已开发并应用于成年小鼠心脏的一种优化的组织透明化方法。该方法旨在清除致密且具有自发荧光的心肌组织，同时保留由遗传报告基因策略标记的成纤维细胞的荧光信号。
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摘要
摘要
心血管疾病是全球最主要的死亡原因，常表现为心肌纤维化程度升高，导致心室僵硬度增加并伴随心脏功能改变。心室纤维化的增加源于静息状态心肌成纤维细胞的活化，然而这些细胞在三维（3-D）心脏组织中，无论是在基础状态还是活化后，其具体作用机制尚不明确。为了研究成纤维细胞在心脏疾病中的作用及其在三维心脏中的动态行为，研究人员开发了一种优化的基于CLARITY的组织透明化与成像方法，可实现对整个小鼠心脏内荧光标记的心脏成纤维细胞的可视化。通过将Rosa26-loxP-eGFP荧光报告基因小鼠与特异性表达Tcf21-MerCreMer的心脏成纤维细胞敲入小鼠杂交，实现了对组织驻留成纤维细胞的遗传学标记。该技术被用于观察健康小鼠以及心肌纤维化疾病模型小鼠中整个成年左心室内心脏成纤维细胞的定位与动态变化。有趣的是，在一种损伤模型中，观察到受伤小鼠心脏中心肌成纤维细胞呈现出独特的分布模式，沿收缩方向排列的包裹性纤维束分布。在缺血性损伤模型中，成纤维细胞发生死亡，随后由梗死边缘区域的细胞重新定植。综上所述，这种优化的心脏组织透明化技术结合数字化成像系统，能够在避免抗体渗透失败或传统组织处理导致荧光丢失等问题的前提下，实现对心脏内成纤维细胞的三维可视化观察。
引言
尽管心肌细胞在心脏中所占体积比例最大，但心脏成纤维细胞数量更多，并在调控该器官的基础结构和修复功能方面发挥关键作用。心脏成纤维细胞具有高度移动性，对机械刺激敏感，且其表型随活化程度不同而呈现多样性。这些细胞对于维持正常水平的细胞外基质（ECM）至关重要，ECM生成过少或过多均可导致疾病1,2,3。鉴于其在疾病中的重要性，心脏成纤维细胞已成为探索新型治疗策略的重要研究对象，尤其是在抑制过度纤维化方面备受关注4,5,6,7。在心脏损伤后，成纤维细胞被激活并分化为一种合成能力更强的细胞类型——肌成纤维细胞，这类细胞具有增殖能力，可分泌大量ECM，并表现出收缩活性，有助于心室的重构。
尽管心肌成纤维细胞在二维培养条件下的特性已被广泛研究6,8,9,10，但其在三维活体心脏中的特性与动态行为，无论是在基础状态还是疾病刺激条件下，目前仍知之甚少。本文描述了一种优化的方法，可在保持由Rosa26-loxP-eGFP与Tcf21-MerCreMer遗传报告系统标记的成纤维细胞荧光信号的同时，实现成年小鼠心脏组织的透明化。在心脏中，Tcf21是静息状态成纤维细胞相对特异性的标志物4。给予他莫昔芬激活可诱导型MerCreMer蛋白后，几乎所有静息成纤维细胞将在Rosa26位点永久表达增强型绿色荧光蛋白（eGFP），从而实现其在体内的追踪。
目前已建立多种成熟的组织透明化方案，其中一些已应用于心脏组织11,12,13,14,15,16,17。然而，不同组织透明化方案中使用的许多试剂被发现会淬灭内源性荧光信号18。此外，由于成年心脏中含有大量含血红素基团的蛋白质，会产生自发荧光，因而难以实现透明化19。因此，本实验方案的目标是在损伤的成年心脏中，在抑制血红素自发荧光的同时，保留成纤维细胞标志物的荧光信号，以实现最佳的体内三维可视化效果12,13,14,16,17,20。
