胶质母细胞瘤干细胞在模式神经元上共同培养，以研究迁移和细胞相互作用

原发性恶性胶质瘤，包括GBM，是毁灭性的肿瘤，GBM患者的中等存活率为12至15个月。目前的治疗依赖于大肿瘤大规模切除和化疗加上放射治疗，这只会延长几个月的存活率。治疗失败与跨血脑屏障（BBB）的不良药物输送以及血管间空间、脑膜和WMT¹沿线的侵入性生长密切相关。血管入侵，也称为血管共同选择，是一个经过充分研究的过程，分子机制开始被阐明:然而，沿WMT的GBM细胞入侵过程并不被很好地理解。肿瘤细胞沿着舍勒的次生结构²迁移到健康的大脑中。事实上，近一个世纪前，汉斯-约阿希姆·舍勒描述了GBM的侵入性路线，现在被称为腹膜饱腹症、腹膜饱腹症、亚皮亚传播和沿WMT（图1A）的入侵。

一些化疗因子及其受体，如频闪细胞衍生因子-1+（SDF1+）和C-X-C图案化学素受体4（CXCR4），但不是血管内皮生长因子（VEGF），似乎与WMT入侵³有关。最近，一个跨细胞的T1-SOX2轴已被证明是WMT入侵GBM细胞⁴的重要途径。作者描述了GBM干细胞如何侵入部分未髓化神经元的脑帕奇玛，这表明GBM细胞对骨髓护套的破坏。2019年，《自然》杂志发表了三篇文章，强调了电活动在胶质^{瘤发育中的作用。}Monje 和合作者的开创性工作揭示了电活动在神经质-3分泌中的核心作用，这种分泌物促进胶质瘤的发展。

Winkler和合作者描述了GBM细胞（微管）之间的连接在侵入性步骤中至关重要，最近，GBM细胞和神经元之间通过新描述的神经胶质瘤突触相互作用。这些结构有利于对位于GBM细胞膜的α氨基-3-羟基-5-甲基-4-异氧丙烯酸（AMPA）受体进行谷氨酸刺激，从而促进肿瘤的发展和入侵。肿瘤细胞入侵是转移或远继发的传播过程中的一个中心过程，如GBM患者所观察到的。已确定在GBM入侵中很重要的几个因素，如血栓蓬丁-1，一种转化生长因子β（TGF+调节的基质细胞蛋白，或化学素受体CXCR3）7，8。

在这里，一个简化的生物仿生模型被描述为研究GBM入侵，其中神经元在层压素的轨道上成型，GBM细胞作为单细胞或球体（图1B）播种到它上面。这两个实验设置旨在回顾神经元的入侵，这是在^{GBM9，10，11}观察到的。这种模型过去曾被开发成对齐的纳米纤维生物材料（核心壳电平），允许通过调节机械或化学特性¹²来研究细胞迁移。本文中描述的共同培养模型通过定义这个过程中涉及的新分子通路，可以更好地了解 GBM 细胞如何逃逸到神经元上。

知情的书面同意是从所有患者（根据当地道德委员会的规定，从挪威卑尔根的豪克兰医院）获得的。该协议遵循波尔多大学人类和动物研究伦理委员会的指导方针。怀孕的老鼠被安置和治疗在波尔多大学的动物设施。使用_二氧化碳对E18次怀孕大鼠进行安乐死。所有动物程序均按照机构准则完成，并经当地道德委员会批准。所有商业产品均参照 材料表。

