已开发并应用于成年小鼠心脏的一种优化的组织透明化方法。该方法旨在清除致密且具有自发荧光的心肌组织，同时保留由遗传报告基因策略标记的成纤维细胞的荧光信号。
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本文内容
摘要
摘要
心血管疾病是全球最主要的死亡原因，常表现为心肌纤维化程度升高，导致心室僵硬度增加并伴随心脏功能改变。心室纤维化的增加源于静息状态心肌成纤维细胞的活化，然而这些细胞在三维（3-D）心脏组织中，无论是在基础状态还是活化后，其具体作用机制尚不明确。为了研究成纤维细胞在心脏疾病中的作用及其在三维心脏中的动态行为，研究人员开发了一种优化的基于CLARITY的组织透明化与成像方法，可实现对整个小鼠心脏内荧光标记的心脏成纤维细胞的可视化。通过将Rosa26-loxP-eGFP荧光报告基因小鼠与特异性表达Tcf21-MerCreMer的心脏成纤维细胞敲入小鼠杂交，实现了对组织驻留成纤维细胞的遗传学标记。该技术被用于观察健康小鼠以及心肌纤维化疾病模型小鼠中整个成年左心室内心脏成纤维细胞的定位与动态变化。有趣的是，在一种损伤模型中，观察到受伤小鼠心脏中心肌成纤维细胞呈现出独特的分布模式，沿收缩方向排列的包裹性纤维束分布。在缺血性损伤模型中，成纤维细胞发生死亡，随后由梗死边缘区域的细胞重新定植。综上所述，这种优化的心脏组织透明化技术结合数字化成像系统，能够在避免抗体渗透失败或传统组织处理导致荧光丢失等问题的前提下，实现对心脏内成纤维细胞的三维可视化观察。
引言
尽管心肌细胞在心脏中所占体积比例最大，但心脏成纤维细胞数量更多，并在调控该器官的基础结构和修复功能方面发挥关键作用。心脏成纤维细胞具有高度移动性，对机械刺激敏感，且其表型随活化程度不同而呈现多样性。这些细胞对于维持正常水平的细胞外基质（ECM）至关重要，ECM生成过少或过多均可导致疾病1,2,3。鉴于其在疾病中的重要性，心脏成纤维细胞已成为探索新型治疗策略的重要研究对象，尤其是在抑制过度纤维化方面备受关注4,5,6,7。在心脏损伤后，成纤维细胞被激活并分化为一种合成能力更强的细胞类型——肌成纤维细胞，这类细胞具有增殖能力，可分泌大量ECM，并表现出收缩活性，有助于心室的重构。
尽管心肌成纤维细胞在二维培养条件下的特性已被广泛研究6,8,9,
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方案
所有涉及小鼠的实验均经辛辛那提儿童医院医学中心机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。该机构亦获得实验动物照护评估与认证协会（AAALAC）认证。小鼠通过颈椎脱位法实施安乐死；接受可存活手术操作的小鼠均给予镇痛处理（见下文）。所有镇痛与安乐死方法均依据美国兽医医学协会安乐死专家组的建议执行。所有小鼠均饲养于玉米芯垫料笼具中，自由获取饮水与食物。同性别小鼠每4只共用一个笼具。在手术或未受伤组织透明化实验中，使用同等数量的6至8周龄雄性和雌性小鼠。
注意：所有手术均保持无菌手术条件。术者更换清洁的刷手服和无菌手术衣，并穿戴鞋套和头套。随后，术者使用氯己定进行手部刷洗，并戴上无菌外科手套。术者由一名技术员协助，技术员对小鼠进行镇静、剃毛，并对切口部位用2%葡萄糖酸氯己定和70%异丙醇交替擦拭三次，每次各三遍。随后将小鼠送至术者处进行手术操作。在每只动物之间，手术器械均使用干热珠灭菌器进行灭菌。
1. Cre 重组
- 将 Rosa26-loxP-eGFP 小鼠（Rosa26-nLacZ [FVB.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J]）与 Tcf21-MerCreMer 小鼠（图 1A）杂交6,....