既往研究尝试通过灌注抗体在体内标记心肌成纤维细胞，但这些研究受限于抗体穿透能力以及心脏血管结构14,16,17,20。尽管Salamon等人已证明在新生小鼠心脏中可通过组织透明化技术保留表面神经元的荧光信号，Nehrhoff等人也证实了髓系细胞荧光标记的保留，但尚无研究成功实现整个心室壁内源性荧光信号的完整保留，包括在基础状态或损伤后对成年心肌成纤维细胞的可视化观察13,20。本组织透明化方案在基于CLARITY方法（清除脂质-丙烯酰胺杂交刚性成像/免疫染色/原位杂交兼容组织水凝胶）和PEGASOS（聚乙二醇（PEG）相关溶剂系统）的多种既往方案基础上进行了优化。该优化方案使得对小鼠心脏在基础状态下以及在不同类型损伤后心肌成纤维细胞反应的更可靠观察成为可能。该方案操作简便且可重复，将有助于进一步表征心肌成纤维细胞在体内的生物学行为。
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方案
所有涉及小鼠的实验均经辛辛那提儿童医院医学中心机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。该机构亦获得实验动物照护评估与认证协会（AAALAC）认证。小鼠通过颈椎脱位法实施安乐死；接受可存活手术操作的小鼠均给予镇痛处理（见下文）。所有镇痛与安乐死方法均依据美国兽医医学协会安乐死专家组的建议执行。所有小鼠均饲养于玉米芯垫料笼具中，自由获取饮水与食物。同性别小鼠每4只共用一个笼具。在手术或未受伤组织透明化实验中，使用同等数量的6至8周龄雄性和雌性小鼠。
注意：所有手术均保持无菌手术条件。术者更换清洁的刷手服和无菌手术衣，并穿戴鞋套和头套。随后，术者使用氯己定进行手部刷洗，并戴上无菌外科手套。术者由一名技术员协助，技术员对小鼠进行镇静、剃毛，并对切口部位用2%葡萄糖酸氯己定和70%异丙醇交替擦拭三次，每次各三遍。随后将小鼠送至术者处进行手术操作。在每只动物之间，手术器械均使用干热珠灭菌器进行灭菌。
1. Cre 重组
- 将 Rosa26-loxP-eGFP 小鼠（Rosa26-nLacZ [FVB.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J]）与 Tcf21-MerCreMer 小鼠（图 1A）杂交6,21。
- 当杂交后代小鼠达到 6 周龄时，腹腔注射玉米油溶解的他莫昔芬，剂量为 75 mg/kg22。每隔 48 小时注射一次，共注射两次（图 1B）。
- 他莫昔芬注射后，给予小鼠含他莫昔芬的食物（约 0.4 g/kg 柠檬酸他莫昔芬）喂养一周。喂养一周含他莫昔芬的食物后，将小鼠转为正常高压灭菌饲料喂养一周，然后进行手术（图 1B）。另设适当数量的小鼠（每种手术条件 3 只）作为未损伤对照组。在正常饲料喂养一周后处死这些小鼠，并按以下所述的透明化流程进行操作。
- 在他莫昔芬处理及基因重组完成后，进行手术操作。
2. 手术模型
- 缺血/再灌注（I/R）23,24
- 在通风箱中使用含1.5%异氟烷气体的室内空气麻醉小鼠；用电推剪剃除其胸部和颈部毛发，然后用浸有2%葡萄糖酸氯己定的棉签擦拭剃毛区域。
- 通过将人工泪液软膏涂抹于镇静小鼠的眼睛上，防止手术期间眼睛干涩。
- 使用手术剪在颈部中央做切口，以暴露气管。将20 G导管插入气管进行插管，并通过颈部中线切口观察气管导管位置。将小鼠连接至呼吸机，同时持续以含1.5%异氟烷的室内空气维持镇静状态。
- 使用手术剪在左侧前肢下方做切口，切开第3与第4肋骨之间的肋间肌，使用牵开器撑开肋骨。
- 将一小块浸有生理盐水的海绵置于肺与心脏之间，以防止肺组织受损。
- 使用鱼钩针（6.5 mm，3/8弧度），以8-0 Prolene缝线在左冠状动脉上打一个可松解的滑结。
- 用镊子取出海绵。
- 使用4-0编织丝线行连续缝合关闭肋间肌，同时将8-0 Prolene滑结的一端引出体外。
- 使用表面组织粘合剂关闭皮肤切口，使阻断用滑结的末端外露。
- 在闭塞1小时后，牵拉滑结外露端，从内部松开冠状动脉闭塞，解除缺血状态，实现再灌注。
