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方法文章

果蝇细胞核内Hi-C技术

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DOI：

10.3791/62106

⸱

2021年9月15日

 ,  ,  , 
1Departamento de Genética Molecular, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México

本文内容

摘要

基因组在细胞核空间内以不同的结构形式组织，这些结构可通过染色体构象捕获技术揭示。细胞核内Hi-C方法可获得果蝇细胞系中全基因组范围的染色质相互作用数据，从而生成可在限制性酶切片段水平上以兆碱基分辨率进行分析的接触图谱。

摘要

基因组被组织成由边界分隔的拓扑关联结构域（TAD），这些边界将不同结构域之间的相互作用隔离开来。在果蝇（Drosophila）中，TAD 的形成机制及其边界的特性仍在研究之中。本文所述的细胞核内 Hi-C 方法的应用有助于解析位于隔离 Notch 基因的 TAD 边界处的结构蛋白（AP）结合位点的功能。对导致结构蛋白丢失的结构域边界进行基因改造，会引起 TAD 融合、转录异常以及远距离拓扑结构的改变。这些结果提供了证据，表明遗传元件在果蝇中参与了结构域边界的形成以及基因表达的调控。本文详细描述了细胞核内 Hi-C 方法，该方法提供了评估实验质量的重要质控节点，并附有完整的实验流程。同时展示了在不同基因组尺度上分析基因组互作所需的测序读段数量和有效 Hi-C 配对数量。利用 CRISPR/Cas9 介导的调控元件基因编辑，结合本细胞核内 Hi-C 方案进行高分辨率的基因组互作分析，可能成为研究遗传元件结构功能的有力组合策略。

引言

在真核生物中，基因组被划分为染色体，在间期占据细胞核空间中的特定区域1。构成染色体的染色质可分为两种主要状态：一种是可接近的、允许转录的染色质，另一种是致密的、抑制转录的染色质。这两种染色质状态在细胞核空间中相互分离，极少混合，从而在细胞核内形成两个不同的区室2。在亚兆碱基尺度上，存在分隔高频染色质相互作用区域的边界，这些区域被称为拓扑关联结构域（TADs），标志着染色体的高级结构3,4,5。在哺乳动物中，TAD边界通常由黏连蛋白复合物（cohesin）和CCCTC结合因子（CTCF）占据6,7,8。黏连蛋白复合物可推动染色质外推，并在基因组序列中呈会聚方向排列的CTCF结合位点处停止，从而形成稳定的染色质环结构9,10,13,14。若TAD边界处的CTCF DNA结合位点发生遗传破坏，或CTCF与黏连蛋白的蛋白丰度降低，将导致调控元件之间出现异常相互作用、TAD结构丧失以及基因表达失调9,10,11,13,14。

在果蝇中，拓扑关联结构域（TAD）的边界区域被多种锚定蛋白（AP）占据，包括与边界元件相关的32 kDa蛋白（BEAF-32）、基序1结合蛋白（M1BP）、中心体蛋白190（CP190）、hairy-wing抑制因子（SuHW）以及CTCF，并且这些区域富集了活跃的组蛋白修饰和RNA聚合酶II16,17,18。有研究提出，在果蝇中TAD的形成可能是转录活动的结果13,17,19，而各个独立的锚定蛋白在边界形成及绝缘功能中的确切作用仍在深入研究之中。因此，果蝇中的结构域形成究竟是转录状态相似区域聚集的唯一结果，还是包括CTCF在内的锚定蛋白也参与了边界建立，目前尚未完全阐明。通过染色质构象捕获技术结合下一代测序的发展，现已能够以高分辨率探索基因组间的相互作用。Hi-C实验方案最初采用在溶液中进行连接步骤"in solution"2，旨在避免染色质片段之间产生非特异性连接产物。然而，多项研究指出，数据中有用的信号实际上来源于部分裂解细胞核内、而非完全处于溶液中的染色质片段所形成的连接产物20,21。

