需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

使用液相色谱串联质谱法对Saccharomyces cerevisiae进行定量代谢组学分析

4.2K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/62061

⸱

2021年1月5日

 ,  , 
1Department of Biology, Concordia University, 2Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry, Concordia University

本文内容

摘要

我们提出了一种用于鉴定和定量酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中主要类别的水溶性代谢物的实验方案。该方法具有多功能性、稳健性和高灵敏度，能够实现水溶性代谢物中结构异构体与立体异构体之间的有效分离。

摘要

代谢组学是一种用于鉴定和定量细胞、组织、器官、生物液体或生物体内多种低分子量代谢中间产物和终产物的方法。传统上，代谢组学主要关注水溶性代谢物。水溶性代谢组是整合了多种基因组、表观基因组、转录组、蛋白质组及环境因素的复杂细胞网络的最终产物。因此，代谢组学分析可直接评估这些因素在各种生物体多种生物过程中共同作用的结果。其中一种研究对象是芽殖酵母Saccharomyces cerevisiae，这是一种基因组已完全测序的单细胞真核生物。由于S. cerevisiae适用于全面的分子分析，它被广泛用作解析真核细胞中多种生物学过程机制的模式生物。一种能够对水溶性代谢组进行稳健、灵敏且准确的定量分析的多功能分析方法，将为深入解析这些机制提供必要的技术手段。本文介绍了一种优化的芽殖酵母S. cerevisiae细胞代谢活性淬灭及水溶性代谢物提取的实验方案。该方案还描述了使用液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）对提取的水溶性代谢物进行定量分析的方法。此处所述的非靶向代谢组学LC-MS/MS方法具有良好的通用性和稳健性，能够鉴定和定量超过370种具有不同结构、物理和化学性质的水溶性代谢物，包括这些代谢物的不同结构异构体和立体异构体形式。这些代谢物涵盖多种能量载体分子、核苷酸、氨基酸、单糖、糖酵解中间产物以及三羧酸循环中间产物。该非靶向代谢组学LC-MS/MS方法灵敏度高，可检测浓度低至0.05 pmol/µL的某些水溶性代谢物。该方法已成功应用于在不同培养条件下生长的野生型和突变型酵母细胞水溶性代谢组的分析。

引言

水溶性代谢物是参与细胞基本生命活动的低分子量代谢中间产物和终产物。这些在进化上保守的生物学过程包括将营养物质转化为可利用的能量、大分子物质的合成、细胞生长与信号转导、细胞周期调控、基因表达调控、应激反应、代谢的翻译后调控、线粒体功能的维持、细胞囊泡运输、自噬、细胞衰老以及程序性细胞死亡1,2,3。

许多水溶性代谢物的重要功能是通过芽殖酵母 S. cerevisiae1,3,4,7,9,14,15,16,17,18,19,20,21,22 的研究发现的。这种单细胞真核生物因其适用于先进的生物化学、遗传学和分子生物学分析，成为解析水溶性代谢物如何参与细胞过程机制的有用模式生物23,24,25,26。尽管非靶向代谢组学的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法已被用于研究水溶性代谢物在芽殖酵母中的作用3,18,22,27，但此类分析仍需提高其通用性、稳健性、灵敏度，以及区分这些代谢物不同结构异构体和立体异构体形式的能力。

近年来，非靶向代谢组学中的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法在体内水溶性代谢物谱分析方面取得了显著进展。然而，该方法的应用仍面临诸多挑战2,28,29,30,31,32,33,34,35,36。这些挑战包括以下方面。第一，许多水溶性代谢物的胞内浓度低于当前方法的检测灵敏度阈值。第二，现有方法对代谢活性的淬灭效率较低，且淬灭过程中细胞内代谢物的泄漏程度较高，导致当前方法低估了水溶性代谢物的胞内浓度。第三，现有方法无法区分特定代谢物的结构异构体（即具有相同化学式但原子连接方式不同的分子）或立体异构体（即具有相同化学式和原子连接方式，但原子空间排列不同的分子），从而阻碍了当前方法对某些代谢物的正确注释。第四，现有的母离子（MS1）和二级离子（MS2）质谱在线数据库尚不完整，这影响了利用当前方法产生的原始LC-MS/MS数据对特定代谢物进行准确鉴定与定量。第五，现有方法无法通过单一类型的代谢物提取方法回收全部或大多数类别的水溶性代谢物。第六，现有方法无法使用单一类型的液相色谱柱实现全部或大多数类别的水溶性代谢物之间的有效分离。

