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方法文章

一种用于评估组织碎化术与溶栓药物溶栓功效的体外系统

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DOI：

10.3791/62133

⸱

2021年6月4日

 ,  , 
1Department of Radiology, University of Chicago, 2Graduate Program in Medical Physics, University of Chicago

本文内容

摘要

目前正在开发用于治疗深静脉血栓形成的组织碎化辅助溶栓递送（即溶栓碎化术）。本文介绍了一种体外实验方法，用于评估该联合疗法的疗效。文中讨论了血栓模型、影像引导以及治疗效果评估的关键实验方案。

摘要

深静脉血栓形成（DVT）是一个全球性的健康问题。针对严重阻塞实现血管再通的主要方法是导管定向溶栓（CDT）。为了减轻CDT相关的腐蚀性副作用及治疗时间过长的问题，目前正在开发辅助性和替代性治疗策略。其中一种方法是组织碎化术（histotripsy），即利用聚焦超声通过气泡云成核来消融组织。临床前研究已表明，组织碎化术与溶栓药物在血栓降解方面具有显著协同作用。本报告概述了一种用于评估组织碎化术辅助溶栓治疗（即溶栓碎化术，lysotripsy）效果的台式实验方法。

将由新鲜人静脉血制备的血凝块引入一个流动通道中，该通道的尺寸和声机械特性模拟髂股静脉。通道以血浆灌注，并加入溶栓用 重组组织型纤溶酶原激活剂。使用专为治疗股静脉血栓设计的聚焦超声源在血凝块内产生气泡云。通过电动定位装置沿血凝块长度方向移动超声焦点。在每个超声辐照位置，被动记录气泡云产生的声发射信号，并进行波束成形以生成被动空化图像。评估治疗效果的指标包括血凝块质量减少（整体治疗效果），以及灌注液中D-二聚体（纤维蛋白溶解）和血红蛋白（溶血）的浓度。该体外实验设计存在一定局限性，例如无法评估体内副作用或血栓溶解过程中血流速度的动态变化。总体而言，该实验系统为评估基于组织碎裂术（histotripsy）的深静脉血栓（DVT）治疗策略的有效性提供了一种有效方法。

引言

血栓形成是指在原本健康的血管内形成血凝块，从而阻碍血液循环1,2。静脉血栓栓塞症每年在美国造成37.5万至42.5万例病例，医疗费用高达70亿至100亿美元3。肺栓塞是指肺动脉被阻塞，是静脉血栓栓塞症最严重的后果。肺动脉阻塞的主要来源是深静脉血栓，尤其是髂股静脉节段的血栓4,5,6。深静脉血栓（DVT）除可导致肺部阻塞外，本身也具有一系列继发性病变，长期并发症包括疼痛、肿胀、腿部溃疡和肢体截肢7,8,9。对于严重阻塞，导管定向溶栓（CDT）是实现血管再通的首选方法10。CDT的治疗效果受多种因素影响，包括血栓的年龄、位置、大小、成分、病因以及患者的危险分层11。此外，CDT可能伴随血管损伤、感染、出血并发症以及治疗时间较长等问题10。新一代装置旨在将机械性取栓与溶栓药物相结合（即药物机械联合取栓）12,13。与单纯CDT相比，使用这些装置可降低溶栓药物剂量，从而减少出血并发症并缩短治疗时间12,13,14。然而，这些装置仍存在出血副作用以及对慢性血栓清除不完全的问题15。因此，亟需一种辅助策略，能够在降低出血风险的同时实现血栓的完全清除。

一种潜在的方法是组织碎化辅助的溶栓治疗，称为溶栓碎化（lysotripsy）。组织碎化是一种非侵入性治疗方式，利用聚焦超声在组织中诱导产生气泡云16。气泡活动并非通过外源性成核产生，而是通过施加具有足够拉伸力的超声脉冲，激活组织（包括血栓）内部固有的成核位点而形成17,18。气泡云的机械振荡对血栓施加应变，将其结构粉碎为无细胞碎片19。组织碎化产生的气泡活动在体内和体外均能有效降解收缩和未收缩的血凝块20,21,22。先前的研究23,24表明，组织碎化与溶栓剂 重组组织型纤溶酶原激活剂（rt-PA） 联合使用，相比单独使用溶栓剂或单独使用组织碎化，显著提高了治疗效果。目前认为，组织碎化气泡活动相关的两个主要机制是疗效提升的原因：1）由于溶栓剂递送增强而促进纤维蛋白溶解；2）血栓内红细胞发生溶血。血栓的大部分质量由红细胞构成24，因此，追踪红细胞的降解可作为样本消融的良好替代指标。其他形成的血栓成分也可能在组织碎化气泡活动下被破坏，但本方案中不予考虑。

