域。
- 将移动标尺线设置在图像已知长度（即实验 arena）的适当位置，在“选项”中输入该物体的毫米长度标尺线的长度为” 设置面板中。本实验中，实验区域尺寸为 500 x 500 mm。
- 前往“追踪与行为。”继续进行“区域。”点击“添加项目” 菜单并选择 “新区域选择实验区域并命名新区域（例如，“Field”）。
- 用物体所在区域重复上一步操作，并将新区域命名为（例如，“物体”）。
- 前往“动物颜色”并选择“动物的体色比装置背景浅” 选项。
注意：本实验使用了白色（Wistar）大鼠。然而，该软件还为使用黑色和花斑大鼠的研究人员提供了额外选项。两种品系的动物可在同一实验中同时使用。 - 前往“追踪动物的头部 & 尾部”并选择“是的，我希望同时追踪动物的头部和尾部.”
- 前往“测试” | “阶段，”然后从菜单“添加项目，“选择”新阶段命名新阶段，“数据采集定义该阶段的持续时间（例如，600 s）。
- 重复之前的步骤“短期记忆测试” 和 “长期记忆测试阶段。
注意：在本方案中，所有阶段的持续时间均相同（10 分钟）。 - 前往“实验步骤定义每个阶段（获取阶段、短期记忆测试和长期记忆测试）中需要追踪的事件。
- 开始测试（对每只动物）。进入“测试”（位于顶部菜单栏）并选择“添加测试（+）为待测动物分配一个编号（例如，“1”）。
- 选择“记录”并为动物和实验会话命名（例如，“M1 Acq”）。
- 在将动物放入实验区域之前，单击一次“播放”按钮。此时将显示“等待开始”消息。
- 将动物放入实验区域后，再次点击“播放“按钮。测试将自动开始和结束。
- 对短期记忆测试（获取阶段后2小时）和长期记忆测试（获取阶段后24小时）重复执行步骤6.13–6.16。
7. 无线电生理设备设置
- 将调制解调器连接到主机电脑并打开电源。关闭电脑上所有其他网络设备。最好同时关闭登记房间内的其他无线通信设备，例如蓝牙、手机、其他调制解调器，甚至无线电话手柄。
- 按照步骤 5.5 所述，将放大器固定在大鼠背部。
- 插入电池以开启脑电图（EEG）设备。
注意：设备连接后 2 秒，脑电图放大器上的红色 LED 灯会闪烁，表示与调制解调器的通信已激活，随后绿色 LED 灯将亮起。若通信成功，调制解调器上的 LED 灯将开始持续闪烁。此时放大器已准备就绪，可向调制解调器发送信息。 - 启动脑电图软件，并根据制造商说明进行设置，以与无线脑电图采集设备集成。
- 按下“开始显示”按钮。脑电图软件将显示实际的信号采集过程。
注意：使用“Windows 任务管理器”将程序设置为“实时”优先级模式，以避免在实验过程中丢失信息。
8. 脑电图（EEG）信号记录
- 确认脑电图（EEG）软件正在采集数据后，启动行为追踪软件，并设置实验方案，以验证动物位于观察区域内且系统运行正常。
- 此时，点击“开始记录”按钮，启动脑电图软件的记录。在确认信号采集正常运行后，开始在行为追踪系统（BTS）中进行实验。
- 实验结束后，返回脑电图软件并停止记录。记录文件将按默认命名规则保存，文件名格式为：“yyyy-mmdd-hhmm_受试者编号_Ephys.plx”。默认情况下，所有记录文件均保存在脑电图软件（NeurophysData）文件夹中。
- 检查两个数据文件是否均已生成。记录实验日志或更改文件名，以避免混淆。
9. 行为任务与脑电图信号同步
- 打开 MATLAB 并执行命令：convert_plx2mat。该函数将打开一个浏览器窗口。转换函数由制造商提供，必须添加到 MATLAB 的路径中。
- 选择要转换的 *.plx 文件，然后在 MATLAB 命令行中按“Enter”键，以默认参数进行转换。