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结果
心脏成纤维细胞对于心脏的基础功能以及对心脏损伤的反应至关重要。以往对这些细胞的排列和形态的研究主要在二维条件下进行。然而，目前已发表一种优化的心脏组织透明化（图2）和三维成像技术，可实现对心脏成纤维细胞更先进、更精细的可视化观察。利用该成像技术发现，在未受损的心脏中，成纤维细胞排列紧密，呈纺锤形形态（图3，补充视频S1–4）。
在未受伤心脏中完成左心室组织透明化后，该方案被应用于多种损伤模型，以检测该透明化方案在研究受损心肌组织时的表现。通过暂时结扎左冠状动脉（LCA）1小时，随后进行3、7、14或28天的再灌注，对小鼠实施缺血/再灌注（I/R）损伤。实验结果显示，在I/R损伤后，缺血区域的心脏成纤维细胞立即减少；但在第7天和第14天时，成纤维细胞迁移或增殖，重新定植于心脏损伤区域。到第28天时，围绕心脏损伤区域的成纤维细胞数量达到最高密度（图4，补充视频.......
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讨论
本文介绍了一种改进的组织透明化方法，可实现对小鼠心脏中成纤维细胞在基线状态及损伤后体内情况的可视化观察，从而更深入地表征和理解心脏成纤维细胞。该优化方案克服了现有组织透明化技术在鉴定成年或新生小鼠心脏中特定细胞类型时存在的局限性12,13,14,16,17,20。在早期小鼠心脏透明化尝试中，采用的是被动CLARITY技术，即将心脏置于振荡器上的透明缓冲液中约1周时间，以实现缓冲液在组织内的被动扩散15,18。该方法仅能实现约80 μm深度的组织透明化（数据未显示），这与先前报道一致：清除出生1天的新生小鼠心脏需要数周时间
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披露
作者无任何与本稿件内容相关的披露事项。
致谢
作者谨此感谢辛辛那提儿童医院医学中心共聚焦成像核心实验室在本模型开发过程中提供的协助与指导，同时感谢临床工程部的 Matt Batie 设计了所有 3D 打印部件。Demetria Fischesser 获得了美国国立卫生研究院（NHLBI，T32 HL125204）培训项目资助，Jeffery D. Molkentin 获得了霍华德·休斯医学研究所的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4-0 编织丝线 | Ethicon | K871H | |
| 8-0 Prolene 缝线 | Ethicon | 8730H | |
| 40% 丙烯酰胺溶液 | Bio-Rad | 1610140 | |
| 血管紧张素 II | Sigma | A9525-50G | |
| 人工泪液软膏 | Covetrus | 048272 | |
| DABCO（1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷） | Millipore Sigma | D27802-25G | |
| GLUture 外用组织粘合剂 | World Precision Instruments | 503763 | |
| 肝素 | Sigma | H0777 | |
| Imaris Start 分析软件 | Oxford Instruments | N/A | |
| 微型渗透泵 | Alzet | Model 1002 | |
| Nikon Elements 分析软件 | Nikon | N/A | |
| Nikon A1R HD 直立显微镜 | Nikon | N/A | |
| 正常高压灭菌饲料 | Labdiet | 5010 | |
| Nycodenz，5-(N-2,3-二羟基丙基乙酰胺基)-2,4,6-三碘-N, N'-双(2,3-二羟基丙基)间苯二甲酰胺 | CosmoBio | AXS-1002424 | |
| 多聚甲醛 | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 盐酸去氧肾上腺素 | Sigma | P6126-10G | |
| 光引发剂 | Wako Chemicals | VA-044 | |
| Rosa26-nLacZ [FVB.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J] | Jackson Laboratories | Jax Stock No:012429 | |
| 叠氮化钠 | Sigma Aldrich | S2002-5G | |
| 氯化钠溶液 | Hospira, Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| 他莫昔芬 | Sigma Aldrich | T5648 | |
| 他莫昔芬饲料 | Envigo | TD.130860 | |
| 吐温-20 | Thermo Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Quadrol，N,N,N′,N′-四(2-羟丙基)乙二胺，脱色剂 | Millipore Sigma | 122262-1L | |
| X-Clarity 电泳组织透明腔室 | Logos Biosystems | C30001 | |
| X-Clarity 电泳组织透明溶液 | Logos Biosystems | C13001 | |
| X-Clarity 电泳组织篮 | Logos Biosystems | C12001 | |
| X-Clarity 电泳组织篮支架 | Logos Biosystems | C12002 |
参考文献
- Nagaraju, C. K., et al. Myofibroblast phenotype and reversibility of fibrosis in patients With end-stage heart failure. Journal of the American College of Cardiology. 73 (18), 2267-2282 (2019).
- Yoon, S., Eom, G. H.
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重印与许可
