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方法文章

在图案化神经元上共培养胶质母细胞瘤干细胞样细胞以研究迁移和细胞相互作用

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DOI：

10.3791/62213

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2021年2月24日

 ,  ,  ,  ,  , 
1University Bordeaux, INSERM, LAMC, U1029, 33600, Pessac, France, 2Univ. Bordeaux, CNRS, Interdisciplinary Institute for Neuroscience, IINS, UMR 5297, Bordeaux, France, 3Alvéole, Bordeaux, France, 4University Bordeaux, CNRS, IBGC, UMR5095, 33000, Bordeaux, France

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种易于使用的共培养实验方法，用于分析胶质母细胞瘤（GBM）细胞在图案化神经元上的迁移。我们开发了一个FiJi软件宏，可简便地定量GBM细胞在神经元上的迁移，观察到神经元可改变GBM细胞的侵袭能力。

摘要

胶质母细胞瘤（GBM）是四级恶性胶质瘤，因其侵袭性强而成为人类最致命的癌症类型之一。尽管在这些肿瘤的遗传学方面已取得显著进展，但GBM细胞如何侵入健康脑实质仍不甚清楚。值得注意的是，已有研究表明GBM细胞可通过不同途径侵入瘤周区域，本文主要关注沿白质纤维束（WMTs）的侵袭路径。肿瘤细胞与瘤周神经细胞成分之间的相互作用尚未被充分阐明。本文介绍了一种用于评估神经元对GBM细胞侵袭影响的方法。该研究提出了一种先进的体外共培养检测技术，通过分析GBM干细胞样细胞在神经元上的迁移行为，模拟其沿白质纤维束的侵袭过程。利用开源且免费的软件进行自动追踪，可实时监测GBM细胞在神经元存在条件下的行为变化。该方法具有广泛的应用价值，尤其适用于功能与机制研究，以及评估可抑制GBM细胞在神经元上迁移的药理学试剂的作用效果。

引言

原发性恶性胶质瘤（包括胶质母细胞瘤，GBM）是极具破坏性的肿瘤，GBM患者的中位生存期仅为12至15个月。目前的治疗手段主要依赖于大范围肿瘤切除术，并结合化疗与放疗，但仅能将生存期延长数月。治疗失败与血脑屏障（BBB）导致的药物递送困难以及肿瘤细胞在血管周围间隙、脑膜和白质纤维束（WMTs）中的侵袭性生长密切相关1。血管周围侵袭，也称为血管共选择（vascular co-option），是一个已被深入研究的过程，其分子机制正逐步被阐明；然而，GBM细胞沿白质纤维束（WMTs）侵袭的过程尚不明确。肿瘤细胞会沿着Scherer所描述的次级结构向健康脑组织迁移2。事实上，近一个世纪前，Hans-Joachim Scherer描述了GBM的侵袭路径，这些路径现被称为神经元周围卫星现象（perineuronal satellitosis）、血管周围卫星现象（perivascular satellitosis）、软脑膜下播散以及沿白质纤维束（WMT）的侵袭（图1A）。

某些趋化因子及其受体（如基质细胞衍生因子-1α（SDF1α）和C-X-C基序趋化因子受体4（CXCR4）），但不包括血管内皮生长因子（VEGF），似乎参与了白质微管（WMT）侵袭3。最近，研究发现跨细胞的NOTCH1-SOX2轴是胶质母细胞瘤（GBM）细胞WMT侵袭的重要通路4。作者描述了GBM干细胞样细胞如何沿部分未髓鞘化的神经元侵入脑实质，并提示GBM细胞可破坏髓鞘。2019年，《自然》（Nature）期刊连续发表了三篇文章，强调了电活动在胶质瘤发展中的作用，成为该领域的一个里程碑5,6。Monje及其合作者的开创性工作揭示了电活动在促进神经配体-3分泌中的核心作用，而神经配体-3可推动胶质瘤的发展。

Winkler 及其合作者描述了胶质母细胞瘤（GBM）细胞之间通过微管连接在侵袭过程中的关键作用，以及最近发现的 GBM 细胞与神经元之间通过新型神经胶质瘤突触的相互作用。这些结构有利于谷氨酸能刺激位于 GBM 细胞膜上的 α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸（AMPA）受体，从而促进肿瘤的生长和侵袭。肿瘤细胞的侵袭是转移灶或远端继发灶扩散的核心过程，在胶质母细胞瘤患者中已观察到这一现象。已有多种因素被证实对 GBM 侵袭具有重要作用，例如血小板反应蛋白-1（thrombospondin-1）、转化生长因子 β（TGFβ）调控的基质细胞蛋白，以及趋化因子受体 CXCR37,8。

本文描述了一种用于研究胶质母细胞瘤（GBM）侵袭的简化仿生模型，其中神经元被排列在层粘连蛋白的轨迹上，而GBM细胞则以单细胞或球状体形式接种于其上（图1B）。这两种实验设置旨在模拟在GBM中观察到的沿神经元的侵袭行为9,10,11。过去已开发出类似的模型，例如排列有序的纳米纤维生物材料（核壳静电纺丝），可用于通过调节机械或化学特性来研究细胞迁移12。本文所述的共培养模型有助于更深入理解GBM细胞如何沿神经元逃逸，并揭示参与该过程的新分子通路。