本文概述了一种在体外使用组织碎裂术（lysotripsy）治疗深静脉血栓（DVT）的实验台方法。该方案描述了组织碎裂源的关键操作参数、治疗效果的评估方法以及影像引导技术。方案内容包括设计模拟髂股静脉节段的流动通道，以及制备人全血血栓。实验流程详细说明了组织碎裂源和成像阵列的定位，以实现对置于流动通道内血栓的组织碎裂暴露。文中定义了实现血栓破坏并最小化靶外气泡活动的相关超声辐照参数。同时展示了利用超声成像进行引导及气泡活动监测的方法24。用于量化治疗效果的指标，如血栓质量损失、D-二聚体（纤维蛋白溶解）和血红蛋白（溶血）水平，也一并列出23,24,25,26,27。总体而言，本研究为实施和评估组织碎裂术治疗深静脉血栓的有效性提供了有效手段。

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方案

本研究结果所用静脉人血在获得机构内部审查委员会批准（IRB #19-1300）及志愿者捐献者签署书面知情同意书后采集并用于形成血凝块24本节概述 一种评估溶石碎石疗效的设计方案。该方案基于Bollen等人先前的研究工作。24.

1. 血栓建模

注意：为了确保凝块的稳定性并最大程度地促进收缩，应在实验前2周内且至少3天前制备凝块28。凝块的制备须在获得当地机构审查委员会批准后进行。

  1. 准备用于储存血液的硼硅酸盐巴斯德吸管（吸管规格见材料表）。使用硼硅酸盐管是因为该材料具有亲水性，可促进血小板活化和血块收缩29。通过在本生灯上加热密封吸管尖端。
  2. 采集新鲜的人体静脉血。将采集的全血按每份2 mL分装至所需数量的血块中。将每份2 mL的血样转移至一根巴斯德吸管中。
    注意：应在采血后约3分钟内完成步骤1.2，以防止血液在转移至吸管前发生凝固。 同时，确保献血志愿者未服用可能影响凝血级联反应的药物（例如抗凝剂或血小板抑制剂）。
  3. 将分装好的血液样本（数量等于所需血块数）放入37 °C水浴中孵育3小时。
  4. 将吸管在4 °C下至少保存3天，以使血块充分收缩28。随着血块收缩，可在吸管内血块顶部观察到血清积聚。血块在收缩完成后2周内对rt-PA的反应保持稳定28。

2. 水箱准备

  1. 用水箱装入反渗透水。在水箱底部表面铺设吸声材料，以减少治疗或成像超声脉冲的反射。使用水处理系统对水进行脱气和过滤，以最大限度减少气泡核的形成。
    注意：一种过滤水的方法是使用在线过滤器。用于生成代表性结果的袋子规格见材料表。
  2. 在水箱底部表面放置两个加热元件。将水加热至 37.3 ˚C，以实现最大的溶菌酶活性30。
  3. 建立如图 1A所示的流动通道。该流动通道由管路、一个具有代表髂股静脉材料和几何特性的模型血管、血浆储液器以及位于储液器最远端的注射器组成（材料表）。注射器连接至泵，用于在实验期间调节通道内的流动。
  4. 在脱气/过滤/加热阶段（步骤 2.1 和 2.2）期间，手动将流动通道浸入水箱中，使其达到生理温度。