- 通过皮下注射给予0.02 mL浓度为1 mg/mL的缓释布托啡诺（释放持续72小时）作为镇痛剂，并将小鼠置于37 °C的充氧培养箱中，与其他动物隔离。至少每15分钟监测一次小鼠状态，直至其从麻醉中恢复并能维持胸卧位或坐姿。随后将小鼠送回常规饲养环境。
- 术后48小时内评估动物的疼痛与痛苦情况，并每日检查切口部位直至完全愈合。
- 术后持续观察小鼠的水合状态、营养状况及整体健康状况，直至处死。
- 心肌梗死（MI）25,26,27
- 执行步骤2.1.1–2.1.7。
- 使用4-0编织丝线行连续缝合关闭肋间肌。
- 使用表面组织粘合剂关闭皮肤切口。
- 执行步骤2.1.11–2.1.13。
- 血管紧张素II/去氧肾上腺素微渗透泵输注
- 在无菌条件下（例如在层流罩内），将1 mg血管紧张素II加入100 μL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制成10 μg/μL的工作溶液；将250 mg盐酸去氧肾上腺素溶于500 μL PBS中，配制成500 μg/μL的工作溶液。
- 根据小鼠体重计算每种工作溶液的稀释比例及需注入微渗透泵的最终体积。
注：例如，一只20 g的小鼠需要20 g × 14天 × 1.5 μg/天 = 420 μg血管紧张素II，即42 μL工作液；同时需要20 g × 14天 × 50 μg/天 = 14000 μg盐酸去氧肾上腺素，即28 μL工作液。 - 根据每只小鼠的体重，将药物工作储备液用无菌PBS稀释，并使用27 G针头和1 mL注射器将微渗透泵（0.25 μL/h，14天，容量约100 μL）填充完毕。
注：植入小鼠体内后，将产生1.5 μg∙g-1∙day-1的血管紧张素II和50 μg∙g-1∙day-1的盐酸去氧肾上腺素的输注速率。 - 在通风腔室中使用1.5%异氟烷吸入麻醉小鼠（达到麻醉效果）。
- 将麻醉后的小鼠仰卧位置于无菌手术台上，并通过鼻罩持续吸入1.5%异氟烷维持麻醉。
- 在动物眼睛上涂抹人工泪液软膏，防止手术期间角膜干燥。
- 使用电推剪剃除植入区域的毛发，并用乙醇和无菌棉签对该区域进行消毒。在小鼠背部右侧肩胛骨下方的皮肤表皮层用手术剪做一个小切口（约1 cm）。使用手术剪的钝面轻柔地扩张植入区域及其周围的皮下组织，以便插入微型泵。
- 将微渗透泵置入切口内，并通过手动在皮下按摩推动泵体，将其移至背部中线左侧。
- 使用带圆锥形针头的4-0丝线行连续缝合关闭切口。
- 泵植入后，以0.1 mg/kg体重剂量经皮下注射缓释布托啡诺用于镇痛（72小时缓释）。将小鼠置于37 °C的充氧培养箱中，与其他动物隔离。至少每15分钟监测一次小鼠状态，直至其从麻醉中恢复并能维持胸卧位或坐姿。
- 在37 °C加温舱内恢复意识后，将小鼠放回标准饲养笼具中。
- 术后48小时内监测小鼠的疼痛与痛苦情况，并每日检查切口部位直至完全愈合。
- 术后持续观察小鼠的水合状态、营养状况及整体健康状况，直至处死。
3. 使用改良的主动CLARITY方案清除成年小鼠心脏
- 使用70%乙醇对手术台面及所有手术器械进行消毒，准备洁净的手术区域。配制100 mL冷的1×PBS溶液和100 mL含4%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液。佩戴手套、实验服、口罩和护目镜。
- 通过将10单位肝素稀释于0.9% w/v氯化钠溶液中制备肝素缓冲液。使用1 mL注射器和27 G针头，每只小鼠腹腔注射60 μL肝素-NaCl溶液。
- 注射肝素-NaCl溶液5分钟后，在通风 chamber 中使用1.5%异氟烷吸入麻醉（至起效），对小鼠进行麻醉。
- 通过颈椎脱位法处死小鼠：用镊子的平头闭合端固定小鼠头部后侧，同时拉拽尾巴使脊柱脱位。
- 用蘸有70%乙醇的棉签清洁小鼠腹侧表面。使用手术剪在剑突下方约3 cm处做一条3 cm长的横向切口。