- 打开 BTS 实验文件，进入“Protocol”（协议）选项。点击“Results, reports and data”（结果、报告和数据），选中两个物体的所有事件，然后点击“Choose the time format for the report”（选择报告的时间格式），选择第三项：“Show events times as real-time in HH:MM:SS.sss - for example 13:20:14.791”（以 HH:MM:SS.sss 格式显示事件时间，例如 13:20:14.791）。
- 现在进入“File”（文件）菜单，点击“Export”（导出），再点击“Export experiment as XML”（将实验导出为 XML），勾选“Date and time of the test”（测试的日期和时间），最后点击“Create XML”（创建 XML）。
- 进入“Export test data”（导出测试数据），点击“Save Data”（保存数据）。将生成一个包含事件时间的 .csv 文件。
- 对每个文件重复步骤 9.1 至 9.5。在本研究中，三个实验分别为：ACQ、STM 和 LTM。
- 在 EEG 和行为文件转换完成后，将它们统一存放在一个文件夹中。该文件夹应包含六个文件，分别为三个 .mat 文件和三个 .csv 文件。在本研究中，文件命名为：PID_01_ACQ_N.mat、PID_02_STM_N.mat、PID_03_LTM_N.mat、PID_01_ACQ_M.csv、PID_02_STM_M.csv 和 PID_03_LTM_M.csv。其中 ID 表示动物的编号。
- 在 MATLAB 中打开“procesa_sujeto.m”函数，并将第二行代码调整为对应动物的 ID。
- 将 MATLAB 当前目录切换至该文件夹，然后执行“procesa_sujeto”命令，以生成与 ACQ、STM 和 LTM 阶段物体识别相关的 alpha 和 beta 频段相对功率的图表。
注意：“procesa_sujeto”是一个执行多个信号处理分析的函数。这些分析在步骤 9.10 至 9.15 中总结如下。 - 使用四阶巴特沃斯带通滤波器对每个 EEG 信号在 [5–40] Hz 范围内进行滤波，并采用相位校正。
- 在进行后续分析前，对信号进行目视检查，排除因电极放置不良或动物活动导致信号失真的通道，这些通道不再参与进一步分析。
- 将信号参考至公共平均值，以减轻运动伪迹的影响。
- 根据 BTS 提供的时间戳对 EEG 信号进行分段，形成长度为 4 秒的片段。目标事件为动物探索物体的行为，由动物与物体边界的距离标记。这些事件在 BTS 的时间戳中标记，并用作确定时间窗位置的标识符。因此，每个 EEG 片段的时间范围为探索开始前 1 秒至探索开始后 3 秒。在此阶段，未对探索时长进行有效性验证，但将在未来的研究中予以考虑。
- 采用 Welch 周期图法估计这些片段的功率谱密度，使用 1 秒的时间窗长度、90% 的重叠率，并在傅里叶变换前应用汉宁窗。通过这些参数设置，实现了 1 Hz 的频率分辨率。
- 通过计算周期图下面积来评估各频段的功率谱，所呈现的数值为相对能量，即每个 EEG 频段的能量除以该片段的总能量。该处理方法还可减少因 EEG 信号伪迹导致的能量估计误差。
结果