3. 血浆与rt-PA混合物的制备

  1. 实验前
    ​注意：当储存在 -80 °C 时，血浆至少可稳定保存 2.5 年31，而重组组织型纤溶酶原激活剂（rt-PA）至少可稳定保存 7 年32。因此，在此期限内的任意时间执行步骤 3.1，以确保这两种组分的稳定性。
    1. 将厂家提供的粉末状 rt-PA 用无菌水稀释至 1 mg/mL。
    2. 将稀释后的 rt-PA 每 100 µL 分装至 0.5 mL 离心管中，并于 -80 °C 保存。
    3. 将 35 mL 人类新鲜冷冻 O 型血浆分装至 50 mL 离心管中，每管一份。将离心管于 -80 °C 保存。
  2. 实验当天
    1. 从冰箱中取出血浆分装样品。根据当天待测血栓的数量取出相应份数的样品。将冷冻的分装样品浸入 37 °C 水浴中解冻（约 10 分钟）。
    2. 血浆完全解冻后，将其倒入经超纯水冲洗三次的烧杯中。用铝箔轻轻覆盖烧杯口以防止污染，并将烧杯置于水浴中。铝箔应保持松弛，以允许空气与血浆接触。
    3. 使血浆在 37 °C 下与大气压平衡至少 2 小时。
    4. 取出冷冻的 rt-PA 管，置于冰上备用，每次实验使用一管。
    5. 在 50 mL 三角烧瓶中配制低凝胶浓度琼脂糖（2%），将琼脂糖溶于超纯水中。琼脂糖溶液的总体积应保证每个待分析样本约有 2 mL 可用。将烧瓶放入微波炉加热至沸腾起泡。用防水螺旋盖密封烧瓶，并将其与血浆一同浸入水浴中。
      ​注意：此步骤可确保在组织碎化超声处理后，有琼脂糖用于固定暴露的血栓片段以进行组织学分析。

4. 设置组织碎化声源和成像阵列

  1. 确保能够通过制造商提供的指令和命令，在编程平台的运行时环境中控制电动定位器。检查系统的电机是否已连接到具有运行时环境的计算机的相应端口。
  2. 如图1B所示，将组织碎裂源安装在电动定位系统上。
  3. 根据制造商的规定，通过适当的连接器（例如BNC电缆）将组织碎裂源连接至其驱动电子设备（例如功率放大器和函数发生器）。
    注意：确保组织碎裂源的驱动电子设备可通过第4.1步中使用的运行时环境进行控制。
  4. 用探头套覆盖成像阵列，并如图2所示，将阵列同轴固定在组织碎裂源的开口中。务必明确成像平面相对于组织碎裂源方向的取向。
  5. 将成像阵列连接至超声扫描系统。确保该系统能够根据扫描仪制造商提供的指令，控制成像阵列的操作与触发，并采集成像数据。
  6. 如图1A所示，在脱气过程中将组织碎裂源/成像阵列浸入水箱中。使用注射器轻轻清除组织碎裂源或成像阵列表面的任何气泡。
    注意：操作前应将组织碎裂源和成像阵列完全浸没于水中。避免触碰组织碎裂源的表面。
  7. 使用成像阵列及扫描仪内置命令，以每秒20帧的速率获取B模式图像。调整成像窗口，确保在这些实时图像中可观察到组织碎裂源的焦点。
    注意：假设治疗源焦区的尺寸已知。
  8. 设置组织碎裂源的工作参数，包括基频（例如1.5 MHz）、脉冲重复频率（例如20–100 Hz）、脉冲持续时间（例如每脉冲1–20个周期）以及每个位置的总脉冲数（例如100–2,000）18,23,24,33。若未能实现充分的血栓溶解，或气泡活动超出模型血管管腔范围，则需修改这些参数。可通过组织碎裂源制造商提供的协议，或使用能与该源通信的编程平台（步骤4.3）来设定这些参数。
  9. 根据步骤4.8中使用的制造商协议或编程平台，在仅含脱气水且周围无任何障碍物的条件下，以设定参数运行组织碎裂源。逐渐增加施加于组织碎裂源的电压，直至形成气泡云。
  10. 利用步骤4.7中的实时成像，调整成像阵列在共焦换能器开口内的位置，使气泡云大致位于图像窗口中心。气泡云即为成像平面上高回声像素的区域（图3）。拧紧螺丝，将成像阵列牢固固定在换能器开口内。
    注意：若阵列对准正确，气泡云的方位位置在成像平面上应约为0 mm。由于成像阵列可能略微突出于治疗源内表面，因此气泡云的径向位置可能与源的焦距不同。
  11. 确定成像平面中气泡云的位置。将组织碎裂源的焦点定义为气泡云的中心（图3）。
  12. 记录在成像窗口中检测到的焦点位置（步骤4.11）（图3）。若成像平台支持，可使用光标标记焦点位置，以记录其在成像窗口中的坐标。
  13. 停止超声辐照，并将施加于组织碎裂源的电压设为0 V。