- 通过剥离腹部皮肤至剑突处，将皮肤与腹壁下组织分离（抓住靠近尾部的皮肤，将靠近头部的皮肤向上拉至肋骨区域）。在剑突下方3 cm处的腹壁皮下组织做一条2 cm长的横向切口，再从此切口沿中线向上做纵向切口，穿过肋骨区域。将肋骨向后固定，暴露心脏。
- 使用27 G针头和10 mL注射器向上下腔静脉及主动脉注入冷PBS，以清除心脏中的血液（对心脏的任何位置调整均应使用钝头镊子小心操作，避免穿刺）。
注：充分灌注可通过尾部抽动和肺部颜色变浅来判断。 - 使用27 G针头和10 mL注射器向上下腔静脉及主动脉注入冷的4% PFA，开始固定过程。
- 取出心脏。使用直刃手术刀分离心房、右心室与室间隔以及左心室。将组织放入盛有冷4% PFA的15 mL离心管中，置于4 °C旋转仪上孵育过夜。
- 用冷1×PBS洗涤心脏3次，每次1小时，以去除多余的PFA。
- 通过在15 mL离心管中混合以下试剂配制水凝胶（称为A4P0，表示丙烯酰胺/聚丙烯酰胺的相对组成）：40%丙烯酰胺溶液的10%、1×PBS的10%、蒸馏水的80%。
- 在将心脏浸入水凝胶前，立即向水凝胶溶液中加入0.25%光引发剂（2,2-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐）溶液。
- 将心脏放入含有水凝胶的锥形管中，用铝箔包裹锥形管，在4 °C下无扰动孵育过夜。
- 在4 °C孵育约14小时后，将含有心脏的锥形管转移至37 °C金属珠浴中。
- 在珠浴中孵育2.5小时后，用镊子小心地将心脏从水凝胶中取出。
- 在37 °C下，于含有1×PBS的15 mL锥形管中，在旋转仪上以每次1小时、共3次的方式洗涤心脏。
- 用镊子将心脏放入主动电泳仪的篮筐中，并盖上篮筐盖。确保盖子牢固就位。
- 将电泳清除液倒入电泳 chamber 的储液槽中，填满 chamber。
- 当 chamber 完全充满电泳清除液后，可将装有心脏的篮筐浸入液中，并牢固盖上电泳仪盖子。
- 以1.5 A、37 °C运行电泳仪1.5小时。
- 电泳1.5小时后，目视检查心脏，确保无任何不透明组织残留。若组织仍有局部不透明，需将心脏重新浸入电泳 chamber 的电泳液中，每次继续电泳0.5小时。
注：一旦出现组织损伤迹象（如组织松散），应立即停止电泳。 - 在37 °C下，于含有1×PBS的15 mL锥形管中，在旋转仪上以每次1小时、共3次的方式洗涤心脏。
- 将心脏浸入含有N,N,N′,N′-四(2-羟丙基)乙二胺的15 mL锥形管中——该脱色剂可降低血红素自发荧光。
注：此溶液应每24小时更换一次，直至心脏完全透明（约2天）。 - 在15 mL锥形管中用1×PBS洗涤心脏3次，每次1小时，以去除多余的脱色剂。
- 通过混合以下成分配制折射率匹配溶液（RIMS）：30 mL 0.02 M磷酸缓冲液、40 g 5-(N-2,3-二羟丙基乙酰胺基)-2,4,6-三碘-N,N'-双(2,3-二羟丙基)间苯二甲酰胺（需搅拌至完全溶解，可能耗时长达1小时）、5 mg叠氮化钠、50 µL Tween20和1 g 1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷，并将pH调节至7.5。
- 成像前将心脏在RIMS中平衡48小时。
4. 使用直立式单光子共聚焦显微镜对透明化心脏进行成像
注意：成像装置由一个10 cm玻璃培养皿的下半部分、一个3D打印的底部储液槽、一个圆形玻璃盖玻片以及一个3D打印的顶部储液槽组成（图1C–E）。3D打印材料由辛辛那提儿童医院临床工程部自行制作。
- 使用真空脂将3D打印的底部储液槽密封到玻璃培养皿中，方法是在3D打印部件的底部涂上一层薄薄的真空脂（图1C）。