本研究优化了酿酒酵母（S. cerevisiae）细胞内代谢活性淬灭的条件，可在提取前最大限度地将水溶性代谢物保留在细胞内，并从酵母细胞中提取出大多数类别的水溶性代谢物。我们建立了一种通用、稳健且灵敏的方法，基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）对从酿酒酵母（S. cerevisiae）细胞中提取的超过370种水溶性代谢物进行鉴定和定量。该非靶向代谢组学方法可用于评估细胞内多种能量载体分子、核苷酸、氨基酸、单糖、糖酵解中间产物以及三羧酸循环中间产物的浓度。所建立的LC-MS/MS方法能够对具有不同结构、物理和化学性质的水溶性代谢物的不同结构异构体和立体异构体形式进行鉴定与定量。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 酵母培养基的制备与灭菌

  1. 制备 180 mL 完全酵母提取物-蛋白胨（YP）培养基。完全 YP 培养基含有 1%（w/v）酵母提取物和 2%（w/v）蛋白胨。
  2. 将 180 mL YP 培养基均分至四个 250 mL 锥形瓶中。每个锥形瓶中含有 45 mL YP 培养基。
  3. 将装有 YP 培养基的锥形瓶在 15 psi/121 °C 条件下高压灭菌 45 分钟。

2. 野生型酵母菌株

  1. 使用 BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) 菌株。

3. 在含有2%葡萄糖的YP培养基中培养酵母

  1. 将20% (w/v) 葡萄糖储备液在15 psi/121 °C条件下高压灭菌45分钟。
  2. 向两个装有45 mL灭菌YP培养基的锥形瓶中，各加入5 mL已高压灭菌的20% (w/v) 葡萄糖储备液。YP培养基中葡萄糖的终浓度为2% (w/v)。
  3. 使用微生物接种环将酵母细胞接种至两个含有2%葡萄糖YP培养基的锥形瓶中。
  4. 在30 °C、200 rpm转速的摇床中过夜培养酵母细胞。
  5. 取一份酵母培养液的等分试样，测定每毫升培养液中的酵母细胞总数，使用血细胞计数板进行细胞计数。

4. 细胞转移至含2%葡萄糖的YP培养基并进行培养

  1. 向其余两个装有高压灭菌 YP 培养基的锥形瓶中，各加入 5 mL 已灭菌的 20% (w/v) 葡萄糖储备液。葡萄糖的终浓度为 2% (w/v)。
  2. 用无菌移液管将过夜培养的酵母菌液（YP 培养基含 2% 葡萄糖）转移至两个含有 2% 葡萄糖 YP 培养基的锥形瓶中，每瓶接种量应含有总数为 5.0 × 107 个细胞。
  3. 将酵母细胞在 30 °C、200 rpm 的摇床中培养至少 24 小时（或根据实验需要更长时间）。

5. 配制试剂、准备实验器具及设置细胞淬灭设备

  1. 准备以下物品：1）淬灭溶液（60% 高纯度（>99.9%）甲醇溶于 155 mM 碳酸氢铵（ABC）缓冲液中，pH = 8.0）；2）预冷的 ABC 溶液（pH = 8.0）；3）可测量至 -20 °C 的数字温度计；4）500 mL 大容量离心瓶；5）预冷的高速离心机，配备预冷转子及适用于该转子的预冷 500 mL 离心瓶，所有设备均置于 -5 °C；6）代谢物提取管（15 mL 高速玻璃离心管，带聚四氟乙烯衬垫盖）；以及 7）干冰。

6. 细胞淬灭

  1. 使用血细胞计数板测定含2%葡萄糖的YP培养基中每毫升的酵母细胞数量。
  2. 将含有5.0 × 108个细胞的含2%葡萄糖YP培养基培养物转移至预冷的500 mL离心管中。
  3. 迅速向含有细胞的离心管中加入-20 °C预冷的淬灭溶液，定容至200 mL。
  4. 在高速离心机中以11,325 × g于-5 °C离心3分钟。
  5. 迅速而轻柔地从离心机中取出离心管，缓慢旋开盖子，并移除上清液，避免扰动沉淀。
  6. 将细胞沉淀迅速重悬于10 mL冰冻ABC缓冲液中，然后将悬液转移至带有聚四氟乙烯衬垫盖子的15 mL高速玻璃离心管中，用于代谢物提取。
  7. 在临床离心机中以3,000 × g于0 °C离心3分钟收集细胞。
  8. 迅速吸除上清液，将离心管置于干冰上以开始代谢物提取，或暂时存放于-80 °C直至提取。