随后，该实验方案经过修改，将连接反应在细胞核内进行，作为单细胞Hi-C实验的一部分22。核内Hi-C方案随后被引入群体细胞Hi-C实验中，以在全基因组距离范围内获得更一致的覆盖度，并减少技术性噪声23,24。本文详细描述的实验方案基于群体核内Hi-C方案23,24，并被用于研究在果蝇Notch基因位点的结构域边界上，遗传性删除CTCF和M1BP的DNA结合基序所产生的影响25。结果表明，在边界处改变转录因子结合基序会对Notch结构域的形成产生显著影响，导致Notch位点周围区域出现更大的拓扑结构缺陷，并引起基因表达失调。这表明，结构域边界处的遗传元件在维持果蝇基因组拓扑结构和基因表达中具有重要作用25。

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方案

1. 固定

  1. 从1000万Schneider's S2R+细胞开始，在室温下用含10%胎牛血清（FBS）的Schneider培养基制备17.5 mL细胞悬液。
  2. 加入无甲醇甲醛，使其终浓度为 2%。混匀后室温孵育 10 分钟，期间每分钟轻柔混匀一次。
    注意：甲醛是一种危险化学品。请遵循相应的健康与安全规定，并在通风橱中操作。
  3. 通过加入甘氨酸使终浓度达到 0.125 M 来终止反应，并混匀。室温孵育 5 分钟，随后冰上孵育 15 分钟。
  4. 离心 400 × g 室温孵育5分钟，然后4 °C孵育10分钟；弃去上清液。将沉淀物小心重悬于25 mL冷的1×磷酸盐缓冲液（PBS）中。
  5. 400 × g 离心 g 4 °C下离心10分钟，弃上清液。
    注意：如果继续进行实验方案，请进入步骤 2.1 进行裂解；否则，将沉淀物在液氮中速冻2 并将沉淀物于 -80 °C 保存。

2. 裂解

  1. 将细胞重悬于 1 mL 冰冷裂解缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8；0.2% 非离子型表面活性剂（见材料表）；10 mM NaCl；1×蛋白酶抑制剂）中，并用冰冷裂解缓冲液调整体积至 10 mL。调整体积以获得 1 × 106 个细胞/mL 的浓度。冰上孵育 30 分钟，每隔 2 分钟轻轻颠倒离心管混匀。
  2. 在 4 °C 下以 300 × g 离心 5 分钟收集细胞核，小心弃去上清液。用 1 mL 冷裂解缓冲液洗涤沉淀 1 次，转移至微量离心管中。再用 1 mL 冷的 1.25×限制性缓冲液洗涤沉淀 1 次，并将每份细胞沉淀重悬于 360 µL 的 1.25×限制性缓冲液中。
  3. 每管加入 11 µL 10% 十二烷基硫酸钠（SDS）（终浓度为 0.3%），用移液器轻轻吹打混匀，在 37 °C 下孵育 45 分钟，同时以 700–950 rpm 振荡。孵育过程中多次上下吹打以破坏团块。
  4. 通过每管加入 75 µL 非离子型表面活性剂（10% 溶液，见材料表）（终浓度为 1.6%）以淬灭 SDS，在 37 °C 下孵育 45 分钟，同时以 950 rpm 振荡。孵育期间多次上下吹打以破坏团块。
    注意：若团块较大且难以分散，可在 SDS 和表面活性剂处理期间将转速降低至 400 rpm。若通过移液难以解聚团块，可将样品分为两份；相应调整限制性缓冲液、SDS 和表面活性剂的体积，继续进行透化处理。随后以最低转速（200 × g）离心细胞核，小心弃去上清液，将样品合并至 1X restriction buffer中，继续进行消化步骤。取 10 µL 作为未消化样品（UD）。