注意：储液槽的高度应与被成像样品的高度相同（即样品不应被置于其上方的盖玻片压紧，也不应在储液槽内漂浮或移动）。 - 用RIMS溶液填充储液槽，并用移液器吸头去除所有气泡。将心脏小心放入RIMS溶液中，使左心室壁朝上，确保溶液中不引入气泡。
- 使用真空脂将盖玻片粘附到3D打印的顶部储液槽部件的底面（补充图1A）（同样是在3D打印部件上涂一层薄薄的真空脂，然后将其贴到盖玻片上）（图1D）。
- 将带有盖玻片的顶部储液槽（盖玻片朝下）放置在底部储液槽上（补充图1B），注意不要引入气泡。RIMS溶液与盖玻片之间的粘附作用将在顶部和底部储液槽部件之间形成密封（图1E）。
- 用甘油填充顶部储液槽，以便与10倍甘油浸没物镜配合使用。
- 使用配备多光子共聚焦扫描头的单光子显微镜对透明化的心脏进行成像。
- 降低单光子显微镜的载物台，将含有样品的培养皿置于载物台中央。升高载物台，并将10倍甘油浸没物镜浸入样品装置顶部储液槽的甘油中。通过目镜观察样品边缘，确保样品处于焦点位置。
- 在计算机上点击live按钮，从目镜视图切换到相机视图。
- 首先定位组织样品最宽的部分（应位于培养皿底部），以设定X和Y参数。
- 点击ND Acquisition和custom multipoint。使用操纵杆从左到右、从上到下扫描，找到组织样品的中心位置，从而创建多点图像。
- 然后根据组织大小确定所需的拼接尺寸（通常6–8周龄小鼠心脏为6 × 5）。可通过仅采集X和Y参数（在ND Acquisition选项卡下取消勾选z）进行测试成像，以检查是否完整捕获了组织的全长和全宽。
- 为设定z参数，打开XYZ导航，点击上和下图标，直至找到样品的顶部和底部。
- 打开Z强度校正面板，通过增加或减少每个z位置的激光功率，调节组织顶部、中部和底部的荧光信号，以校正组织密度差异。通过点击Z强度校正面板右侧的set箭头来设定这些参数。
- 在ND Acquisition面板中将Z步进大小设置为5 μm。
- 在确定心脏的X、Y、Z参数并完成z强度校正后，使用配备10倍甘油浸没物镜、谐振扫描器和砷化镓磷化物光电倍增管（GaAsP PMTs）的自动直立显微镜对透明化的心脏进行成像。确保在ND acquisition下已勾选XY和Z选项卡，然后点击Run Z correction。
- 在处理软件中打开多点图像，点击stitch按钮，对所得图像进行拼接、解混和去噪。在image菜单下点击blind unmixing、2 channel，然后点击find；在image菜单下点击denoise.ai，然后选择所需的荧光通道（例如GFP）。
注意：该过程可获得整个左心室中GFP阳性成纤维细胞的三维图像。 - 使用二次分析软件进一步识别心肌成纤维细胞分布中的模式和趋势。运行Spots向导程序，使用Spots功能。
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结果
心脏成纤维细胞对于心脏的基础功能以及对心脏损伤的反应至关重要。以往对这些细胞的排列和形态的研究主要在二维条件下进行。然而，目前已发表一种优化的心脏组织透明化（图2）和三维成像技术，可实现对心脏成纤维细胞更先进、更精细的可视化观察。利用该成像技术发现，在未受损的心脏中，成纤维细胞排列紧密，呈纺锤形形态（图3，补充视频S1–4）。
在未受伤心脏中完成左心室组织透明化后，该方案被应用于多种损伤模型，以检测该透明化方案在研究受损心肌组织时的表现。通过暂时结扎左冠状动脉（LCA）1小时，随后进行3、7、14或28天的再灌注，对小鼠实施缺血/再灌注（I/R）损伤。实验结果显示，在I/R损伤后，缺血区域的心脏成纤维细胞立即减少；但在第7天和第14天时，成纤维细胞迁移或增殖，重新定植于心脏损伤区域。到第28天时，围绕心脏损伤区域的成纤维细胞数量达到最高密度（图4，补充视频...