7. 代谢物提取所需试剂、实验耗材和设备的准备

  1. 准备以下物品：1）液相色谱-质谱级氯仿；2）液相色谱-质谱级甲醇；3）液相色谱级纳米纯水；4）液相色谱-质谱级乙腈（ACN）；5）玻璃珠（经酸洗，425–600 µm）；6）配有带固定装置的泡沫管架的涡旋振荡器；7）带聚四氟乙烯衬垫盖的15 mL高速玻璃离心管；8）质谱小瓶；9）干冰；以及10）经乙醇、乙腈和纳米纯水各清洗一次的1.5 mL离心管。
    ​注意：仅使用由耐有机溶剂的聚丙烯材料制成的移液器吸头和离心管。

8. 代谢物提取

  1. 向步骤6.7中保存在干冰上或-80 °C冰箱中的代谢物样品管中加入以下试剂：1）2 mL 保存在-20 °C的氯仿；2）1 mL 保存在-20 °C的甲醇；3）1 mL 冰冷的纳米纯水；以及 4）200 µL 经酸洗处理的425–600 µm玻璃珠。
  2. 用铝箔封住并盖紧管口。将样品管放入带固定夹的泡沫管架中，在4 °C条件下以中等速度涡旋振荡30分钟（即设定速度为6，其中12为涡旋振荡器的最大速度），以促进代谢物的提取。
  3. 将样品管置于冰上孵育15分钟（切勿使用干冰！），以促进蛋白质沉淀，并使上层水相与下层有机相分离。
  4. 在临床离心机中以3,000 × g、4 °C离心10分钟。此离心步骤可分离出上层水相（含有水溶性代谢物）、中间层（含有细胞碎片和蛋白质）以及下层有机相（主要含有脂类）。
  5. 使用微量移液器将上层水相（400 µL）转移至一个已清洗并标记好的1.5 mL离心管中，该离心管内含有800 µL保存在-20 °C的乙腈（ACN）。
    注：将上层水相加入-20 °C保存的乙腈后，会出现白色云状沉淀。
  6. 将含有样品的离心管在台式离心机中以13,400 × g、4 °C离心10分钟。
    ​注：离心后白色云状沉淀将消失。
  7. 从离心管中液体的上层取800 µL转移至标记好的质谱小瓶中。将样品储存在0 °C，直至进行LC-MS/MS分析。

9. 液相色谱试剂、实验器具和设备的准备

  1. 准备以下物品：1）涡旋振荡器；2）超声波破碎仪；3）MS 玻璃小瓶；4）配备二元泵、脱气装置和自动进样器的液相色谱系统；5）两性离子色谱柱（5 µm 聚合物，150 x 2.1 mm），名称见材料表；6）柱温箱；以及 7）流动相，包括 A 相（乙腈:水（v/v）= 5:95，含 20 mM 乙酸铵，pH = 8.0）和 B 相（100% 乙腈）。

10. 通过液相色谱分离提取的代谢物

  1. 将质谱小瓶中的内容物进行超声处理15分钟。
  2. 在室温（RT）下涡旋振荡质谱小瓶，每次10秒，共3次。
  3. 将质谱小瓶放入孔板中。
  4. 色谱分析过程中，保持色谱柱温度为45 °C，流速为0.250 mL/min。样品在孔板中保持0 °C。色谱分析时所用的液相梯度参见表1。
    注意：图1展示了从野生型菌株BY4742细胞中提取的水溶性代谢物的代表性总离子流色谱图。通过质谱分析在正离子化模式[ESI (+)]下对液相色谱分离的代谢物进行鉴定和定量，具体步骤如步骤11所述。

11. 通过液相色谱分离代谢物的质谱分析

  1. 使用配备加热电喷雾电离（HESI）的质谱仪，对经液相色谱分离的水溶性代谢物进行鉴定和定量。使用质谱仪的分析器检测MS1离子，使用质谱仪的检测器检测MS2离子。分别采用表2和表3中提供的参数设置进行MS1和MS2离子的数据依赖性采集。
  2. 在ESI(+)和ESI(-)两种模式下，进样体积均为10 µL。