3. 酶消化

  1. 每管加入 200 单位（U）Mbo I，37 °C 条件下旋转孵育（950 rpm），时间从 4 小时至过夜，以消化染色质。
  2. 次日，每管再加入额外的 50 U Mbo I，37 °C 条件下旋转孵育（950 rpm）2 小时。
  3. 将管置于 60 °C 孵育 20 分钟以灭活酶，随后置于冰上。
    注意：取 10 µL 作为消化后的样品（D）。

4. DNA 末端的生物素标记

  1. 为了填补限制性片段的突出末端并将DNA末端用生物素标记，向所有试管中加入1.5 µL的10 mM dCTP、dGTP、dTTP，20 µL的0.4 mM生物素-dATP，17.5 µL的Tris低EDTA（TLE）缓冲液[10 mM Tris-HCl，0.1 mM EDTA，pH 8.0]，以及10 µL的5 U/µL Klenow酶（DNA聚合酶I大片段）。轻轻混匀后，在37 °C孵育75分钟，每10秒振荡一次，每次持续30秒，振荡速度为700 rpm。在配制连接反应混合液时，将所有试管置于冰上。

5. 连接

  1. 将每份消化后的染色质混合物转移至分别含有连接反应液的1 mL离心管中（100 µL 10倍连接缓冲液、10 µL 10 mg/mL牛血清白蛋白、15 U T4 DNA连接酶和425 µL双蒸水[ddH2O]）。用移液器轻轻吹打充分混匀，并在16 °C下孵育过夜。

6. 交联逆转与DNA纯化

  1. 每管加入 50 µL 浓度为 10 mg/mL 的蛋白酶 K 以降解蛋白质，在 37 °C 下孵育 2 小时。通过将温度升至 65 °C 并过夜孵育，逆转交联。
  2. 加入 20 µL 浓度为 10 mg/mL 的 RNase A 以降解 RNA，在 37 °C 下孵育 1 小时。
  3. 进行苯酚:氯仿抽提，随后进行乙醇沉淀。
    1. 加入 1 体积苯酚-氯仿，通过倒置充分混匀，获得均一的白色相。
      注意：苯酚为危险化学品，请遵守相应的健康与安全规定，在通风橱中操作。
    2. 在 15,000 × g 下离心 15 分钟，将水相转移至新的 2 mL 微离心管中。用 100 µL TLE 缓冲液对下层进行反向抽提，并将水相转移至同一 2 mL 管中。
    3. 加入 2 体积 100% 乙醇（EtOH）、0.1 体积 3 M 醋酸钠和 2 µL 浓度为 20 mg/mL 的糖原以沉淀 DNA。在 -20 °C 下孵育 2 小时至过夜。
    4. 在 4 °C 下以 15,000 × g 离心 30 分钟，用预冷的 70% EtOH 洗涤沉淀物两次。在室温下干燥沉淀，加入 100 µL TLE 缓冲液重悬。根据制造商说明书，使用可特异性结合 DNA 的荧光染料和荧光计对 DNA 进行定量（材料表）。
      注意：本方案可在此处暂停。连接产物可短期储存于 4 °C，或长期储存于 -20 °C。取 100 ng 样品作为连接样本（L）用于质量控制。

