使用液相色谱串联质谱法对Saccharomyces cerevisiae进行定量代谢组学分析

摘要

我们提出了一种用于鉴定和定量酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中主要类别的水溶性代谢物的实验方案。该方法具有多功能性、稳健性和高灵敏度，能够实现水溶性代谢物中结构异构体与立体异构体之间的有效分离。

摘要

代谢组学是一种用于鉴定和定量细胞、组织、器官、生物液体或生物体内多种低分子量代谢中间产物和终产物的方法。传统上，代谢组学主要关注水溶性代谢物。水溶性代谢组是整合了多种基因组、表观基因组、转录组、蛋白质组及环境因素的复杂细胞网络的最终产物。因此，代谢组学分析可直接评估这些因素在各种生物体多种生物过程中共同作用的结果。其中一种研究对象是芽殖酵母Saccharomyces cerevisiae，这是一种基因组已完全测序的单细胞真核生物。由于S. cerevisiae适用于全面的分子分析，它被广泛用作解析真核细胞中多种生物学过程机制的模式生物。一种能够对水溶性代谢组进行稳健、灵敏且准确的定量分析的多功能分析方法，将为深入解析这些机制提供必要的技术手段。本文介绍了一种优化的芽殖酵母S. cerevisiae细胞代谢活性淬灭及水溶性代谢物提取的实验方案。该方案还描述了使用液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）对提取的水溶性代谢物进行定量分析的方法。此处所述的非靶向代谢组学LC-MS/MS方法具有良好的通用性和稳健性，能够鉴定和定量超过370种具有不同结构、物理和化学性质的水溶性代谢物，包括这些代谢物的不同结构异构体和立体异构体形式。这些代谢物涵盖多种能量载体分子、核苷酸、氨基酸、单糖、糖酵解中间产物以及三羧酸循环中间产物。该非靶向代谢组学LC-MS/MS方法灵敏度高，可检测浓度低至0.05 pmol/µL的某些水溶性代谢物。该方法已成功应用于在不同培养条件下生长的野生型和突变型酵母细胞水溶性代谢组的分析。

引言

水溶性代谢物是参与细胞基本生命活动的低分子量代谢中间产物和终产物。这些在进化上保守的生物学过程包括将营养物质转化为可利用的能量、大分子物质的合成、细胞生长与信号转导、细胞周期调控、基因表达调控、应激反应、代谢的翻译后调控、线粒体功能的维持、细胞囊泡运输、自噬、细胞衰老以及程序性细胞死亡^1,2,3。

许多水溶性代谢物的重要功能是通过芽殖酵母 S. cerevisiae^{1,3,4,7,9,14,15,16,17,18}

方案

1. 酵母培养基的制备与灭菌

1. 制备 180 mL 完全酵母提取物-蛋白胨（YP）培养基。完全 YP 培养基含有 1%（w/v）酵母提取物和 2%（w/v）蛋白胨。
2. 将 180 mL YP 培养基均分至四个 250 mL 锥形瓶中。每个锥形瓶中含有 45 mL YP 培养基。
3. 将装有 YP 培养基的锥形瓶在 15 psi/121 °C 条件下高压灭菌 45 分钟。

2. 野生型酵母菌株

1. 使用 BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) 菌株。

3. 在含有2%葡萄糖的YP培养基中培养酵母

1. 将20% (w/v) 葡萄糖储备液在15 psi/121 °C条件下高压灭菌45分钟。
2. 向两个装有45 mL灭菌YP培养基的锥形瓶中，各加入5 mL已高压灭菌的20% (w/v) 葡萄糖储备液。YP培养基中葡萄糖的终浓度为2% (w/v)。
3. 使用微生物接种环将酵母细胞接种至两个含有2%葡萄糖YP培养基的锥形瓶中。
4. 在30 °C、200 rpm转速的摇床中过夜培养酵母细胞。
5. 取一份酵母培养液的等分试样，测定每毫升培养液中的酵母细胞总数，使用血细胞计数板进行细胞计数。<....