5. 凝块制备

  1. 用镊子剪断移液管的密封端，取出凝块。让凝块连同血清一起滑入培养皿中。如果凝块未脱落，可通过生理盐水冲洗另一端，施加轻微压力以取出凝块。
  2. 使用解剖刀将凝块切成1 cm长度，尽量从凝块中心部位获取均匀的一段（即避开在移液管顶部或底部形成的凝块部分）。
  3. 用清洁擦拭纸轻轻吸干切下的凝块片段，去除多余液体。
  4. 使用镊子将凝块片段轻柔地放置于天平上，并记录其重量。
  5. 手动将流动通道从水箱中抬起，并从流动通道上取下模型血管。
  6. 用镊子将凝块放入模型血管中，并重新将模型血管固定至流动通道。
    注意：可在模型血管内放置一根尼龙棒，以防止凝块因流动而向下游移动。
  7. 将流动通道放入水箱时，应使相对于储液器的一端（近端）低于远端。以这种方式倾斜流动通道，可防止在步骤6.1中血浆流经通道时在模型血管内截留气泡。
  8. 使用移液管向储液器中加入30 mL血浆，并监测温度，直至达到至少36 °C。
  9. 使用移液管将rt-PA（80.4 µg溶于30 mL血浆中，终浓度2.68 µg/mL）加入血浆储液器中。用移液管搅拌血浆，确保rt-PA在储液器内均匀分布。

6. 启动流动通道

  1. 通过注射泵从储液器中将血浆吸入流道，直至血浆充满模型血管。
    注意：如果血栓未与尼龙棒齐平，可使用注射泵以 60 mL/min 的速度进行短促抽吸，尝试将血浆推过血栓下游，或手动抽吸注射器。此过程中应限制吸入的血浆量，或使用额外的血浆/重组组织型纤溶酶原激活剂（rt-PA）补充储液器，以确保流道内保持 30 mL 溶液。
  2. 使用电动定位器，结合成像脚本（步骤 4.7）将成像阵列与血栓长度方向平行对齐。平行对齐可使操作者通过视觉确认血栓位置正确，并确保模型血管内无气泡存在。
  3. 手动调平模型血管，并通过成像窗口进行目视检查，确保无空气气泡存在（步骤 4.7）。