12. 通过处理LC-MS/MS原始数据鉴定和定量不同代谢物

  1. 使用材料表中列出的软件，对原始LC-MS/MS文件中的不同水溶性代谢物进行鉴定和定量。该软件使用MS1进行代谢物定量，使用MS2进行代谢物鉴定。该软件利用经过最广泛人工审编的质谱碎片图谱数据库，通过匹配质谱图，利用LC-MS/MS原始数据对代谢物进行注释。该软件还结合MS1的精确质量数和同位素模式匹配，利用在线数据库对代谢物进行注释。详见图2。
  2. 使用可免费在线获取的数据库与谱图库（https://www.mzcloud.org），搜索原始数据的MS2谱图。

13. 通过碘化丙啶（PI）染色和荧光显微镜检测膜完整性

  1. 按照步骤6所述进行细胞淬灭后，用15 mL ABC缓冲液彻底洗涤淬灭后的细胞，以去除淬灭溶液。在0 °C下以3,000 × g离心5 min收集细胞。
  2. 将细胞沉淀重悬于1 mL ABC缓冲液中，并加入0.5 mL PI溶液（0.5 mg/mL）。
  3. 将样品管涡旋振荡3次，每次10 s，然后在冰上避光孵育10 min。
  4. 将样品管在台式离心机中于4 °C下以13,400 × g离心10 min。
  5. 弃去上清液，并将沉淀重悬于1 mL ABC缓冲液中。
  6. 在4 °C下以13,400 × g离心10 min，弃去上清液。重复此步骤2次，以去除与细胞表面结合的PI。
  7. 将沉淀重悬于300 µL ABC缓冲液中。取10 µL悬液滴加至显微镜载玻片表面。
  8. 使用荧光显微镜采集微分干涉差（DIC）和荧光显微图像。激发波长和发射波长分别设置为593 nm和636 nm的滤光片组。
  9. 使用软件统计总细胞数（DIC模式下）以及荧光染色细胞的数量。同时利用该软件测定单个细胞的染色强度。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

为改进酵母细胞内水溶性代谢物的定量评估，我们优化了用于代谢物检测的细胞淬灭条件。该目的下的细胞淬灭涉及迅速终止细胞内的所有酶促反应31,33,37,38细胞代谢活动的这种抑制是定量水溶性代谢物的任何方法中的关键步骤 体内 因为它可以防止低估其细胞内浓度31,33,37,38细胞淬灭用于代谢物检测时总会破坏质膜（PM）的完整性（如果存在细胞壁（CW），也会破坏其完整性）；这会导致细胞内代谢物泄漏31

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

要成功使用此处所述的实验方案，请遵循以下预防措施。氯仿和甲醇会从实验室塑料器皿中提取多种物质，因此需谨慎操作。在涉及接触这两种有机溶剂的步骤中，应避免使用塑料制品。这些步骤应使用硼硅酸盐玻璃移液管，并在使用前用氯仿和甲醇冲洗这些移液管。仅使用由耐有机溶剂的聚丙烯材料制成的微量移液器吸头和离心管。在进行 LC-MS/MS 样品制备时，将玻璃小瓶插入孔板前，务必彻底排除其中的所有气泡。

此处使用的两性离子相色谱柱在每次运行后均需进行充分的再平衡处理，以最大限度减少保留时间漂移。对于色谱柱的再平衡，建议使用相当于色谱柱体积约20倍的再平衡溶液。色谱柱需在0.4 mL/min的较高流速下，用初始流动相冲洗15分钟。为避免在再平衡过程中对色谱柱造成任何损伤，应使柱压保持在制造商建议的最高压力限值以下。

值得注意的是，某些在反相模式下运行的混合分离色谱柱能够分离带电代谢物40,41。这些混合分离色谱柱基于本实验所用的反相色...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

