一种用于评估组织碎化术与溶栓药物溶栓功效的体外系统

摘要

目前正在开发用于治疗深静脉血栓形成的组织碎化辅助溶栓递送（即溶栓碎化术）。本文介绍了一种体外实验方法，用于评估该联合疗法的疗效。文中讨论了血栓模型、影像引导以及治疗效果评估的关键实验方案。

摘要

深静脉血栓形成（DVT）是一个全球性的健康问题。针对严重阻塞实现血管再通的主要方法是导管定向溶栓（CDT）。为了减轻CDT相关的腐蚀性副作用及治疗时间过长的问题，目前正在开发辅助性和替代性治疗策略。其中一种方法是组织碎化术（histotripsy），即利用聚焦超声通过气泡云成核来消融组织。临床前研究已表明，组织碎化术与溶栓药物在血栓降解方面具有显著协同作用。本报告概述了一种用于评估组织碎化术辅助溶栓治疗（即溶栓碎化术，lysotripsy）效果的台式实验方法。

将由新鲜人静脉血制备的血凝块引入一个流动通道中，该通道的尺寸和声机械特性模拟髂股静脉。通道以血浆灌注，并加入溶栓用 重组组织型纤溶酶原激活剂。使用专为治疗股静脉血栓设计的聚焦超声源在血凝块内产生气泡云。通过电动定位装置沿血凝块长度方向移动超声焦点。在每个超声辐照位置，被动记录气泡云产生的声发射信号，并进行波束成形以生成被动空化图像。评估治疗效果的指标包括血凝块质量减少（整体治疗效果），以及灌注液中D-二聚体（纤维蛋白溶解）和血红蛋白（溶血）的浓度。该体外实验设计存在一定局限性，例如无法评估体内副作用或血栓溶解过程中血流速度的动态变化。总体而言，该实验系统为评估基于组织碎裂术（histotripsy）的深静脉血栓（DVT）治疗策略的有效性提供了一种有效方法。

引言

血栓形成是指在原本健康的血管内形成血凝块，从而阻碍血液循环^1,2。静脉血栓栓塞症每年在美国造成37.5万至42.5万例病例，医疗费用高达70亿至100亿美元³。肺栓塞是指肺动脉被阻塞，是静脉血栓栓塞症最严重的后果。肺动脉阻塞的主要来源是深静脉血栓，尤其是髂股静脉节段的血栓^4,5,6。深静脉血栓（DVT）除可导致肺部阻塞外，本身也具有一系列继发性病变，长期并发症包括疼痛、肿胀、腿部溃疡和肢体截肢^7,8,9。对于严重阻塞，导管定向溶栓（CDT）是实现血管再通的首选方法¹⁰。CDT的治疗效果受多种因素影响，包括血栓的年龄、位置、大小、成分、病因以及患者的危险分层¹¹。此外，CDT可能伴随血管损伤、感染、出血并发症以及治疗时间较长等问题¹⁰。新一代装置旨在将机械性取....

方案

本研究结果所用静脉人血在获得机构内部审查委员会批准（IRB #19-1300）及志愿者捐献者签署书面知情同意书后采集并用于形成血凝块²⁴本节概述 一种评估溶石碎石疗效的设计方案。该方案基于Bollen等人先前的研究工作。²⁴.

1. 血栓建模

注意：为了确保凝块的稳定性并最大程度地促进收缩，应在实验前2周内且至少3天前制备凝块²⁸。凝块的制备须在获得当地机构审查委员会批准后进行。

1. 准备用于储存血液的硼硅酸盐巴斯德吸管（吸管规格见材料表）。使用硼硅酸盐管是因为该材料具有亲水性，可促进血小板活化和血块收缩²⁹。通过在本生灯上加热密封吸管尖端。
2. 采集新鲜的人体静脉血。将采集的全血按每份2 mL分装至所需数量的血块中。将每份2 mL的血样转移至一根巴斯德吸管中。
   注意：应在采血后约3分钟内完成步骤1.2，以防止血液在转移至吸管前发生凝固。 同时，确保献血志愿者未服用可能影响凝血级联反应的药物（例如抗凝剂或血小板抑制剂）。
3. 将分装好的血液样本（数量等于所需血块数）放入37 °C水浴中孵育3小时。