上述方法用于在环境富集处理后同步记录大鼠脑电图（EEG）及活动情况。将3月龄雄性Wistar大鼠置于为期20天的中期环境富集处理方案中，并通过手术固定六枚颅骨螺钉电极，分别位于额区、中央区和顶区，参考电极为位于NZ位置的第七枚电极。动物维持在自然的明暗循环条件下， 随意摄取 自由饮水和进食。本研究展示了脑电图系统与行为追踪软件的整合，以实现同步实时记录。我们仅使用了经过环境富集（EE）方案处理的动物，因为本研究目的并非比较治疗效果，而是仅用于说明设备的优势。为证明所采用的20天环境富集饲养方案能够促进成年神经发生，我们展示了来自本实验室未发表数据中处于环境富集（EE）条件与标准饲养条件下动物的BrdU阳性细胞计数结果。实验使用三个月大的雄性Wistar大鼠，每只动物间隔12小时注射BrdU三次。动物经戊巴比妥钠（50 mg/kg，腹腔注射）麻醉后，通过经心灌注实施安乐死（见 图5）。为了确保连接脑电图（EEG）设备的背心不限制动物活动，我们将动物分为两组进行旷场实验（OFT）：一组动物在佩戴设备（背心和EEG放大器）的情况下接受手术，另一组动物则保持完整，不佩戴任何硬件。在10分钟测试期间，我们未发现两组动物移动距离存在显著差异（见 图5）。典型的NORT实验流程包括呈现两个物体，随后将其中一个替换为新物体。行为追踪软件用于监测探索时间。
行为追踪软件记录了一组动物，以评估其关键性能参数。因此，我们采用三个参数来评估探索表现。偏好比率通过计算动物头部在物体区域停留的时间得出，该指标反映动物头部在每个物体所在区域停留的总时长。此外，我们还计算了动物朝向物体移动时间的偏好比率，该指标显示每只动物朝向各个物体区域移动所花费的总时间。另外，还计算了每次访问各物体的平均停留时间。图6展示了上述三项参数的结果。在获取试验中，三个评估参数之间均未观察到显著差异：三次试验中动物头部在物体区域的停留时间、朝向物体移动的时间，以及每次访问各物体的停留时间。在短期记忆（STM）试验中亦未发现显著差异。然而，在长期记忆（LTM）试验中，动物对新物体的探索偏好比率显著更高。此外，在LTM试验中，每次访问的停留时间参数也显示出对新物体的偏好（见图C）。视频1展示了实验中记录的一只大鼠的代表性示例，而视频2则展示了同步脑电图（EEG）与行为记录的代表性示例。
通过计算机时钟，可以将行为追踪软件与脑电图（EEG）软件记录的时间事件进行匹配。图7 和 图8 展示了α和β频段脑电相对功率的变化。这些频段与运动控制、注意力集中和记忆功能相关，提示探索行为可能仅与这些功能有关。动物3的结果显示，在短期记忆（STM）阶段，α波功率相较于获取（ACQ）和长期记忆（LTM）阶段有所下降，提示这可能与探索行为或记忆提取相关的去同步化有关。物体识别的数量（已处理的脑电片段）较少。目前尚无法确定统计检验是否能验证该差异的真实性，或此类实验条件下是否存在人为伪迹。然而，通过对动物行为和脑电结果进行同步标记事件的时间线分析，已实现了脑电片段的分割、标注与分析，为未来的研究项目提供了可能。结合这些系统可避免手动标记过程中对事件的错误识别，而后者在动物实验中已成为一个显著问题。行为追踪系统（BTS）与电生理（EP）活动可被精确关联至动物行为；然而，实验条件需要采用先进的信号处理技术以消除运动伪迹，并有效改进实验设置。
图1：丰富化环境（EE）条件下的笼具示例。笼具中提供玩具和管道，动物可在其中接触新颖且复杂的刺激，但这些刺激无生物学相关性。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：大鼠颅骨上硬膜外电极的位置。 螺丝同时用作耳机的固定锚点和电极。F = 额部；C = 额顶区；P = 顶区；3 = 左侧；4 = 右侧；NZ = 作为接地参考点。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：硬膜外（颅骨螺钉）电极植入手术的代表性图像。图像显示大鼠在手术不同阶段的颅内电极螺钉植入情况。进行该操作时，务必遵循无菌技术。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：大鼠及其实验装置的代表性图像。