1. 准备图案幻灯片

1. 微模式的基板准备
   1. 通过空气/等离子激活处理 18 毫米圆形玻璃盖片 5 分钟。将盖片放在一个封闭的腔室中，用100微升（3-氨基）三氧西兰放在干燥器中1小时。
   2. 在 10 mM 碳酸盐缓冲器中孵化 100 毫克/mL 聚（乙二醇）-简洁的谷氨酸酯（分子重量 5，000 （Peg-SVA）），pH > 8，为 1 小时。用超纯水广泛冲洗，并在化学罩下干燥。
      注:在此阶段，样品可存储在黑暗中的 4 °C 以供进一步使用。
   3. 加入光启动器，4-苯二苯甲酰-氯化铵（PLPP），在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中为14.7毫克/mL。
      注:也可以使用PLPP的浓缩形式，即PLPP凝胶。它导致降低PEG刷（100mJ/mm^2）所需的较短的紫外线（UV）照明时间。
2. 光启动器凝胶沉积
   1. 准备3μL的PLPP凝胶和50μL的绝对乙醇的混合物沉积在幻灯片的中心。将样品放在化学罩下，直到绝对乙醇完全蒸发。
      注:在此阶段，样品可存储在黑暗中的 4 °C 以供进一步使用。
3. 玻璃滑动微模式
   1. 将盖子滑装在 Ludin 室中，并将其放置在配备自动对焦系统的显微镜的电动阶段。
   2. 将与设想的微模式相对应的图像加载到软件中。应用这些参数:复制4×4次，间距200微米，紫外线剂量1000mJ/mm²。在自动紫外线照明序列之后，用多个 PBS 洗涤冲洗 PLPP。
      注意:如果使用PLPP凝胶，用除离子水进行广泛洗涤，在N₂流中干燥，并储存在4°C。
   3. 用层压素（PBS中为50微克/mL）孵化30分钟。使用PBS广泛清洗。
      注:纯绿色荧光蛋白（PBS中的GFP，10μg/mL）的荧光溶液可与层胺混合，通过荧光显微镜可视化显微模式。

2. 为共同培养准备神经元和GBM细胞

1. 胚胎大鼠海马神经元的培养
   1. 解剖胚胎（E18）大鼠的海马体，并将组织转移到汉克的平衡盐溶液（HBSS）/1 mM 4-（2-羟基）-1-管道氨基硫酸（HEPES）/青霉素-链霉素溶液中，在15mL管中。在不干燥海马体的情况下去除多余的溶液。
   2. 加入5mL的三聚氰胺四乙酸（EDTA），辅以青霉素（10，000单位/mL）/链霉素（10，000微克/mL）和1毫米 HEPES，在37°C孵育15分钟。 用 HBSS/HEPES/青霉素-链霉素溶液清洗 2 次，让组织在此溶液中保留 2-3 分钟。
   3. 使用两个火焰抛光的巴斯德移液器分离组织，通过每个组织上下管道 10 倍，注意尽量减少发泡。计算细胞，并评估细胞悬架的可行性。将神经元放在显微模式盖片上，如下所示。
      注:提取后细胞存活率为85-90%。
2. 微模式盖片上神经元的细胞培养
   1. 用PBS补充微模式玻璃滑梯，并孵育完整的神经元细胞培养介质。
   2. 将从 E18 Sprague-Dawley 大鼠获得的海马神经元直接播种到微模式玻璃盖上，密度为每厘米 50，000 个细胞^，神经巴沙介质 （NBM） 中含有 3% 马血清。将微模式神经元放置在孵化器中（37 °C，5% CO2）48小时。
      注:约6小时后，可以看到主要海马神经元粘附在层压素微模式下。
3. 神经元上人类GBM干细胞的共培养
   注:在这项研究中，膜GFP阳性和核番茄患者衍生的GBM细胞是按照先前公布的协议¹⁰生长的。
   1. 当球状细胞在悬浮中生长时，离心机悬浮5分钟，为200× 克。用 5 mL 的 PBS 清洗球体，用 0.5 mL 的细胞分离试剂（见 材料表）孵育细胞，在 37 °C 处 5 分钟。
   2. 添加 4.5 mL 的完整 NBM（辅以 B27 补充剂、肝素、成纤维细胞生长因子 2、青霉素和链霉素，如前^{所述 8），}并使用自动计数技术计算细胞。
   3. 在 NBM 的微模式神经元培养物上播种 1，000 个 GBM 细胞，富含 3% 马血清。在 37 °C、5% CO₂和 95% 湿度下孵化板。

