我们描述了使用猪角膜来测试实验性药物抗病毒功效的方法。
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本文内容
摘要
摘要
病毒和细菌可通过角膜感染引起多种眼表缺损和退行性病变，例如伤口和溃疡。单纯疱疹病毒1型（HSV-1）在全球的血清流行率介于60%至90%之间，常引起口面部区域的黏膜皮肤病变，并可表现为病变及与感染相关的失明。尽管目前的抗病毒药物具有一定疗效，但耐药性的出现以及毒副作用的持续存在，促使人们需要开发针对这种普遍病原体的新型抗病毒药物。虽然体外评估可为新型抗病毒药物提供部分功能数据，但其无法体现眼组织在体内的复杂性。然而，体内研究成本高昂，且需要经过培训的专业人员，尤其是在处理病毒因子时。因此，离体模型是进行抗病毒测试的一种高效且经济的中间步骤。本文介绍了一种利用猪角膜离体研究HSV-1感染的实验方案，以及使用现有和新型抗病毒药物进行局部治疗的方法。我们还展示了使用HSV-1进行空斑实验的技术。文中详述的方法可用于开展类似实验，以研究与HSV-1病原体相似的感染过程。
引言
患有眼部感染的人常出现视力丧失1。单纯疱疹病毒（HSV）在全球范围内血清阳性率较高，感染者常反复发生眼部感染，导致角膜瘢痕、基质性角膜炎和新生血管形成2,3,4,5。HSV感染还可能较少见地引起免疫功能低下且未经治疗的患者出现脑炎和全身性并发症等严重病症6,7,8。阿昔洛韦（Acyclovir, ACV）及其核苷类似物在抑制HSV-1感染以及控制其再激活方面已显示出持续疗效，但长期使用这些药物可能与肾功能衰竭、胎儿异常以及无法有效遏制病毒耐药株的出现有关9,10,11,12,13。HSV-1眼部感染的复杂性此前已在体外通过人....
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方案
本研究中使用的所有猪组织均由第三方私营机构提供，中国伊利诺伊大学的人员未参与任何动物操作。
1. 材料
- 试剂
- 使用以下试剂进行噬斑实验：甲基纤维素粉末、杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）、胎牛血清（FBS）、青霉素-链霉素（P/S）。
- 使用结晶紫片剂和乙醇（分子生物学级）配制噬斑实验用结晶紫溶液。
- Vero细胞生长培养基 —— 含血清DMEM完全培养基
- 在组织培养超净台内打开DMEM培养基瓶，用移液管移除55 mL培养基并弃去。向瓶中加入50 mL FBS和5 mL P/S，混匀后于4 °C冰箱中保存。
- 噬斑实验培养基 —— 5%甲基纤维素培养基储备液
- 在500 mL玻璃瓶中加入2.5 g甲基纤维素粉末，并放入搅拌磁子，随后进行高压灭菌。待瓶冷却至室温后，加入500 mL含50 mL FBS和5 mL P/S的DMEM完全培养基。
- 使用磁力搅拌器在4 °C下搅拌2天，然后于4 °C冰箱中保存。
- 离体猪角膜培养基的配制
- 在组织培养超净台内打....
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结果
为了评估实验性抗病毒药物的疗效，在将其推进至体内人体临床试验之前，必须进行广泛的测试。为此，需要设立阳性对照组、阴性对照组和实验组。三氟胸苷（Trifluorothymidine, TFT）长期以来被用作治疗单纯疱疹性角膜炎的首选局部用药16。作为阳性对照，经TFT处理的角膜组显示出较低的病毒感染扩散水平。阴性对照则采用溶解于PBS中的DMSO或溶剂对照。实验性临床前药物BX795作为测试组。每组分配4个角膜，药物每天添加3次。我们利用体视荧光成像的结果显示，BX795在抑制病毒扩散方面的抗病毒效果与TFT相似。在体视显微镜下通过绿色荧光通道成像可直观观察病毒的扩散情况。我们观察到，仅使用溶剂处理的阴性对照组角膜在初次病毒感染后第6天时，病毒已从中央感染区扩散至周边区域；而使用两种药物（BX795和TFT）处理的角膜在第4至第6天的图像中均显示感染已被清除（图9A）。同样，在感染后第2天和第4天采集的眼部拭子结果显示，阳性对照组和BX795处理样本中的病毒被完全抑制，而阴性对照组中则观察到感染性病毒滴度显著升高（
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讨论
既往研究表明，BX795 作为一种抗病毒药物在对抗 HSV-1 感染方面具有良好的前景，其作用机制为抑制 TANK 结合激酶 1（TBK1）16。TBK1 和自噬均在抑制 HSV-1 感染过程中发挥作用，这一点已在人角膜上皮细胞中得到证实。研究显示，BX795 在浓度为 10µM 时抗病毒活性达到最大，并通过关键病毒蛋白的 Western 印迹分析和病毒蚀斑分析表明，其抑制 HSV-1 感染的效果与 TFT 相当16。在猪角膜上的研究采用了相同的分析方法，并获得了与上述相似的结果：BX795 抑制感染的效果与 TFT 相当——在感染第 4 天和第 6 天拍摄的猪角膜图像显示，TFT 和 BX795 两组结果相近。用于定量分泌病毒颗粒的蚀斑实验也进一步支持了这些发现16。此外，BX795 在体外已显示出抗病毒作用，而在小鼠模型中局部应用 BX795 的体内实验也证实其可抑制角膜 HSV-1 感染16。
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披露