在新物体识别（NORT）实验协议所用的实验箱内，大鼠被穿上与脑电图（EEG）设备相连的背心，该设备内置电池。图像显示了安装在大鼠头部的头戴装置及电缆连接器。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：环境富集（EE）方案对运动能力及成年神经发生的促进作用证据。（A）动物在旷场实验（OFT）中持续10分钟的活动代表性图像，以及佩戴设备/接受手术动物与未佩戴设备/未接受手术动物的平均运动距离。（B-E）环境富集组与标准饲养组齿状回（DG）中BrdU标记细胞（深色强染）的代表性切片。图B和D显示DG的低倍镜图像，图C和E显示方框区域的高倍镜图像。图B和C来自环境富集饲养组组织，图D和E来自标准饲养组组织。插图展示了两组中标记细胞的平均数量。ML — 分子层；GCL — 颗粒细胞层；SGZ — 颗粒下区；箭头 — BrdU+细胞。图表显示均值 ± 标准误（SEM）。组间比较采用Student t检验。* p≤0.05。旷场实验中各组之间未发现显著差异。请点击此处查看该图的放大版本。
图6：新物体识别测试（NORT）中的探索表现。（A）三次试验中在物体区域的头部朝向时间。（B）三次试验中朝向物体的运动时间。（C）每次访问各物体的停留时间。图中数据以均值 ± 标准误（SEM）表示。所有参数均采用双因素重复测量方差分析（ANOVA），并进行Sidak多重比较检验。* p≤0.05，** p≤0.01，表示同一次试验中不同物体之间的差异。请点击此处查看该图的放大版本。
图7：与探索行为相关的alpha频段脑电功率变化。本图展示了动物开始探索物体后0.5秒至2.5秒期间相对alpha波段功率的变化。六个图表分别对应额区、中央区和顶区电极（从上到下）以及左右两侧。箱线图显示了每种条件组合下时间序列的分布情况，条件包括物体类型：“熟悉”和“新颖”，以及阶段：“ACQ”、“STM”和“LTM”。请点击此处查看该图的放大版本。
图8：与探索行为相关的β频段脑电功率变化。本图显示了动物开始探索物体后0.5秒至2.5秒期间相对β频段功率的变化。六个图表分别对应额区、中央区和顶区电极（从上到下）以及左右两侧。箱形图展示了每种条件组合下时间序列的分布情况，物体类型分为“熟悉”和“新颖”，阶段分为“ACQ”、“STM”和“LTM”。请点击此处查看该图的放大版本。
视频1：实验中记录的大鼠代表性视频。 大鼠位于用于新物体识别测试（NORT）方案的实验区域内，身上穿着背心，背心连接着带有内置电池的脑电图（EEG）设备。 请点击此处下载该视频。
视频 2：同步进行脑电图和行为记录的代表性视频。 脑电图信号显示在视频左侧，行为学实验（新物体识别实验，NORT）显示在视频右侧。请点击此处下载该视频。
讨论
行为学与脑电图研究本身具有较高的难度和挑战性。因此，将这两种技术结合使用时，存在诸多关键性的技术难点，导致目前尚无广泛采用的同步联合技术。在实际研究中，全球各研究团队在开展行为学实验时均采用各自特定的实验条件，例如动物种类、分析参数或处理方式等。上述差异在该领域内引发了显著的争议，并凸显了建立一套可供所有人使用的标准化操作流程的必要性。本文旨在提供一套详尽的操作流程，涵盖大多数已发表文献中通常未予描述或提及的关键步骤及方法学考量。以下将对此进行详细讨论。