7. 评估 Hi-C 模板质量

  1. 消化与连接的定性对照
    1. 通过逆转交联从 UD 和 D 分装样品中纯化 DNA，并按上述方法进行苯酚:氯仿抽提和乙醇沉淀。
    2. 在1.5%琼脂糖凝胶中各上样100 ng的UD、D和L样品。观察D样品中是否出现中心约在500 bp的弥散条带，而L样品则应显示高分子量条带（参见代表性结果）。
  2. 消化效率的定量对照
    注意：为更准确地评估消化效率，可使用UD和D样品作为模板，采用以下设计的引物进行定量聚合酶链式反应（qPCR）。
    1. 设计一对引物，用于扩增包含所用消化酶识别位点的DNA片段（本方案中为Mbo I），该片段在步骤7.2.3的公式中称为R。
    2. 设计另一对引物，用于扩增一个不含该消化酶识别位点的对照DNA片段（本方案中为Mbo I），该片段在步骤7.2.3的公式中称为C。
    3. 利用扩增所得的循环阈值（Ct值），根据下述公式计算限制性酶切效率：
      % 酶切率 = 100 - 100/2{(CtR - CtC)D - (CtR - CtC)UD}
      其中CtR表示样品D和样品UD中片段R的Ct值，CtC表示相应样品中片段C的Ct值。
      注意：酶切百分比反映了限制性内切酶对含有酶切位点（R）的DNA片段的切割效率，相对于不含该位点的对照（C）片段而言。建议酶切效率应≥ 80%。
  3. 已知相互作用的检测
    1. 通过PCR扩增一个内部连接对照，以检测短程和/或中程至长程的染色质相互作用（参见代表性结果）。
    2. 或者，设计引物以扩增连接产物，其中引物位于相邻限制性片段的正向-正向或反向-反向方向。
  4. 末端补平与生物素标记对照
    1. 通过扩增并消化基因组中已知相互作用或相邻限制性片段之间的连接产物，验证Hi-C标记和连接效率，方法如上所述。
      注意：Mbo I位点（GATC）成功完成末端补平和连接后，会在连接处生成一个新的限制性内切酶Cla I识别位点（ATCGAT），同时恢复原有的Mbo I位点。
    2. 用Mbo I、Cla I或两者共同消化PCR产物。将样品在1.5–2%琼脂糖凝胶上电泳后，通过定量分析被切割和未被切割条带的强度，估算3C和Hi-C连接位点的相对数量26。
      注意：期望效率达到> 70%（参见代表性结果）。

8. 超声处理

  1. 超声处理样品以获得200-500 bp的DNA片段。对于本实验方案所用仪器（见材料表），每管中将样品（5至10 µg）溶于130 µL的ddH2O中，并将仪器设置为产生400 bp片段的条件：液面高度：10；占空比：10%；峰值入射功率（w）：140；每脉冲循环数：200；时间（s）：80。

9. 生物素去除/末端修复

注意：以下步骤已针对 5 µg 的 Hi-C DNA 进行调整。

  1. 为进行生物素去除，将样品（130 µL）转移至新的微量离心管中。加入16 µL 10x连接缓冲液、2 µL 10 mM dATP、5 µL T4 DNA聚合酶（15U）和7 µL ddH2O（总体积为160 µL）。在20 °C孵育30分钟。
  2. 加入5 µL 10 mM dNTPs、4 µL 10x连接缓冲液、5 µL T4多核苷酸激酶（10 U/µL）、1 µL Klenow酶和25 µL ddH2O（总体积为200 µL）。在20 °C孵育30分钟。

10. 大小筛选

  1. 为选择主要在250-550 bp大小范围内的片段，首先按照制造商说明书进行连续的固相可逆固定（SPRI）大小筛选，先用0.6倍体积，再用0.90倍体积，最后使用100 µL TLE洗脱DNA。

11. 生物素下拉/A加尾/接头连接

注意： 通过涡旋重悬磁珠进行洗涤，将样品在旋转轮上旋转 3 分钟，然后短暂离心，将样品置于磁力架上。待磁珠吸附至磁铁后，弃去上清液，并进行下一步洗涤操作。洗涤步骤可在 55 °C 的温控金属块上结合旋转操作进行，以替代旋转轮。