我们感谢Titorenko实验室现任和前任成员的讨论。我们感谢康考迪亚大学的质谱生物学应用中心、基因组结构与功能中心以及显微镜与细胞成像中心提供的卓越服务。本研究得到了加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）的资助（项目编号：RGPIN 2014-04482 和 CRDPJ 515900 - 17）。K.M. 获得了康考迪亚大学Armand C. Archambault博士后奖学金以及康考迪亚大学文理学院优秀奖的支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
化学试剂
乙腈Fisher ScientificA9554
乙酸铵Fisher ScientificA11450
碳酸氢铵Sigma9830
蛋白胨Fisher ScientificBP1420-2
氯仿Fisher ScientificC297-4
葡萄糖Fisher ScientificD16-10
L-组氨酸SigmaH8125
L-亮氨酸SigmaL8912
L-赖氨酸SigmaL5501
甲醇Fisher ScientificA4564
甲醇Fisher ScientificA4564
碘化丙啶Thermo ScientificR37108
尿嘧啶SigmaU0750
酵母提取物Fisher ScientificBP1422-2
硬件设备
500 ml 离心瓶Beckman355664
Agilent 1100 系列液相色谱系统Agilent TechnologiesG1312A
Beckman Coulter 离心机Beckman6254249
Beckman Coulter 离心机转子BeckmanJA-10
Centra CL2 临床离心机Thermo Scientific004260F
数字温度计OmegaHH509
带固定夹的泡沫管架套装Thermo Scientific02-215-388
SeQuant ZIC-pHILIC 两性离子相色谱柱（5µm 聚合物，150 x 2.1 mm）Sigma Milipore150460
Thermo Orbitrap Velos 质谱仪Fisher ScientificETD-10600
超声波破碎仪Fisher Scientific15337416
涡旋振荡器Fisher Scientific2215365
ZORBAX Bonus-RP 色谱柱，80Å，2.1 x 150 mm，5 µmAgilent Technologies883725-901
实验室耗材
2-mL 玻璃样品瓶，带聚四氟乙烯衬垫瓶盖Fisher Scientific60180A-SV9-1P
玻璃珠（酸洗，425-600 μm）Sigma-AldrichG8772
血细胞计数板Fisher Scientific267110
15-mL 高速玻璃离心管，带聚四氟乙烯衬垫瓶盖PYREX05-550
软件
Compound Discoverer 3.1Fisher ScientificV3.1
酵母菌株
酵母菌株 BY4742DharmaconYSC1049