所需材料的制备是该技术成功的基本步骤。在此方面，电极需要使用不锈钢螺丝、铜缆和银焊料从头制作。这些材料很难永久性地焊接在一起，因此必须在使用前验证每个电极的导电性和机械强度。可以使用其他类型的导线组装电极；然而，铜线具有足够的柔韧性，便于调整电极以插入放大器连接器。因此，使用商用电极是理想选择，但其采购可能较为复杂且昂贵。手术是本方案中最关键的步骤之一。强烈建议甚至必须由经验丰富的外科医生进行操作，尤其是电极植入过程。由于手术通常需要延长麻醉时间，有时还需在术中进行焊接操作，因此每个实验室必须针对不同品系的啮齿类动物（可使用不同的麻醉混合配方）进行必要的测试，特别是在动物房条件下，还需考虑不同窝别甚至个体间的差异。充分的术前规划和注意事项可避免手术过程中动物的损失。电极植入是另一个关键步骤，需格外小心以避免刺穿颅骨或损伤脑膜及脑组织。螺丝应正确放置，即完全固定于颅骨中，否则信号中将出现噪声和伪迹，例如与不良定位或非脑电记录相关的运动所产生的干扰。术前和术后处理及饲养条件必须始终严格执行和观察，以避免啮齿类动物遭受痛苦。在使用手术刀切开皮肤前，可在头部皮肤皮下注射利多卡因。向动物眼睛滴加一滴生理盐水有助于防止干燥。此外，需经口腔给予生理盐水溶液，术后还应皮下或腹腔注射1 mL生理盐水，以维持动物体液平衡并预防脱水。手术后应立即在头皮周围（即牙科水泥帽所在区域）直接给予抗炎药物（以减轻疼痛）以及皮下或局部使用的抗生素（以降低感染风险）。上述操作应在术后24小时重复一次。将脑电放大器固定于动物背部是实现同步记录的主要难点。背心的设计与制作需根据动物体型专门定制，必须允许啮齿类动物自然活动（见图5）。这一设计将确保该技术的主要优势——自由活动状态下的脑电记录得以实现。由于动物在术后及后续数天内未尝试移除背心、头部连接器或电缆，因此可认为该装置并未造成显著的运动限制或引起疼痛与不适。为了基于BTS标记的事件对脑电信号进行正确的时间段分割，必须制定一份定义清晰的操作流程。由于两个系统使用相同的时钟进行时间戳设定，因此可通过时间序列处理将临时标记合并。上述特点进一步拓展了将电生理数据整合入动物实验分析的研究可能性。
本文介绍的技术可应用于神经科学研究的各个领域，并适用于最常见的鼠类物种，甚至其他物种。行为追踪软件的多功能性是其最重要的优势之一，因为它可用于多种迷宫实验，如莫里斯水迷宫、旷场实验、新物体识别、条件性位置偏爱、孔板实验、高架十字迷宫、Y迷宫、放射臂迷宫、巴恩斯迷宫等。该系统可同时支持最多16个摄像头。此外，可报告数百种不同的测量指标（更详细信息请参见手册31,32）。需注意的是，本研究描述的是用于脑电图（EEG）记录的实验方法，但也可应用于其他技术，如局部场电位或单细胞记录。然而，用户必须意识到，针对不同用途，整体装置和多个准备步骤均需进行相应调整。因此，当该技术与EEG无线记录结合使用时，其应用范围得以进一步拓展，为动物研究提供了新的视角，例如类似于人类研究中对EEG整合与动态特性的评估，包括功能连接、EEG频段功率或诱发电位等。与人类研究不同，动物实验可实现药物干预、基因修饰或表达调控等多种实验范式。在EEG分析方面，需注意某些实验方案中目标行为的重复次数极少，这限制了对响应信号进行平均处理以获得可靠结果的可能性。因此，在实验开始前，务必谨慎设计记录与分析方案。然而，必须认识到，在动物实验中无法完全限制其运动，这增加了实验方案设计以及信号分析和行为任务的复杂性。目前，完整的行为追踪系统与EEG记录设备尚未实现标准化或模块化，这意味着其装置通常仅适用于单一实验方案，若需适配其他行为任务，则可能需要额外改造，导致许多实验室面临较高的成本。这一问题可通过采用本研究中所述的方案加以解决。尽管如此，仍可在多个环节进一步改进，以提升实验的可靠性。改进空间涵盖从电极制备到行为数据与信号处理的各个环节。然而，已有证据表明，利用一种价格低廉但技术先进的装置，即可实现动物行为追踪与EEG信号同步采集。