作者声明无利益冲突，且无竞争性经济利益。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助（项目编号：R01 EY024710、RO1 AI139768 和 RO1 EY029426），资助对象为 D.S.。A.A. 获得了美国国立眼科研究所（National Eye Institute）NIH F30EY025981 项目的资助。本研究使用了来自芝加哥新城区阿什兰大道 4107 号 Park Packing 公司提供的猪角膜。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 30 G皮下注射针头 | BD | 305128 | |
| 500 mL 玻璃瓶 | 托马斯科学公司 | 844027 | |
| 抗真菌剂与抗生素（AA） | GIBCO | 15240096 | 分装至5 mL离心管中，冷冻保存备用 |
| 台式涡旋混合器 | BioDot | BDVM-3200 | |
| 具有生物安全二级（BSL-2）认证的生物安全柜 | 赛默飞世尔科技 | Herasafe 2030i | |
| Calgiswab 6" 无菌海藻酸钙标准拭子 | 普尔itan | 22029501 | |
| 细胞刮刀 - 25 cm | Biologix BE | 70-1180 70-1250 | |
| 结晶紫 | Sigma Aldrich | C6158 | 将粉末存放在避光处 |
| 杜尔贝科’s 改良的 Eagle’s 培养基 - DMEM | GIBCO | 41966029 | 4°C 保存 °直至使用前均保存于 C |
| 乙醇 | Sigma Aldrich | E7023 | |
| 胎牛血清 -FBS | Sigma Aldrich | F2442 | 分装至50 mL离心管中，冻存备用 |
| 平口镊子 – 2. | Harward Instruments | 72-8595 | |
| -80 冰箱 °C. - | 赛默飞世尔科技 | 13 100 790 | |
| 全新的刀片盒 | 托马斯科学公司 | TE05091 | |
| 瓜子 | Johnson &安普与约翰逊 | 108平方英寸文件夹，12层 | |
| HSV-1 17GFP | 自培 | - | 原始毒株由美国西北大学 Patricia Spears 博士提供。表达 GFP 的 HSV-1 毒株 17 |
| 胰岛素、转铁蛋白、硒 - ITS | GIBCO | 41400045 | 分装至5 mL离心管中，冻存备用 |
| 磁力搅拌器。 | Thomas Scientific | H3710-HS | |
| 金属剪刀 | Harward Instruments | 72-8400 | |
| 1 至 1000 微量移液器 µL. | Thomas Scientific | 1159M37 | |
| 最低必需培养基 - MEM | GIBCO | 11095080 | 4°C 下保存 °C，直至使用 |
| OptiMEM | GIBCO | 31985047 | 4°C 下保存 °C 保存至使用 |
| 青霉素/链霉素 | GIBCO | 15140148 | 分装至5 mL离心管中，冻存备用 |
| 磷酸盐缓冲液 - PBS | GIBCO | 10010072 | 室温保存 |
| 猪角膜 | Park Packaging Co.，芝加哥，IL | 根据要求特别订购 | |
| 实验台防护罩——根据需要使用。 | 赛默飞世尔科技 | S42400 | |
| 血清移液管 | 托马斯科学公司 | P7132, P7127, P7128, P7129, P7137 | |
| 血清移液设备 | 托马斯科学公司 | Ezpette Pro | |
| 体视显微镜 | 卡尔·蔡司 | SteREO Discovery V20 | |
| 搅拌磁子 | 托马斯科学公司 | F37120 | |
| 组织培养瓶，T175 cm²。 | 托马斯科学公司 | T1275 | |
| 可维持5% CO₂和37℃的组织培养孵育箱 °C 温度。 | 赛默飞世尔科技 | Forma 50145523 | |
| 组织培养处理板（6孔） | Thomas Scientific | T1006 | |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.05%），酚红 | GIBCO | 25-300-062 | 分装至10 mL离心管中，冻存备用 |
| Vero 细胞 | 美国典型培养物保藏中心 ATCC | CRL-1586 |
参考文献
- Liesegang, T. J. Herpes simplex virus epidemiology and ocular importance. Cornea. 20 (1), 1-13 (2001).
- Farooq, A. V., Valyi-Nagy, T., Shukla, D. Mediators and mechanisms of herpes simplex virus entry into ocular cells. Current Eye Research. 35 (6), 445-450 (....
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重印与许可