  1. 用TLE将每个样本的终体积补至300 µL用于下拉实验。配制磁珠洗涤缓冲液：1x Tween缓冲液（TB）（TB：5 mM Tris-HCl pH 8.0，0.5 mM EDTA，1 M NaCl，0.05% Tween）、0.5x TB、1x无Tween缓冲液（NTB）（5 mM Tris-HCl pH 8.0，0.5 mM EDTA，1 M NaCl）、2x NTB。
  2. 每文库使用150 µL链霉亲和素连接的磁珠（参见材料表）。用400 µL 1x TB将磁珠洗涤2次。 然后将磁珠重悬于300 µL 2x NTB中。
  3. 将磁珠与300 µL Hi-C材料混合，在旋转仪上室温孵育30分钟，使生物素与链霉亲和素磁珠结合。
  4. 用400 µL 0.5x TB洗涤磁珠，在55 °C孵育3分钟，同时以750 rpm旋转。再用200 µL 1x限制性内切酶缓冲液洗涤磁珠。
  5. 将磁珠重悬于100 µL dATP加尾反应体系中（含5 µL 10 mM dATP、10 µL 10x限制性内切酶缓冲液、5 µL Klenow exo- 和80 µL ddH2O）。37 °C孵育30分钟。
  6. 去除上清液，用400 µL 0.5x TB洗涤磁珠2次，每次在55 °C孵育3分钟并以750 rpm旋转。
  7. 用400 µL 1x NTB洗涤磁珠，然后用100 µL 1x连接缓冲液洗涤。
  8. 将磁珠重悬于50 µL 1x连接缓冲液中，并将悬液转移至新管。加入4 µL预退火的PE接头（15 µM母液）和2 µL T4 DNA连接酶（400 U/µL，即每管800 U），室温孵育2小时。
    注意：通过等体积混合PE 1.0和PE 2.0接头（30 µM母液），室温孵育10分钟进行预退火（参见材料表）。
  9. 去除上清液，用400 µL TB洗涤磁珠2次以重新捕获磁珠。再用200 µL 1x NTB洗涤，接着用100 µL 1x限制性内切酶缓冲液洗涤，最后将磁珠重悬于40 µL 1x限制性内切酶缓冲液中。

12. PCR 扩增

  1. 设置25 µL反应体系的PCR，循环数分别为5、6、7和8个循环。每个PCR反应使用以下组分：
    反应体系配方
    Hi-C磁珠2.5 µL
    10 µM PE PCR引物1（材料表）0.75 µL
    10 µM PE PCR引物2（材料表）0.75 µL
    10 mM dNTP0.6 µL
    5x反应缓冲液5 µL
    DNA聚合酶0.3 µL
    ddH2O14.65 µL
    总计25 µL
    循环数温度时间
    198 °C30 s
    n个循环98 °C10 s
    65 °C30 s
    72 °C30 s
    172 °C7 min

13. 最终PCR扩增

  1. 使用与上述相同的条件以及选定的循环次数进行最终PCR扩增。以5 µL Hi-C磁珠作为模板，在50 µL反应体系中分装样品。
  2. 收集所有PCR反应产物并转移至一个新的离心管中。使用磁力架去除链霉亲和素磁珠，回收上清液（PCR产物）。将磁珠转移至新的离心管中，按照步骤11.2.9所述方法洗涤磁珠，并保存于1×限制性酶切缓冲液中，置于4 °C备用。
  3. 根据制造商说明书，使用等体积0.85倍的SPRI磁珠纯化PCR产物。用30 µL TLE缓冲液洗脱。
  4. 使用荧光定量仪对Hi-C文库进行定量，并通过基于芯片的毛细管电泳确认文库质量。
  5. 作为最后的质量检测步骤，取1 µL Hi-C文库作为模板，在与步骤12.1所述相同条件下进行10个循环的PCR扩增。将PCR产物均分至两个微量离心管中：其中一份用Cla I进行消化，另一份不作处理作为对照。将产物在1.5–2%琼脂糖凝胶中电泳（参见代表性结果）。
  6. 在合适的测序平台上进行50 bp或75 bp的双端测序。

