利用猪角膜组织外植体研究单纯疱疹病毒-1抗病毒药物的疗效

摘要

我们描述了使用猪角膜来测试实验性药物抗病毒功效的方法。

摘要

病毒和细菌可通过角膜感染引起多种眼表缺损和退行性病变，例如伤口和溃疡。单纯疱疹病毒1型（HSV-1）在全球的血清流行率介于60%至90%之间，常引起口面部区域的黏膜皮肤病变，并可表现为病变及与感染相关的失明。尽管目前的抗病毒药物具有一定疗效，但耐药性的出现以及毒副作用的持续存在，促使人们需要开发针对这种普遍病原体的新型抗病毒药物。虽然体外评估可为新型抗病毒药物提供部分功能数据，但其无法体现眼组织在体内的复杂性。然而，体内研究成本高昂，且需要经过培训的专业人员，尤其是在处理病毒因子时。因此，离体模型是进行抗病毒测试的一种高效且经济的中间步骤。本文介绍了一种利用猪角膜离体研究HSV-1感染的实验方案，以及使用现有和新型抗病毒药物进行局部治疗的方法。我们还展示了使用HSV-1进行空斑实验的技术。文中详述的方法可用于开展类似实验，以研究与HSV-1病原体相似的感染过程。

引言

患有眼部感染的人常出现视力丧失¹。单纯疱疹病毒（HSV）在全球范围内血清阳性率较高，感染者常反复发生眼部感染，导致角膜瘢痕、基质性角膜炎和新生血管形成^2,3,4,5。HSV感染还可能较少见地引起免疫功能低下且未经治疗的患者出现脑炎和全身性并发症等严重病症^6,7,8。阿昔洛韦（Acyclovir, ACV）及其核苷类似物在抑制HSV-1感染以及控制其再激活方面已显示出持续疗效，但长期使用这些药物可能与肾功能衰竭、胎儿异常以及无法有效遏制病毒耐药株的出现有关^{9,10,11,12,13}。HSV-1眼部感染的复杂性此前已在体外通过人角膜细胞的单层和三维培养模型，以及在体内通过小鼠或兔的眼部感染模型进行研究。尽管这些体外模型为HSV-1感染的细胞生物学机制提供了重要数据，但它们无法模拟角膜组织的复杂结构，对病毒树突状扩散过程的揭示也十分有限¹⁴。相比之下，体内模型虽然能更深入地展示HSV-1感染在角膜中的传播过程及免疫激活反应，但其局限性在于需要经过培训的研究人员以及大规模的动物饲养设施来支持实验的开展。

本研究采用猪角膜作为离体模型，用于研究单纯疱疹病毒1型（HSV-1）感染所诱导的损伤体系。通过组织外植体培养，可同时探讨特定药物的潜在药理作用以及感染所致损伤体系的细胞与分子生物学机制。该模型亦可经适当修改后用于其他病毒或细菌感染的研究。在本项研究中，我们利用猪角膜评估了一种临床前小分子化合物BX795的抗病毒效果。选择猪角膜的原因在于其易于获取且成本较低。此外，猪角膜模型是人眼的良好替代模型，其角膜易于分离，尺寸适中，便于感染操作与观察，且结构坚固、易于操作¹⁵。在跨角膜渗透性和系统吸收方面，猪角膜模型的复杂性也与人角膜模型具有可比性¹⁵。通过应用该模型开展研究，我们阐明了BX795作为HSV-1病毒感染有效抑制剂的潜力，进一步支持将其归类为潜在的小分子抗病毒化合物，丰富了相关文献资料¹⁶。