参考文献

  1. Hackett, S. R., et al. Systems-level analysis of mechanisms regulating yeast metabolic flux. Science. 354 (6311), aaf2786(2016).
  2. Johnson, C. H., Ivanisevic, J., Siuzdak, G. Metabolomics: beyond biomarkers and towards mechanisms. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (7), 451-459 (2016).
  3. Mülleder, M., et al. Functional metabolomics describes the yeast biosynthetic regulome. Cell. 167 (2), 553-565 (2016).
  4. López-Otín, C., Galluzzi, L., Freije, J., Madeo, F., Kroemer, G. Metabolic control of longevity. Cell. 166 (4), 802-821 (2016).
  5. Krishnaiah, S. Y., et al. Clock regulation of metabolites reveals coupling between transcription and metabolism. Cell Metabolism. 25 (4), 961-974 (2017).
  6. Lee, H. J. Proteomic and metabolomic characterization of a mammalian cellular transition from quiescence to proliferation. Cell Reports. 20 (3), 721-736 (2017).
  7. Stryeck, S., Birner-Gruenberger, R., Madl, T. Integrative metabolomics as emerging tool to study autophagy regulation. Microbial Cell. 4 (8), 240-258 (2017).
  8. Babst, M. Eisosomes at the intersection of TORC1 and TORC2 regulation. Traffic. 20 (8), 543-551 (2019).
  9. Pedro, J., Sica, V., Madeo, F., Kroemer, G. Acyl-CoA-binding protein (ACBP): the elusive 'hunger factor' linking autophagy to food intake. Cell Stress. 3 (10), 312-318 (2019).
  10. Rahmani, S., Defferrari, M. S., Wakarchuk, W. W., Antonescu, C. N. Energetic adaptations: Metabolic control of endocytic membrane traffic. Traffic. 20 (12), 912-931 (2019).
  11. Viltard, M., et al. The metabolomic signature of extreme longevity: naked mole rats versus mice. Aging. 11 (14), 4783-4800 (2019).
  12. Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell growth and proliferation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (7), 436-450 (2019).
  13. Morrison, A. J. Chromatin-remodeling links metabolic signaling to gene expression. Molecular Metabolism. 38, 100973(2020).
  14. Bitterman, K. J., Medvedik, O., Sinclair, D. A. Longevity regulation in Saccharomyces cerevisiae: linking metabolism, genome stability, and heterochromatin. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (3), 376-399 (2003).
  15. Carmona-Gutierrez, D. Apoptosis in yeast: triggers, pathways, subroutines. Cell Death and Differentiation. 17 (5), 763-773 (2010).
  16. Minois, N., Carmona-Gutierrez, D., Madeo, F. Polyamines in aging and disease. Aging. 3 (8), 716-732 (2011).
  17. Ring, J., et al. The metabolism beyond programmed cell death in yeast. Experimental Cell Research. 318 (11), 1193-1200 (2012).
  18. Ibáñez, A. J., et al. Mass spectrometry-based metabolomics of single yeast cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8790-8794 (2013).
  19. Pietrocola, F., et al. Acetyl coenzyme A: a central metabolite and second messenger. Cell Metabolism. 21 (6), 805-821 (2015).
  20. Carmona-Gutierrez, D., et al. Guidelines and recommendations on yeast cell death nomenclature. Microbial Cell. 5 (1), 4-31 (2018).
  21. Zimmermann, A., et al. Yeast as a tool to identify anti-aging compounds. FEMS Yeast Research. 18 (6), foy020(2018).
  22. Leupold, S., et al. Saccharomyces cerevisiae goes through distinct metabolic phases during its replicative lifespan. eLife. 8, e41046(2019).
  23. Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , Academic Press. Burlington. (2010).
  24. Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
  25. Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).
  26. Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases. Genetics. 208 (3), 833-851 (2018).
  27. Boer, V. M., et al. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Molecular Biology of the Cell. 21 (1), 198-211 (2010).
  28. Clish, C. B. Metabolomics: an emerging but powerful tool for precision medicine. Cold Spring Harbor Molecular Case Studies. 1 (1), a000588(2015).
  29. Fuhrer, T., Zamboni, N. High-throughput discovery metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 31, 73-78 (2015).
  30. Liu, X., Locasale, J. W. Metabolomics: A primer. Trends in Biochemical Sciences. 42 (4), 274-284 (2017).
  31. Lu, W., et al. Metabolite measurement: pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
  32. Riekeberg, E., Powers, R. New frontiers in metabolomics: from measurement to insight. F1000 Reseach. 6, 1148(2017).
  33. Gertsman, I., Barshop, B. A. Promises and pitfalls of untargeted metabolomics. Journal of Inherited Metabolic Disease. 41 (3), 355-366 (2018).
  34. Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
  35. Ivanisevic, J., Want, E. J. From samples to insights into metabolism: Uncovering biologically relevant information in LC-HRMS metabolomics data. Metabolites. 9 (12), 308(2019).
  36. Srivastava, S. Emerging insights into the metabolic alterations in aging using metabolomics. Metabolites. 9 (12), 301(2019).
  37. Chetwynd, A. J., Dunn, W. B., Rodriguez-Blanco, G. Collection and preparation of clinical samples for metabolomics. Advances in Experimental Medicine and Biology. 965, 19-44 (2017).
  38. Pinu, F. R., Villas-Boas, S. G., Aggio, R. Analysis of intracellular metabolites from microorganisms: quenching and extraction protocols. Metabolites. 7 (4), (2017).
  39. Zhang, N., et al. Cell permeability and nuclear DNA staining by propidium iodide in basidiomycetous yeasts. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (9), 4183-4191 (2018).
  40. Tu, B. P., et al. Cyclic changes in metabolic state during the life of a yeast cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16886-16891 (2007).
  41. Walvekar, A., Rashida, Z., Maddali, H., Laxman, S. A versatile LC-MS/MS approach for comprehensive, quantitative analysis of central metabolic pathways. Wellcome Open Research. 3, 122(2018).
  42. Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).
  43. Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
  44. Oberacher, H., et al. Annotating nontargeted LC-HRMS/MS data with two complementary tandem mass spectral libraries. Metabolites. 9 (1), 3(2018).
  45. Tada, I., et al. Creating a reliable mass spectral-retention time library for all ion fragmentation-based metabolomics. Metabolites. 9 (11), 251(2019).
  46. Villas-Bôas, S. G., et al. Global metabolite analysis of yeast: evaluation of sample preparation methods. Yeast. 22 (14), 1155-1169 (2005).
  47. Crutchfield, C. A., Lu, W., Melamud, E., Rabinowitz, J. D. Mass spectrometry-based metabolomics of yeast. Methods in Enzymology. 470, 393-426 (2010).
  48. Zhang, T., Creek, D. J., Barrett, M. P., Blackburn, G., Watson, D. G. Evaluation of coupling reversed phase, aqueous normal phase, and hydrophilic interaction liquid chromatography with Orbitrap mass spectrometry for metabolomic studies of human urine. Analytical Chemistry. 84 (4), 1994-2001 (2012).
  49. Villas-Bôas, S. G., Moxley, J. F., Akesson, M., Stephanopoulos, G., Nielsen, J. High-throughput metabolic state analysis: the missing link in integrated functional genomics of yeasts. Biochemical Journal. 388 (Pt 2), 669-677 (2005).
  50. Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

使用液相色谱串联质谱法对Saccharomyces cerevisiae进行定量代谢组学分析
联系我们
向图书馆推荐

隐私

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。