3. 活细胞成像

1. GBM细胞播种后，立即将样品放在装有恒温器室的倒显微镜的舞台上。使用软件中的多维采集工具箱，在配备电动舞台的显微镜上执行活细胞成像，用于记录多个位置。在 12 小时内每 5 分钟获取一次明亮场和表外荧光 GFP/番茄图像，在温度 （37 °C） 和气体控制 （5% CO 2） 环境中达到₂₀倍的目标。

4. 图像分析

注:使用斐济，使用自制和用户友好的工具（可在此地址:https://github.com/Guyon-J/Coculture_Gliomas-Neurons/blob/main/README.md）半自动预处理或处理二维 （2D） 图像堆栈，该工具栈以 IJ1 宏语言（图 2A）编写。自动化工作流程和程序在 图 2B中进行总结。

1. 神经元网络分析 （图2毕）
   1. 选择堆栈的一个图像。右键单击 网络 工具以打开相应的 选项 对话框并调整设置（例如 阈值 = 三角形、Li、黄。。。、 高斯模糊和 中位数 滤镜 = 1、2、3.。。）以生成图像的精确细分。然后，单击 "确定"。
   2. 左键单击 "网络 "工具以自动激活以下程序。
      1. 复制选定的图像，并将其 分成 三个颜色通道（红灰色-绿色）。
      2. 选择灰色通道（亮场），并执行 对比拉伸增强 （CSE），以增强不同区域之间的分离。使用 Sobel 边缘探测器 （SED） 执行已分组在 Find Edge 命令下的 2D 信号处理卷积操作。
      3. 对于 双滤 （F），应用高斯模糊和中位数滤光片以减少噪音并平滑对象信号。通过执行经过调整的阈值算法 转换为面膜 （CM），以获取带有黑色像素（细胞区域）和白色像素（背景）的二进制图片（BIN-灰色）。将 （Sk） 单元格区域 骨架化 为一个简单的网络 （NET），并通过去除小型非网络 粒子来过滤 NET 图像中的粒子 （EP）。
      4. 对于红色和绿色通道（原子核和膜），执行 双滤，使用调整后的阈值方法 转换为面膜 ，并允许 BIN-Green 通过 分析粒子命令确定细胞形态。
      5. 使用其感兴趣的区域 （ROI） 将所有通道与 OR（ 组合）操作员合并，并将其初始颜色重新调整为简单的 RGB 图像。
2. 单细胞运动分析 （图2比 ）
   1. 右键单 细胞跟踪 工具打开相应的 选项 对话框，并调整设置（例如， 跟踪类型 = 核或膜、 阈值 = 三角形、Li、黄...、Z 投影 = 最大强度、总和切片、 高斯模糊 和 中位数 滤镜 = 1、2、3.。。），以生成图像的精确细分。然后，单击 "确定"。
   2. 左键单 细胞跟踪 工具，自动激活以下程序。
      1. 删除灰色通道。在堆栈上应用Z 投影，这将根据时间（T 栈）生成与图像堆栈相对应的图像。双滤并转换为遮蔽细胞留下的痕迹。将小颗粒移到 BIN-红色/绿色图像中。
      2. 通过使用 ROI，选择单元格跟踪的每个轮廓，并检查选项对话框中的框跳过边缘检测，以跳过此预处理步骤以了解后续步骤。
      3. 隔离 原始堆栈上的红色通道（跟踪类型 = 核）。选择一个投资回报率，并删除外部区域。 双滤所有 图像并 转换为面膜 （BIN-红色）。确定每个双核核的中心X/Y位置。
   3. 使用已经发布的宏电子表格软件^13，计算该单元的平均方位、方向比和平均速度。
3. 多细胞跟踪分析 （图2Biii）
   1. 右键单击 "跟踪 "工具以打开相应的 "选项 "对话框并调整设置（例如 阈值 = 三角形、Li、黄...、 高斯模糊 和 中位数 滤镜 = 1、2、3.。。）以生成图像的精确细分。然后，单击 "确定"。
   2. 左键单击 "跟踪 "工具以自动激活以下程序。
      1. 删除灰色通道。
      2. 拆分 红色和绿色通道， 双滤，并 转换为面膜。
      3. 使用 图像计算器合并通道...命令与 和 操作员，只留下在膜中找到的核信号。
         注:斐济的几个插件可用于同时确定此二进制预处理图像中几个单元的 X/Y 位置（参见 材料表）。
   3. 使用先前描述的宏¹³计算这些单元的轨迹图、平均方位、方向比和平均速度。
4. 神经垫上的球状迁移 （图2比夫）
   1. 右键单击 "迁移 "工具以打开相应的 "选项 "对话框并调整设置（例如 阈值 = 三角形、Li、黄...、 高斯模糊 和 中位数 滤镜 = 1、2、3.。。）以生成图像的精确细分。然后，单击 "确定"。
   2. 左键单击 "迁移 "工具以自动激活以下程序。
      1. 删除红色通道。
      2. 拆分 绿色和灰色通道。
      3. 对于灰色通道，手动 绘制 神经元垫的轮廓，并测量其区域。
      4. 对于绿色通道， 双滤 除堆栈并 转换为面膜。移除图案 （BIN） 以外的区域，并确定每个图像的二元化库区域。
         注意:通过左键单击兴趣图标来更改其值，对上述参数进行校准。此处理可以手动完成。但是，对于大量图像（每次采集大约一百张）、通道（一般为 3 个通道）和处理步骤，最好使用自动或半自动工具。