结果

为改进酵母细胞内水溶性代谢物的定量评估，我们优化了用于代谢物检测的细胞淬灭条件。该目的下的细胞淬灭涉及迅速终止细胞内的所有酶促反应^31,33,37,38细胞代谢活动的这种抑制是定量水溶性代谢物的任何方法中的关键步骤 体内 因为它可以防止低估其细胞内浓度^31,33,37,38细胞淬灭用于代谢物检测时总会破坏质膜（PM）的完整性（如果存在细胞壁（CW），也会破坏其完整性）；这会导致细胞内代谢物泄漏³¹

讨论

要成功使用此处所述的实验方案，请遵循以下预防措施。氯仿和甲醇会从实验室塑料器皿中提取多种物质，因此需谨慎操作。在涉及接触这两种有机溶剂的步骤中，应避免使用塑料制品。这些步骤应使用硼硅酸盐玻璃移液管，并在使用前用氯仿和甲醇冲洗这些移液管。仅使用由耐有机溶剂的聚丙烯材料制成的微量移液器吸头和离心管。在进行 LC-MS/MS 样品制备时，将玻璃小瓶插入孔板前，务必彻底排除其中的所有气泡。

此处使用的两性离子相色谱柱在每次运行后均需进行充分的再平衡处理，以最大限度减少保留时间漂移。对于色谱柱的再平衡，建议使用相当于色谱柱体积约20倍的再平衡溶液。色谱柱需在0.4 mL/min的较高流速下，用初始流动相冲洗15分钟。为避免在再平衡过程中对色谱柱造成任何损伤，应使柱压保持在制造商建议的最高压力限值以下。

值得注意的是，某些在反相模式下运行的混合分离色谱柱能够分离带电代谢物^40,41。这些混合分离色谱柱基于本实验所用的反相色.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
化学试剂
乙腈	Fisher Scientific	A9554
乙酸铵	Fisher Scientific	A11450
碳酸氢铵	Sigma	9830
蛋白胨	Fisher Scientific	BP1420-2
氯仿	Fisher Scientific	C297-4
葡萄糖	Fisher Scientific	D16-10
L-组氨酸	Sigma	H8125
L-亮氨酸	Sigma	L8912
L-赖氨酸	Sigma	L5501
甲醇	Fisher Scientific	A4564
甲醇	Fisher Scientific	A4564
碘化丙啶	Thermo Scientific	R37108
尿嘧啶	Sigma	U0750
酵母提取物	Fisher Scientific	BP1422-2
硬件设备
500 ml 离心瓶	Beckman	355664
Agilent 1100 系列液相色谱系统	Agilent Technologies	G1312A
Beckman Coulter 离心机	Beckman	6254249
Beckman Coulter 离心机转子	Beckman	JA-10
Centra CL2 临床离心机	Thermo Scientific	004260F
数字温度计	Omega	HH509
带固定夹的泡沫管架套装	Thermo Scientific	02-215-388
SeQuant ZIC-pHILIC 两性离子相色谱柱（5µm 聚合物，150 x 2.1 mm）	Sigma Milipore	150460
Thermo Orbitrap Velos 质谱仪	Fisher Scientific	ETD-10600
超声波破碎仪	Fisher Scientific	15337416
涡旋振荡器	Fisher Scientific	2215365
ZORBAX Bonus-RP 色谱柱，80Å，2.1 x 150 mm，5 µm	Agilent Technologies	883725-901
实验室耗材
2-mL 玻璃样品瓶，带聚四氟乙烯衬垫瓶盖	Fisher Scientific	60180A-SV9-1P
玻璃珠（酸洗，425-600 μm）	Sigma-Aldrich	G8772
血细胞计数板	Fisher Scientific	267110
15-mL 高速玻璃离心管，带聚四氟乙烯衬垫瓶盖	PYREX	05-550
软件
Compound Discoverer 3.1	Fisher Scientific	V3.1
酵母菌株
酵母菌株 BY4742	Dharmacon	YSC1049