结果

本研究中概述的实验方案重点介绍了体外深静脉血栓（DVT）模型中静脉血栓建模、组织碎裂术（lysotripsy）用于血栓破坏以及超声成像的详细步骤。所采用的方法展示了评估重组组织型纤溶酶原激活剂（rt-PA）与组织碎裂术气泡云协同作用下血栓破坏效果所需的各个步骤。该台式实验装置设计用于模拟髂股静脉的声学、力学和几何特性。图1A展示了一个具有髂股静脉声学、力学和几何特性的模型血管。将血栓置于模型血管内，以模拟部分阻塞性血栓。通过储液器以0.65 mL/min的流速向血栓灌注血浆和rt-PA，该流速与高度阻塞血管中的缓慢血流速率一致³⁴。

将一个基频为1.5 MHz、长轴9 cm、短轴7 cm、焦距6 cm的椭圆聚焦换能器安装在定位系统上，如图1B所示（换能器结构见图2A）。一个覆盖超声耦合凝胶和乳胶套的成像阵列，如图2B.......

讨论

本方案提出了一种用于量化溶栓碎石术治疗效果的模型。尽管关键细节已作讨论，但要成功实施该方案，仍需考虑若干关键因素。重组组织型纤溶酶原激活剂（rt-PA）的酶活性具有阿伦尼乌斯温度依赖性³⁰。温度也会影响声波在水和组织中的传播速度，温度变化可能导致焦点区域几何形态发生轻微改变。因此，水浴温度应严格控制在 37 ˚C。本方案中使用的 rt-PA 剂量（2.68 µg/mL）与临床上其他药物机械取栓策略所采用的剂量一致⁴²。在步骤 5.8 中，将 30 mL 血浆转移至储液器，而步骤 3.1.3 中记录的等分体积为 35 mL。这部分额外的血浆用于补偿在 37 ˚C 下为平衡大气压而长时间温育过程中因蒸发造成的血浆损失。

治疗换能器的焦距、孔径宽度和频率决定了焦点区域的大小和深度。因此，应根据目标血管的直径和深度选择合适的换能器（例如股静脉：深度为2-4 cm，直径为0.6-1.2 cm）⁴³。机械消融的范围仅限于气泡云所覆盖的区域。因此，理解声.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
吸音板	Precision acoustics	F28-SMALL-M	300 mm × 300 mm × 10 mm
硼硅酸盐巴斯德吸管	Fisher Scientific	1367820A	长度14.6 cm，容量2 mL
离心管	Eppendorf	22364111	容量1.5 mL
德拉布金试剂盒	Sigma Aldrich	D5941-6VL
抽吸注射器	Cole-Parmer	EW-07945-43	容量60 mL
过滤袋	McMaster-Carr	5162K111	可去除粒径达1微米的颗粒
流动通道管路	McMaster-Carr	5154K25	聚乙烯内衬EVA塑料管（外径：3/8"，内径：1/4"）
加热元件	Won Brothers	HT 300 Titanium	置于水箱底部的钛棒
成像阵列	Verasonics	L11-5v	128阵元，灵敏度范围为-55至-49 dB
低熔点琼脂糖	Millipore Sigma	A9414
模型血管	McMaster-Carr	5234K98	长度6.6 cm，内径0.6 cm，壁厚1 mm
超纯水	Barnstead	Nanopure Diamond	ASTM I型，电阻率18 MΩ·cm
血浆	Vitalant	4PF000	24小时内冷冻的血浆
酶标仪	Biotek	Synergy Neo HST Plate Reader	用于血红蛋白定量
探头护套	Civco	610-362
编程平台	MATLAB (the Mathworks, Natick, MA, USA)
重组组织型纤溶酶原激活剂（rt-PA）	Genentech	Activase
储液器	Cole-Parmer	EW-07945-43	容量60 mL
注射泵	Cole-Parmer	EW-74900-20	连接至注射器，以预设的固定速率抽取流动通道中的流体
换能器	自制定制		八阵元椭圆聚焦换能器（长轴9 cm，短轴7 cm，焦距6 cm），由自行设计和制造的D类放大器及匹配网络供电
超声扫描系统	Verasonics		Vantage Research超声系统
水槽	Advanced acrylics	C133	14 × 14 × 12，1/2"