总之，本研究旨在帮助科研人员，特别是神经科学领域的研究者，能够使用这两种通常不常联合应用的技术。利用行为追踪软件同步记录脑电图（EEG）与行为测试的技术具有诸多优势，在神经科学的多个领域尤其在学习与记忆研究中具有重要应用价值。考虑到该设备还具备深入记录海马等皮层下结构电活动的能力，但如前所述，相应的若干 preparatory 步骤将需要调整。无线设备几乎克服了传统有线方式的所有局限性，例如动物在不同笼子间移动时的活动受限问题，以及因电缆缠绕导致动物受阻或纠缠的情况。如上所述，该实验装置操作简便，几乎无需专门培训或非专业背景的研究人员或个体均可使用该软件。该脑电设备的价格低于常规的脑电放大器。行为追踪软件也是目前市场上最经济实惠的视频追踪软件之一，但需每年购买许可证。该设备可应用于多个不同的实验设置、适用于多种动物，具有高度的灵活性与通用性。我们希望本项工作能够助力科学界，为同步研究行为学与脑电图提供便捷的途径。
披露
Sylvia Ortega-Martinez 博士就职于 Stoelting 公司，该公司为本文的制作及开放获取提供了支持与赞助。
致谢
我们感谢 Miguel Burgos 先生和 Gustavo Lago 先生提供的技术支持。我们衷心感谢 Stoelting 公司为本视频制作承担了费用，Jinga-hi 公司提供了技术支持，以及墨西哥城伊比利亚美洲大学研究与研究生部为本研究提供了资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| #2 可调速旋转工具头 | 货号 #310048，长度 44.5mm | SS White | 用于制作植入螺钉的孔洞 |
| #4 手术刀及刀片 | |||
| 50 X 50 X 50 cm 开场域黑色哑光实验箱 | |||
| 8针插座外壳（雌性） | Amphenol FCI | 10147606-00008LF | |
| 8针插座外壳（雄性） | Amphenol FCI | 10147603-00008LF | |
| 丙烯酸树脂 | MDC Dental | NicTone | 用于将螺钉固定于颅骨 |
| ANY-maze 视频追踪软件 | Stoelting, Co. | 版本 6.1 | http://www.anymaze.co.uk/) |
| 苯扎氯铵消毒液 | Benzal | Benzal | |
| 动脉瘤夹（ Bulldog 夹） | Cientifica VelaQuin | 用于牵拉皮肤 | |
| 摄像头 | Logitech | c920 | |
| 铜线 | |||
| 压接触点 | Amphenol FCI | 10147604-01LF | |
| DELL 台式电脑 | DELL | ||
| 电极 | |||
| JAGA16 | Jinga-Hi, Inc. | JAGA16 | |
| 氯胺酮 | PiSA Agropecuaria | ANESKET | 用于麻醉 |
| MATLAB | R2020a | MathWorks | 脚本由 Jinga-Hi, Inc. 协作开发 |
| 单体液 | MDC Dental | NicTone | 用于将螺钉固定于颅骨 |
| Neurophys 软件 | Jinga-Hi, Inc./ Neurosys, LLC | Neurosys 3.0.0.7 | |
| 螺钉旋具 | 用于将螺钉植入颅骨 | ||
| 螺钉 | |||
| 带电极的螺钉 | |||
| 立体定位仪 | KOPF | 用于手术操作 | |
| 可调速旋转工具 | Dremel 3000 | Dremel | 用于制作植入螺钉的孔洞 |
| 电压表 | PROAM | MUL-040 | 用于确认电极导电性 |
| 赛拉嗪 | PiSA Agropecuaria | PROCIN | 用于麻醉 |
参考文献
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