与荧光GBM细胞共同培养的模式神经元按照协议部分的描述进行了培养，并进行了跟踪实验。GBM细胞在神经元上迁移时迅速改变其形状（图1B:面板6 和 视频1）。细胞沿着神经元扩展迁移，以随机运动（视频1）。荧光GBM细胞和非荧光神经元可以很容易地区分，这允许使用斐济宏跟踪细胞运动，如协议部分（图2）所述。斐济是一个开放的许可证软件，方便图像处理和分析。分析大量图像相对耗时的人工程序可以在宏中自动进行。图像通过拖放程序导入、处理和量化，生成使用投资回报率管理器提供的数据。

当存入Fiji.app |宏|工具集文件夹时，Gliomas-神经元工具可在更多工具菜单中找到，并显示多个图标（图 2A）。图像处理的工作流程，通过点击图标获得，在图2B（i-iv）中说明。细胞形状可以在神经网络上分析（图2B，i）。通过使用两个不同的图像过程，可以从细胞跟踪中获取多个参数（图 2B、ii）或多个单元格（图 2B，iii）。也可以分析神经元上球状GBM细胞的恢复速度（图2B，iv）。播种到神经元的细胞在神经元区域（图3A，i）后呈现出多发性突起的拉长形状，但当直接在层压素上培养时，具有圆形（图3A，ii）。在神经元上培养的细胞有效地改变了它们的形状，尽管它们在层压素（图3A，iii-v）上培养时没有拉长。在后期与神经元共同培养的细胞中，可以看到薄突起，有时连接两个细胞（视频1）。

将神经元上播种的GBM细胞的迁移能力与直接在层蛋白上播种的细胞进行比较。神经元上播种的细胞比单靠层蛋白具有更大的迁移能力（图3B，i，ii）。在这两种条件下都检测到P3细胞的随机运动，神经元上的P3细胞距离更大，如轨迹图（图3B，i，ii）所示。细胞运动性按平均方位移 （MSD） 进行定量估计，其日志表示具有线性函数14（图 3B，iii）。方向和平均速度也计算这两个条件（图3B，iv，v）。P3球体的细胞迁移也随之而来，检测神经元上的荧光区，并与单单层蛋白的迁移（图3C，i，ii和视频2）进行比较。神经元的模式有一半在500分钟后被GBM细胞覆盖在线性轮廓中;然而，球体不坚持层压素模式（图3D，iii和视频2）。