方案

本研究中使用的所有猪组织均由第三方私营机构提供，中国伊利诺伊大学的人员未参与任何动物操作。

1. 材料

1. 试剂
   1. 使用以下试剂进行噬斑实验：甲基纤维素粉末、杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）、胎牛血清（FBS）、青霉素-链霉素（P/S）。
   2. 使用结晶紫片剂和乙醇（分子生物学级）配制噬斑实验用结晶紫溶液。
2. Vero细胞生长培养基 —— 含血清DMEM完全培养基
   1. 在组织培养超净台内打开DMEM培养基瓶，用移液管移除55 mL培养基并弃去。向瓶中加入50 mL FBS和5 mL P/S，混匀后于4 °C冰箱中保存。
3. 噬斑实验培养基 —— 5%甲基纤维素培养基储备液
   1. 在500 mL玻璃瓶中加入2.5 g甲基纤维素粉末，并放入搅拌磁子，随后进行高压灭菌。待瓶冷却至室温后，加入500 mL含50 mL FBS和5 mL P/S的DMEM完全培养基。
   2. 使用磁力搅拌器在4 °C下搅拌2天，然后于4 °C冰箱中保存。
4. 离体猪角膜培养基的配制
   1. 在组织培养超净台内打开最低必需培养基（MEM）瓶，用移液管弃去10 mL MEM。
   2. 向培养基中加入5 mL胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS）和5 mL抗真菌-抗生素混合液（AA），混匀后于4°C冰箱中保存。
5. 结晶紫母液与工作液的配制：
   1. 配制结晶紫母液：将1 g结晶紫粉末溶于100 mL 20%水-乙醇溶液中。该母液（1% w/v 结晶紫）可在避光条件下保存，最长可使用一年。
   2. 配制工作液：取50 mL上述母液加入350 mL水中，再加入100 mL乙醇，定容至500 mL，得到0.1% w/v的结晶紫工作液。
      ​注意：上述两种溶液均需避光保存。