7. 实验步骤

  1. 预处理
    ​注意：此步骤旨在为组织碎裂源/成像阵列规划路径，以实现沿血栓长度方向均匀的组织碎裂暴露。
    1. 使用电动定位器对齐成像阵列，使成像平面与血栓的横截面平行（即垂直于步骤6.2中描述的方向）。
    2. 在成像窗口引导下（步骤4.7），使用电动定位器将组织碎裂源移动至相对于储液器的血栓近端。此时，调整组织碎裂源的位置，使步骤4.12中标记的焦点与血栓中心对齐。
    3. 确定沿血栓长度的声照射路径。为定义该路径，沿血栓长度方向设置三个航路点（即电动机位置，使组织碎裂气泡活动被限制在血栓内部），间隔为5 mm。对齐航路点，使组织碎裂源沿该路径的整体运动方向与系统内血流方向一致（即第一个航路点位于相对于储液器最靠近近端的血栓端，第三个航路点位于相对于储液器的远端位置）。
    4. 在最终确定每个航路点之前，使用与步骤4.8相同的声照射参数从组织碎裂源发射测试脉冲，但将总暴露量减少至10个脉冲。如有必要，使用电动定位器调整组织碎裂源的位置，以将气泡活动限制在血栓内部。
    5. 在每个航路点处，使用制造商提供的命令保存电动机位置，方法类似于步骤4.1。
  2. 治疗
    ​注意：此步骤定义了根据预处理步骤中设定的路径沿血栓长度进行治疗的操作流程。
    1. 以0.65 mL/min运行注射泵，并等待血浆弯月面移动。该流速模拟髂股血管近乎完全闭塞的情况24,34。
    2. 对步骤7.1.3中创建的路径进行插值处理，在已建立的航路点之间以固定步长（例如0.5 mm）设置中间步骤。选择的步长应小于沿血栓长度方向测得的焦点区域宽度的一半（即成像阵列的升降方向）。在每个路径位置，使用电动定位器移动组织碎裂源，并采用步骤4.8中定义的声照射参数。
    3. 在每个路径位置应用组织碎裂脉冲期间，通过成像窗口（步骤4.7）监测/成像气泡活动。将图像中心对准组织碎裂焦点，图像范围覆盖方位向和距离向各15 mm。在每个位置应用组织碎裂脉冲之前，通过在编程平台中创建脚本获取B模式图像，以可视化血栓和模型血管。确保该脚本使用制造商命令与扫描仪建立通信。
    4. 在应用组织碎裂脉冲期间，在步骤7.2.3的脚本中实现声发射信号的采集，用于事后生成被动空化成像35。每施加10次治疗脉冲后采集一次被动空化图像。在8个递增深度上应用50的平坦时间增益补偿，直至成像深度末端。选择合适的采集窗口大小，以确保完整捕获来自血栓的全部信号，同时因加窗导致的能量损失最小化35。
    5. 若出现靶外气泡云，使用电动定位器原位调整换能器位置。
      ​注意：监测成像阵列是否存在漏触发情况。调整采集的成像数据集数量，确保在下一次触发前完成数据存储。

8. 实验后处理步骤

  1. 手动将模型血管从水箱中抬起，通过重力作用排出灌注液。排水过程中务必保持流道水平，以防止血栓随液体向下游移动并脱离模型血管。
  2. 通过注射泵以极低流速从流道中抽取血浆溶液，将全部灌注液收集至小烧杯中用于后续分析（图4A）。
  3. 断开模型血管并取出血栓。如有必要，向模型血管内注入少量生理盐水，以轻柔地松动血栓。
  4. 参照步骤1.2.3的方法擦拭血栓，并使用天平称重，以评估血栓质量的减少情况。
  5. 为分析D-二聚体含量，先在微量离心管中加入100 mg氨基己酸，再加入1 mL灌注液，用移液器充分混匀。采用乳胶免疫比浊法测定样品中的D-二聚体浓度36。
  6. 为评估溶血情况，将1 mL灌注液加入离心管中，在610 × g （3,500 rpm）条件下离心10分钟。取0.5 mL上清液（浓缩液）与0.5 mL Drabkin试剂混合，室温静置15分钟。将200 µL混合液转移至孔板中，如图4B所示。使用酶标仪在540 nm波长处读取吸光度，图4C（Drabkin法37）。
  7. 组织学评估
    1. 使用手术刀从血栓中心切取一段长约2–3 mm的组织切片。
    2. 将切片放入包埋盒中，并保持其方向与组织碎裂脉冲传播方向一致。
    3. 向包埋盒中加入2 mL在步骤3.2.5中配制的低凝胶点琼脂糖溶液，以固定血栓位置。
    4. 将样本置于10%福尔马林中固定24小时，24小时后转移至70%乙醇中，并进行标准的苏木精-伊红染色38。

9. 被动式空化成像分析

  1. 使用基于稳健Capon波束成形器的算法处理在组织碎化激发期间（步骤7.2.4）从成像阵列获取的信号39，以生成每个治疗位置处气泡云所产生的声发射图像。
    注意：若要生成定量图像，请遵循Haworth等35中描述的步骤；否则，图像中每个像素值应代表相应位置处气泡云的相对声学能量（单位：V2）。
  2. 对步骤7.2.3中获取的B模式图像进行分割，以区分代表血栓和模型血管的像素。
  3. 将被动空化图像与B模式图像配准，如图5B所示，并在暴露期间对血栓区域内的声学能量进行积分求和35。