图1:在模式化神经元上迁移的胶质母细胞的实验设置。（A） 胶质母细胞通过语料库卡洛苏姆侵入反向半球的表示。（B） 实验设置。在第 1 步中，板面涂有防污 PEG 层。照片启动器在第 2 步中添加，覆盖整个涂层。在第 3 步中，通过显微镜的目标投射紫外线宽场图像，显微镜可局部激活光启动器分子。激活的光启动器局部切割PEG分子，并允许随后吸附层蛋白。在第5步中，神经元被播种并粘附在层压素阵列上。P3 （GFP/番茄核） 胶质母细胞然后沉积在神经元模式，图像被获取（步骤6）。缩写:PEG = 聚乙二醇;紫外线=紫外线:GFP=绿色荧光蛋白。请单击此处查看此图的较大版本。

图2:斐济工具演示和分析工作流程。（A） 当将宏添加到 Fiji.app 文件夹中时，称为Gliomas-神经元的工具在"更多工具"菜单中可用，|宏|工具集（左面板）。它由以下几个操作工具（右面板）组成。（B ）网络工具:图像处理，用于以简化的表示方式绘制神经网络和胶质瘤细胞。ii.单细胞跟踪工具:图像处理，用于绘制和选择细胞运动区域，用于分析单细胞的位移。iii.跟踪工具:使用预安装的斐济跟踪插件的图像预处理步骤。iv.相对迁移工具:用于在手动选择的模式上确定相对单元格迁移的图像处理。某些参数可以通过左键单击工具按钮进行校准。缩写:CSE = 对比度拉伸增强;SED=索贝尔边缘探测器;F = 双重过滤;CM=转换为面膜:Sk=骨架化:EP = 消除颗粒;或（合并） = 选定投资回报率的联盟运营商;和=选定投资回报率的联合操作员。请单击此处查看此图的较大版本。

图3:对P3细胞或球体在图案神经元与层压素涂层的比较。（A） 在神经元或层压素上分离的P3 GFP/番茄核细胞的形状描述。在i.图案神经元或二。层压素涂层。比例杆 = 50μm. iii.模式化神经元或层压素的平均细胞面积。iv.形成因素是圆周与规范化区域与圆的区域的比率，提供细胞拉长和细胞分支的参数。v.纵横比是主轴与细胞小轴的比率。在iii、 iv和v 中，每个领域分析了 15 个单元格:4 个独立模式;数据表示为平均± S.E..M （B） 分离的 P3 细胞的跟踪分析。（i）图案神经元上的细胞图和（ii）层蛋白涂层上的细胞的一个代表性图表图。iii. P3细胞的MSD在神经元或层压素涂层上迁移。X/Y 值处于对数级。iv.方向性比率。v.平均细胞速度迁移。在iii、 iv和v 中，每个领域分析了 15 个单元格:4 个独立模式;数据表示为P3 GFP球体的平均±S.E..M（C）迁移分析。在（i）图案神经元或（ii）层蛋白涂层上 P3 球形的不同时间点的代表性图像。比例杆 =100μm. iii.以模式汇流为代表的球形迁移;4 个独立模式;数据表示为平均± S. e. .M 缩写: Gfp = 绿色荧光蛋白;S.E..M= 平均标准误差;MSD=平均方位移。请单击此处查看此图的较大版本。

视频1:神经元或层压素上的P3细胞记录超过8小时（每5分钟成像一次）。该视频显示P3单细胞迁移神经元（左）和层压素涂层（右）。细胞表示绿色荧光蛋白（GFP，绿色）和核番茄（红色）。酒吧 = 50μm.请点击这里下载此视频。

视频2:在神经元或层压素上的P3球体记录超过8小时（图像每5分钟）。该视频显示P3球形迁移在神经元（左）和层压素涂层（右）。细胞表示绿色荧光蛋白（GFP，绿色）。酒吧 = 100μm.请点击这里下载此视频。

作者宣称他们没有利益冲突。