2. 实验步骤

1. 从完整眼球中分离猪角膜¹⁷
   1. 从合适的供应商处收到猪眼球后，若组织处理存在延迟，请将其置于冰上保存，如图1所示。
   2. 确保在操作过程中穿戴个人防护装备，以避免污染以及玻璃体液溢出导致的意外事故。
   3. 用70%乙醇喷洒工作区域以进行清洁和消毒。为确保工作台面稳定，请铺上实验台保护膜，并将边缘牢固地用胶带固定，如图2所示。
   4. 将猪眼球放置于纱布上（图3）。使用50 mm纱布，用一只手握住猪眼球的后部（图4A），如图4B所示。
   5. 使用30 G针头，在眼球上皮表面中心附近轻轻刺入一次，注意避免对基质层造成损伤（图5）。穿刺应仅限于上皮层（约100–200 µm），以避免累及基质层。
   6. 使用锋利的灭菌刀片，在距离角膜1 mm处的巩膜上做一小切口。用手快速而平稳地旋转切割，切开角膜边缘，确保玻璃体液不泄漏（图6A）。用平头镊子夹住角膜-巩膜交界处，用刀片切断其余连接的眼部膜结构（图6B）。
   7. 取下角膜并将其放入含2 mL角膜培养基的12孔板中。角膜应朝上放置，具体步骤如图7A-D及图8所示。
   8. 在角膜表面清创部位加入5 µL病毒溶液，其中含有5 × 10⁵斑块形成单位（PFU）的17 GFP。将含有感染猪角膜的12孔板置于含5% CO₂的培养箱中孵育72小时。
   9. 对实验中未使用的额外眼球喷洒10%次氯酸钠溶液，并安全地丢弃至生物危害袋中。
2. 观察
   注意：在添加药物前，应每天观察病毒情况。
   1. 打开体视显微镜和LED光源，待灯泡预热后再对角膜进行成像。小心地将角膜板移至仪器上，避免扰动液体。更换滤光片，使用GFP（380–460 nm）通道观察样本。设定曝光时间为500 ms以采集图像。
   2. 首先将角膜板置于体视显微镜下，以最低放大倍数（7.5×）拍摄图像。随后依次提高放大倍数（例如15×、25×、35×），确保清晰观察到病毒扩散和树突状结构的形成。
   3. 务必在拍摄后将感染的角膜放回组织培养箱中，并保存所有采集的图像。
3. 病毒感染定量
   注意：应每天评估猪角膜中的病毒滴度，以分析药物处理的效果。
   1. 为进行病毒定量，若使用6孔板，则在感染前一天以每孔5 × 10⁵个细胞的密度接种Vero细胞（如本实验所示）。将接种后的细胞过夜培养，确保其达到汇合状态以用于病毒定量。
   2. 将500 µL无血清培养基分装至多个微量离心管中。将无菌棉签浸入装有无血清培养基的管中，棉签需在使用前至少浸泡湿润5分钟。
   3. 在不扰动底层培养基的前提下，将感染的猪角膜板转移至生物安全柜中。使用湿润的棉签，在感染猪角膜中心直径5 mm范围内顺时针旋转3圈，再逆时针旋转3圈，避免施加过大压力。
   4. 将棉签重新插入装有无血清培养基的微量离心管中，顺时针和逆时针各旋转5次。应将棉签的金属杆剪短，使其完全能放入微量离心管中，并可盖紧管盖。
   5. 将含有棉签头的微量离心管置于涡旋振荡器上，高速振荡1分钟。
   6. 通过斑块分析法对这些样本进行病毒定量。
      注意：该定量步骤应在感染后第2、4天进行，第6天可选。
4. 通过斑块分析法进行病毒定量
   注意：进行斑块分析时，需将Vero细胞培养并接种于6孔板中，确保在开始实验前细胞汇合度达到90%。可使用一个汇合的75 cm²培养瓶中的细胞。以下所有步骤均需在生物安全柜内进行。
   1. 吸除培养基后，用10 mL新鲜磷酸盐缓冲液（PBS）清洗培养瓶中的汇合单层Vero细胞。吸除第一遍清洗液后，再用PBS重复清洗一次。
   2. 向细胞单层加入1 mL 0.05%胰蛋白酶溶液。将培养瓶在37 °C孵育5分钟。肉眼观察确认细胞是否已从瓶内表面脱落。若未完全脱落，再等待5分钟后重新检查。当细胞明显脱落时，向单层细胞中加入9 mL全培养基，确保细胞完全从瓶壁脱离。
   3. 将培养瓶中的所有细胞连同全培养基收集至15 mL离心管中。
   4. 对于用于斑块分析的每个6孔板孔，取离心管中的300 µL细胞悬液。每个孔补充2 mL全培养基。将板放入培养箱中过夜，使细胞生长并形成汇合单层。
   5. 为进行斑块分析，在病毒定量前需对样本进行系列稀释。
   6. 使用无血清培养基在微量离心管中对病毒进行log₁₀倍比稀释，直至达到10^-8稀释度。当稀释至10^-3时，吸除6孔板中细胞的生长培养基后，向细胞单层加入1 mL该稀释液，此为感染步骤。将感染后的板在37 °C培养箱中孵育2小时。
   7. 吸除现有感染液，用PBS轻轻洗涤两次以覆盖细胞，然后向所有6个孔中每孔加入2 mL含甲基纤维素的培养基。孵育72小时，或直至可见斑块形成。斑块可通过细胞单层中出现的小间隙来识别。
   8. 沿每孔边缘缓慢加入1 mL甲醇，利用孔壁作为导流。将6孔板在室温下孵育15分钟。小心吸除各孔内容物，避免扰动或震荡细胞单层。
   9. 向6孔板的每孔加入1 mL结晶紫工作液，确保覆盖所有细胞。将6孔板置于避光条件下孵育30分钟。通过吸除方式弃去结晶紫溶液，并将孔在吸水纸上干燥。
   10. 计数最高稀释度孔中的斑块数量，以量化起始溶液中的总病毒含量。重复该过程两次以确认病毒滴度。

结果

为了评估实验性抗病毒药物的疗效，在将其推进至体内人体临床试验之前，必须进行广泛的测试。为此，需要设立阳性对照组、阴性对照组和实验组。三氟胸苷（Trifluorothymidine, TFT）长期以来被用作治疗单纯疱疹性角膜炎的首选局部用药¹⁶。作为阳性对照，经TFT处理的角膜组显示出较低的病毒感染扩散水平。阴性对照则采用溶解于PBS中的DMSO或溶剂对照。实验性临床前药物BX795作为测试组。每组分配4个角膜，药物每天添加3次。我们利用体视荧光成像的结果显示，BX795在抑制病毒扩散方面的抗病毒效果与TFT相似。在体视显微镜下通过绿色荧光通道成像可直观观察病毒的扩散情况。我们观察到，仅使用溶剂处理的阴性对照组角膜在初次病毒感染后第6天时，病毒已从中央感染区扩散至周边区域；而使用两种药物（BX795和TFT）处理的角膜在第4至第6天的图像中均显示感染已被清除（图9A）。同样，在感染后第2天和第4天采集的眼部拭子结果显示，阳性对照组和BX795处理样本中的病毒被完全抑制，而阴性对照组中则观察到感染性病毒滴度显著升高（