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结果

本研究中概述的实验方案重点介绍了体外深静脉血栓（DVT）模型中静脉血栓建模、组织碎裂术（lysotripsy）用于血栓破坏以及超声成像的详细步骤。所采用的方法展示了评估重组组织型纤溶酶原激活剂（rt-PA）与组织碎裂术气泡云协同作用下血栓破坏效果所需的各个步骤。该台式实验装置设计用于模拟髂股静脉的声学、力学和几何特性。图1A展示了一个具有髂股静脉声学、力学和几何特性的模型血管。将血栓置于模型血管内，以模拟部分阻塞性血栓。通过储液器以0.65 mL/min的流速向血栓灌注血浆和rt-PA，该流速与高度阻塞血管中的缓慢血流速率一致34。

将一个基频为1.5 MHz、长轴9 cm、短轴7 cm、焦距6 cm的椭圆聚焦换能器安装在定位系统上，如图1B所示（换能器结构见图2A）。一个覆盖超声耦合凝胶和乳胶套的成像阵列，如图2B...

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讨论

本方案提出了一种用于量化溶栓碎石术治疗效果的模型。尽管关键细节已作讨论，但要成功实施该方案，仍需考虑若干关键因素。重组组织型纤溶酶原激活剂（rt-PA）的酶活性具有阿伦尼乌斯温度依赖性30。温度也会影响声波在水和组织中的传播速度，温度变化可能导致焦点区域几何形态发生轻微改变。因此，水浴温度应严格控制在 37 ˚C。本方案中使用的 rt-PA 剂量（2.68 µg/mL）与临床上其他药物机械取栓策略所采用的剂量一致42。在步骤 5.8 中，将 30 mL 血浆转移至储液器，而步骤 3.1.3 中记录的等分体积为 35 mL。这部分额外的血浆用于补偿在 37 ˚C 下为平衡大气压而长时间温育过程中因蒸发造成的血浆损失。

治疗换能器的焦距、孔径宽度和频率决定了焦点区域的大小和深度。因此，应根据目标血管的直径和深度选择合适的换能器（例如股静脉：深度为2-4 cm，直径为0.6-1.2 cm）43。机械消融的范围仅限于气泡云所覆盖的区域。因此，理解声...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院资助，项目编号R01HL13334。作者感谢Kevin Haworth博士在Drabkin法测定中的协助，以及Viktor Bollen博士在实验方案设计过程中提供的支持。作者还感谢Adam Maxwell博士在组织碎裂源设计方面给予的指导。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
吸音板Precision acousticsF28-SMALL-M300 mm × 300 mm × 10 mm
硼硅酸盐巴斯德吸管Fisher Scientific1367820A长度14.6 cm，容量2 mL
离心管Eppendorf22364111容量1.5 mL
德拉布金试剂盒Sigma AldrichD5941-6VL
抽吸注射器Cole-ParmerEW-07945-43容量60 mL
过滤袋McMaster-Carr5162K111可去除粒径达1微米的颗粒
流动通道管路McMaster-Carr5154K25聚乙烯内衬EVA塑料管（外径：3/8"，内径：1/4"）
加热元件Won BrothersHT 300 Titanium置于水箱底部的钛棒
成像阵列VerasonicsL11-5v128阵元，灵敏度范围为-55至-49 dB
低熔点琼脂糖Millipore SigmaA9414
模型血管McMaster-Carr5234K98长度6.6 cm，内径0.6 cm，壁厚1 mm
超纯水BarnsteadNanopure DiamondASTM I型，电阻率18 MΩ·cm
血浆Vitalant4PF00024小时内冷冻的血浆
酶标仪BiotekSynergy Neo HST Plate Reader用于血红蛋白定量
探头护套Civco610-362
编程平台MATLAB (the Mathworks, Natick, MA, USA)
重组组织型纤溶酶原激活剂（rt-PA）GenentechActivase
储液器Cole-ParmerEW-07945-43容量60 mL
注射泵Cole-ParmerEW-74900-20连接至注射器，以预设的固定速率抽取流动通道中的流体
换能器自制定制八阵元椭圆聚焦换能器（长轴9 cm，短轴7 cm，焦距6 cm），由自行设计和制造的D类放大器及匹配网络供电
超声扫描系统VerasonicsVantage Research超声系统
水槽Advanced acrylicsC13314 × 14 × 12，1/2"

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