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讨论
本文介绍了一种改进的组织透明化方法，可实现对小鼠心脏中成纤维细胞在基线状态及损伤后体内情况的可视化观察，从而更深入地表征和理解心脏成纤维细胞。该优化方案克服了现有组织透明化技术在鉴定成年或新生小鼠心脏中特定细胞类型时存在的局限性12,13,14,16,17,20。在早期小鼠心脏透明化尝试中，采用的是被动CLARITY技术，即将心脏置于振荡器上的透明缓冲液中约1周时间，以实现缓冲液在组织内的被动扩散15,18。该方法仅能实现约80 μm深度的组织透明化（数据未显示），这与先前报道一致：清除出生1天的新生小鼠心脏需要数周时间
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披露
作者无任何与本稿件内容相关的披露事项。
致谢
作者谨此感谢辛辛那提儿童医院医学中心共聚焦成像核心实验室在本模型开发过程中提供的协助与指导，同时感谢临床工程部的 Matt Batie 设计了所有 3D 打印部件。Demetria Fischesser 获得了美国国立卫生研究院（NHLBI，T32 HL125204）培训项目资助，Jeffery D. Molkentin 获得了霍华德·休斯医学研究所的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4-0 编织丝线 | Ethicon | K871H | |
| 8-0 Prolene 缝线 | Ethicon | 8730H | |
| 40% 丙烯酰胺溶液 | Bio-Rad | 1610140 | |
| 血管紧张素 II | Sigma | A9525-50G | |
| 人工泪液软膏 | Covetrus | 048272 | |
| DABCO（1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷） | Millipore Sigma | D27802-25G | |
| GLUture 外用组织粘合剂 | World Precision Instruments | 503763 | |
| 肝素 | Sigma | H0777 | |
| Imaris Start 分析软件 | Oxford Instruments | N/A | |
| 微型渗透泵 | Alzet | Model 1002 | |
| Nikon Elements 分析软件 | Nikon | N/A | |
| Nikon A1R HD 直立显微镜 | Nikon | N/A | |
| 正常高压灭菌饲料 | Labdiet | 5010 | |
| Nycodenz，5-(N-2,3-二羟基丙基乙酰胺基)-2,4,6-三碘-N, N'-双(2,3-二羟基丙基)间苯二甲酰胺 | CosmoBio | AXS-1002424 | |
| 多聚甲醛 | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 盐酸去氧肾上腺素 | Sigma | P6126-10G | |
| 光引发剂 | Wako Chemicals | VA-044 | |
| Rosa26-nLacZ [FVB.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J] | Jackson Laboratories | Jax Stock No:012429 | |
| 叠氮化钠 | Sigma Aldrich | S2002-5G | |
| 氯化钠溶液 | Hospira, Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| 他莫昔芬 | Sigma Aldrich | T5648 | |
| 他莫昔芬饲料 | Envigo | TD.130860 | |
| 吐温-20 | Thermo Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Quadrol，N,N,N′,N′-四(2-羟丙基)乙二胺，脱色剂 | Millipore Sigma | 122262-1L | |
| X-Clarity 电泳组织透明腔室 | Logos Biosystems | C30001 | |
| X-Clarity 电泳组织透明溶液 | Logos Biosystems | C13001 | |
| X-Clarity 电泳组织篮 | Logos Biosystems | C12001 | |
| X-Clarity 电泳组织篮支架 | Logos Biosystems | C12002 |
参考文献
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