讨论

既往研究表明，BX795 作为一种抗病毒药物在对抗 HSV-1 感染方面具有良好的前景，其作用机制为抑制 TANK 结合激酶 1（TBK1）¹⁶。TBK1 和自噬均在抑制 HSV-1 感染过程中发挥作用，这一点已在人角膜上皮细胞中得到证实。研究显示，BX795 在浓度为 10µM 时抗病毒活性达到最大，并通过关键病毒蛋白的 Western 印迹分析和病毒蚀斑分析表明，其抑制 HSV-1 感染的效果与 TFT 相当¹⁶。在猪角膜上的研究采用了相同的分析方法，并获得了与上述相似的结果：BX795 抑制感染的效果与 TFT 相当——在感染第 4 天和第 6 天拍摄的猪角膜图像显示，TFT 和 BX795 两组结果相近。用于定量分泌病毒颗粒的蚀斑实验也进一步支持了这些发现¹⁶。此外，BX795 在体外已显示出抗病毒作用，而在小鼠模型中局部应用 BX795 的体内实验也证实其可抑制角膜 HSV-1 感染¹⁶。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
30 G皮下注射针头	BD	305128
500 mL 玻璃瓶	托马斯科学公司	844027
抗真菌剂与抗生素（AA）	GIBCO	15240096	分装至5 mL离心管中，冷冻保存备用
台式涡旋混合器	BioDot	BDVM-3200
具有生物安全二级（BSL-2）认证的生物安全柜	赛默飞世尔科技	Herasafe 2030i
Calgiswab 6" 无菌海藻酸钙标准拭子	普尔itan	22029501
细胞刮刀 - 25 cm	Biologix BE	70-1180 70-1250
结晶紫	Sigma Aldrich	C6158	将粉末存放在避光处
杜尔贝科’s 改良的 Eagle’s 培养基 - DMEM	GIBCO	41966029	4°C 保存 °直至使用前均保存于 C
乙醇	Sigma Aldrich	E7023
胎牛血清 -FBS	Sigma Aldrich	F2442	分装至50 mL离心管中，冻存备用
平口镊子 – 2.	Harward Instruments	72-8595
-80 冰箱 °C. -	赛默飞世尔科技	13 100 790
全新的刀片盒	托马斯科学公司	TE05091
瓜子	Johnson &安普与约翰逊		108平方英寸文件夹，12层
HSV-1 17GFP	自培	-	原始毒株由美国西北大学 Patricia Spears 博士提供。表达 GFP 的 HSV-1 毒株 17
胰岛素、转铁蛋白、硒 - ITS	GIBCO	41400045	分装至5 mL离心管中，冻存备用
磁力搅拌器。	Thomas Scientific	H3710-HS
金属剪刀	Harward Instruments	72-8400
1 至 1000 微量移液器 µL.	Thomas Scientific	1159M37
最低必需培养基 - MEM	GIBCO	11095080	4°C 下保存 °C，直至使用
OptiMEM	GIBCO	31985047	4°C 下保存 °C 保存至使用
青霉素/链霉素	GIBCO	15140148	分装至5 mL离心管中，冻存备用
磷酸盐缓冲液 - PBS	GIBCO	10010072	室温保存
猪角膜	Park Packaging Co.，芝加哥，IL		根据要求特别订购
实验台防护罩——根据需要使用。	赛默飞世尔科技	S42400
血清移液管	托马斯科学公司	P7132, P7127, P7128, P7129, P7137
血清移液设备	托马斯科学公司	Ezpette Pro
体视显微镜	卡尔·蔡司	SteREO Discovery V20
搅拌磁子	托马斯科学公司	F37120
组织培养瓶，T175 cm²。	托马斯科学公司	T1275
可维持5% CO₂和37℃的组织培养孵育箱 °C 温度。	赛默飞世尔科技	Forma 50145523
组织培养处理板（6孔）	Thomas Scientific	T1006
胰蛋白酶-EDTA（0.05%），酚红	GIBCO	25-300-062	分装至10 mL离心管中，冻存备用
Vero 细胞	美国典型培养物保藏中心 ATCC	CRL-1586