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结果

下文描述了一次成功的 Hi-C 实验方案的结果（Hi-C 实验流程的概要见图1A）。在细胞核内进行的 Hi-C 实验过程中包含多个质量控制检查点。在染色质限制性酶切之前（UD）和之后（D），以及连接反应后（L），分别采集了样品。随后逆转交联，并纯化 DNA，进行琼脂糖凝胶电泳。当使用 Mbo I 酶切成功时，可观察到大小为 200–1000 bp 的弥散条带（图1B）。预期的片段大小取决于所选用的限制性内切酶。若连接反应成功，则在凝胶顶部可见一条高分子量的条带（图1B）。如实验方案中详细所述，还可通过 qPCR 确认酶切效率。可接受的酶切效率应达到 80% 或更高（图1C）。

为了详细评估 Hi-C 连接效率，可以设计引物以扩增内部连接产物对照，其中引物位于相邻限制性片段上的正向-正向或反向-反向方向。或者，也可以设计引物以扩增已知的相互作用区域...

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讨论

本文介绍的细胞核内Hi-C方法使得能够在高分辨率下深入探究黑腹果蝇（Drosophila）基因组的拓扑结构，从而在不同基因组尺度上观察基因组相互作用，从启动子与增强子等调控元件之间的染色质环，到拓扑关联结构域（TADs）以及大尺度区室的鉴定25。相同技术经过部分修改后也已高效应用于哺乳动物组织33。例如，在处理组织样本而非单细胞悬液时，需将组织通过70 µm滤网过滤，并在使用Dounce匀浆器匀浆的同时进行裂解步骤。此外，由于哺乳动物基因组大小是果蝇基因组的25倍，因此构建1–5 kb分辨率矩阵所需的有效读段对数量更多。细胞核内Hi-C方法与原始Hi-C方法2的主要区别在于：前者在连接反应前避免使用1% SDS在65 °C条件下裂解细胞核，从而保持细胞核的完整性；并且连接反应体积为1 mL，而非7 mL23,24。

该实验方...

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披露

作者声明无竞争利益。

致谢

本工作由墨西哥国立自治大学（UNAM）技术创新与研究支持计划（PAPIIT）资助，项目编号为 IN207319，以及由国家科学技术委员会（CONACyT-FORDECyT）资助，项目编号为 303068。A.E.-L. 是由国家科学技术委员会（CONACyT）资助的硕士研究生，CVU 编号为 968128。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
16% (vol/vol) 多聚甲醛溶液Agar ScientificR1026
生物素-14-dATPInvitrogenCA1524-016
ClaI 酶NEBR0197S
COVARIS 超声破碎仪CovarisLE220-M220
Cut Smart 缓冲液NEBB72002S
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）1xLife Technologies41965-039
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 磁珠Invitrogen65002
胎牛血清（FBS），无菌过滤SigmaF9665
Klenow DNA 聚合酶 I 大片段NEBM0210L
Klenow exo(-)NEBM0210S
连接缓冲液NEBB020S
MboI 酶NEBR0147M
NP40-IgepalSIGMACA-420用于裂解缓冲液中的非离子型表面活性剂
PE 接头 1.0Illumina5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG
GAATGCCGAG-3'
PE 接头 2.0Illumina5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT
CTTCCGATCT-3'
PE PCR 引物 1.0Illumina5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT
CTACACTCTTTCCCTACACGACG
CTCTTCCGATCT-3'
PE PCR 引物 2.0Illumina5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
ATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA
ACCGCTCTTCCGATCT-3'
苯酚:氯仿:异戊醇 25:24:1SIGMAP2069
引物 1（已知互作，图 2A）Sigma5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3'
引物 2（已知互作，图 2A）Sigma5'-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3'
蛋白酶抑制剂混合片剂Roche4693132001
蛋白酶 KRoche3115879001
QubitThermoFisherQ33327
RNaseRoche10109142001
SPRI 磁珠BeckmanB23318
T4 DNA 连接酶Invitrogen15224-025
T4 DNA 聚合酶NEBM0203S
T4 多核苷酸激酶（PNK） NEBM0201L
TaqPhusionNEBM0530SDNA 聚合酶
Triton X-100用于淬灭 SDS 的非离子型表面活性剂

参考文献

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