果蝇细胞核内Hi-C技术

摘要

基因组在细胞核空间内以不同的结构形式组织，这些结构可通过染色体构象捕获技术揭示。细胞核内Hi-C方法可获得果蝇细胞系中全基因组范围的染色质相互作用数据，从而生成可在限制性酶切片段水平上以兆碱基分辨率进行分析的接触图谱。

摘要

基因组被组织成由边界分隔的拓扑关联结构域（TAD），这些边界将不同结构域之间的相互作用隔离开来。在果蝇（Drosophila）中，TAD 的形成机制及其边界的特性仍在研究之中。本文所述的细胞核内 Hi-C 方法的应用有助于解析位于隔离 Notch 基因的 TAD 边界处的结构蛋白（AP）结合位点的功能。对导致结构蛋白丢失的结构域边界进行基因改造，会引起 TAD 融合、转录异常以及远距离拓扑结构的改变。这些结果提供了证据，表明遗传元件在果蝇中参与了结构域边界的形成以及基因表达的调控。本文详细描述了细胞核内 Hi-C 方法，该方法提供了评估实验质量的重要质控节点，并附有完整的实验流程。同时展示了在不同基因组尺度上分析基因组互作所需的测序读段数量和有效 Hi-C 配对数量。利用 CRISPR/Cas9 介导的调控元件基因编辑，结合本细胞核内 Hi-C 方案进行高分辨率的基因组互作分析，可能成为研究遗传元件结构功能的有力组合策略。

引言

在真核生物中，基因组被划分为染色体，在间期占据细胞核空间中的特定区域¹。构成染色体的染色质可分为两种主要状态：一种是可接近的、允许转录的染色质，另一种是致密的、抑制转录的染色质。这两种染色质状态在细胞核空间中相互分离，极少混合，从而在细胞核内形成两个不同的区室²。在亚兆碱基尺度上，存在分隔高频染色质相互作用区域的边界，这些区域被称为拓扑关联结构域（TADs），标志着染色体的高级结构^3,4,5。在哺乳动物中，TAD边界通常由黏连蛋白复合物（cohesin）和CCCTC结合因子（CTCF）占据^6,7,8。黏连蛋白复合物可推动染色质外推，并在基因组序列中呈会聚方向排列的CTCF结合位点处停止，从而形成稳定的染色质环结构^9,10,13,

方案

1. 固定

1. 从1000万Schneider's S2R+细胞开始，在室温下用含10%胎牛血清（FBS）的Schneider培养基制备17.5 mL细胞悬液。
2. 加入无甲醇甲醛，使其终浓度为 2%。混匀后室温孵育 10 分钟，期间每分钟轻柔混匀一次。
   注意：甲醛是一种危险化学品。请遵循相应的健康与安全规定，并在通风橱中操作。
3. 通过加入甘氨酸使终浓度达到 0.125 M 来终止反应，并混匀。室温孵育 5 分钟，随后冰上孵育 15 分钟。
4. 离心 400 × g 室温孵育5分钟，然后4 °C孵育10分钟；弃去上清液。将沉淀物小心重悬于25 mL冷的1×磷酸盐缓冲液（PBS）中。
5. 400 × g 离心 g 4 °C下离心10分钟，弃上清液。
   注意：如果继续进行实验方案，请进入步骤 2.1 进行裂解；否则，将沉淀物在液氮中速冻₂ 并将沉淀物于 -80 °C 保存。

2. 裂解

1. 将细胞重悬于 1 mL 冰冷裂解缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8；0.2% 非离子型表面活性剂（见材料表）；10 mM NaCl；1×蛋白酶抑制剂）中，并用冰冷裂解缓冲液调整体积至 10 mL。调整体积以获得 1 × 10⁶....

结果

下文描述了一次成功的 Hi-C 实验方案的结果（Hi-C 实验流程的概要见图1A）。在细胞核内进行的 Hi-C 实验过程中包含多个质量控制检查点。在染色质限制性酶切之前（UD）和之后（D），以及连接反应后（L），分别采集了样品。随后逆转交联，并纯化 DNA，进行琼脂糖凝胶电泳。当使用 Mbo I 酶切成功时，可观察到大小为 200–1000 bp 的弥散条带（图1B）。预期的片段大小取决于所选用的限制性内切酶。若连接反应成功，则在凝胶顶部可见一条高分子量的条带（图1B）。如实验方案中详细所述，还可通过 qPCR 确认酶切效率。可接受的酶切效率应达到 80% 或更高（图1C）。

为了详细评估 Hi-C 连接效率，可以设计引物以扩增内部连接产物对照，其中引物位于相邻限制性片段上的正向-正向或反向-反向方向。或者，也可以设计引物以扩增已知的相互作用区域.......

讨论

本文介绍的细胞核内Hi-C方法使得能够在高分辨率下深入探究黑腹果蝇（Drosophila）基因组的拓扑结构，从而在不同基因组尺度上观察基因组相互作用，从启动子与增强子等调控元件之间的染色质环，到拓扑关联结构域（TADs）以及大尺度区室的鉴定²⁵。相同技术经过部分修改后也已高效应用于哺乳动物组织³³。例如，在处理组织样本而非单细胞悬液时，需将组织通过70 µm滤网过滤，并在使用Dounce匀浆器匀浆的同时进行裂解步骤。此外，由于哺乳动物基因组大小是果蝇基因组的25倍，因此构建1–5 kb分辨率矩阵所需的有效读段对数量更多。细胞核内Hi-C方法与原始Hi-C方法²的主要区别在于：前者在连接反应前避免使用1% SDS在65 °C条件下裂解细胞核，从而保持细胞核的完整性；并且连接反应体积为1 mL，而非7 mL^23,24。

该实验方.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
16% (vol/vol) 多聚甲醛溶液	Agar Scientific	R1026
生物素-14-dATP	Invitrogen	CA1524-016
ClaI 酶	NEB	R0197S
COVARIS 超声破碎仪	Covaris	LE220-M220
Cut Smart 缓冲液	NEB	B72002S
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）1x	Life Technologies	41965-039
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 磁珠	Invitrogen	65002
胎牛血清（FBS），无菌过滤	Sigma	F9665
Klenow DNA 聚合酶 I 大片段	NEB	M0210L
Klenow exo(-)	NEB	M0210S
连接缓冲液	NEB	B020S
MboI 酶	NEB	R0147M
NP40-Igepal	SIGMA	CA-420	用于裂解缓冲液中的非离子型表面活性剂
PE 接头 1.0	Illumina	5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG GAATGCCGAG-3'
PE 接头 2.0	Illumina	5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCT-3'
PE PCR 引物 1.0	Illumina	5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT CTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCT-3'
PE PCR 引物 2.0	Illumina	5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG ATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA ACCGCTCTTCCGATCT-3'
苯酚:氯仿:异戊醇 25:24:1	SIGMA	P2069
引物 1（已知互作，图 2A）	Sigma	5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3'
引物 2（已知互作，图 2A）	Sigma	5'-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3'
蛋白酶抑制剂混合片剂	Roche	4693132001
蛋白酶 K	Roche	3115879001
Qubit	ThermoFisher	Q33327
RNase	Roche	10109142001
SPRI 磁珠	Beckman	B23318
T4 DNA 连接酶	Invitrogen	15224-025
T4 DNA 聚合酶	NEB	M0203S
T4 多核苷酸激酶（PNK）	NEB	M0201L
TaqPhusion	NEB	M0530S	DNA 聚合酶
Triton X-100			用于淬灭 SDS 的非离子型表面活性剂