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方案

所有患者均签署了知情同意书（根据挪威卑尔根哈肯兰医院当地伦理委员会的规定）。本方案遵循波尔多大学人类与动物研究伦理委员会的指导方针。怀孕大鼠饲养并处理于波尔多大学的动物实验中心。通过使用CO2对妊娠E18期的大鼠实施安乐死。所有动物实验均按照机构指南进行，并经当地伦理委员会批准。所有商用产品均在材料表中列出。

1. 图案化载玻片的制备

  1. 微图案化基底的制备
    1. 将18 mm圆形玻璃盖玻片进行空气/等离子体活化处理5分钟。将盖玻片置于密闭容器中，在干燥器内加入100 µL的(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷，处理1小时。
    2. 在10 mM碳酸盐缓冲液（pH > 8）中，加入100 mg/mL的聚乙二醇-琥珀酰亚胺戊酸酯（分子量5,000，Peg-SVA），孵育1小时。用超纯水充分冲洗，并在化学通风橱中干燥。
      ​注意：此步骤完成后，样品可在避光条件下于4 °C保存以备后续使用。
    3. 在磷酸盐缓冲液（PBS）中加入光引发剂4-苯甲酰基苄基-三甲基氯化铵（PLPP），终浓度为14.7 mg/mL。
      注意：也可使用浓缩形式的PLPP，即PLPP凝胶。使用凝胶可缩短紫外光（UV）照射时间，从而更快地降解PEG刷层（所需剂量为100 mJ/mm2）。
  2. 光引发剂凝胶的涂布
    1. 将3 µL PLPP凝胶与50 µL无水乙醇混合，滴加于载玻片中心。将样品置于化学通风橱中，直至无水乙醇完全蒸发。
      注意：此步骤完成后，样品可在避光条件下于4 °C保存以备后续使用。
  3. 玻璃载玻片的微图案化
    1. 将盖玻片安装至Ludin腔室中，并放置于配备自动对焦系统的显微镜的电动载物台上。
    2. 将预期微图案对应的图像载入软件中。设置以下参数：重复4×4次，间距200 µm，紫外光剂量1,000 mJ/mm2。自动紫外照射程序完成后，用多次PBS洗涤去除PLPP。
      注意：若使用了PLPP凝胶，则需用去离子水充分洗涤以去除凝胶，随后用N2气流吹干，并于4 °C保存。
    3. 加入层粘连蛋白（laminin，50 µg/mL溶于PBS）孵育30分钟。用PBS充分洗涤。
      ​注意：可将纯化的绿色荧光蛋白（GFP，10 µg/mL溶于PBS）的荧光溶液与laminin混合，以便通过荧光显微镜观察微图案。

2. 神经元与胶质母细胞瘤细胞共培养的准备

  1. 胚胎大鼠海马神经元的培养
    1. 解剖胚胎期（E18）大鼠的海马组织，并将组织转移至含有 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）/1 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）/青霉素-链霉素的 15 mL 离心管中。去除多余液体时避免使海马组织干燥。
    2. 加入5 mL含青霉素（10,000 单位/mL）/链霉素（10,000 µg/mL）和1 mM HEPES的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）溶液，于37 °C孵育15分钟。用HBSS/HEPES/青霉素-链霉素溶液洗涤2次，每次2-3分钟，并使组织在此溶液中保留2-3分钟。
    3. 使用两支火焰抛光的巴斯德移液管对组织进行解离，每支移液管上下吹打10次，注意尽量减少泡沫产生。对细胞进行计数，并评估细胞悬液的活力。按照下文所述，将神经元接种于微图案化盖玻片上。
      注意：提取后细胞活力为85-90%。
  2. 在微图形盖玻片上进行神经元细胞培养
    1. 用 PBS 重悬微图案化玻璃载片，并加入完全神经元细胞培养基孵育。
    2. 将取自E18 Sprague-Dawley大鼠的海马神经元直接接种于微图形化玻璃盖玻片上，接种密度为每平方厘米50,000个细胞2 在添加了3%马血清的神经基础培养基（NBM）中，将微图案化神经元置于培养箱内（37 °C，5% CO₂）248 小时。
      注意：约6小时后，可观察到原代海马神经元附着于层粘连蛋白微图案上。
  3. 人胶质母细胞瘤干细胞样细胞与神经元的共培养
    ​注意：本研究中，膜定位 GFP 阳性及核内番茄红色荧光蛋白 根据既往发表的方案培养患者来源的胶质母细胞瘤细胞10.
    1. 当球形细胞在悬浮培养中生长时，以200 × g离心悬浮液5分钟 g用 5 mL 磷酸盐缓冲液洗涤类球体，并将细胞与 0.5 mL 细胞解离试剂共同孵育（参见 材料表在37 °C下孵育5分钟。
    2. 加入4.5 mL完全NBM（按此前所述添加B27补充剂、肝素、成纤维细胞生长因子2、青霉素和链霉素）8），并使用自动计数技术对细胞进行计数。
    3. 在含有3%马血清的NBM培养基中，将1,000个GBM细胞接种于微图形化神经元培养体系上。将培养板置于37 °C、5% CO₂条件下孵育。2，以及95%的湿度。

3. 活细胞成像

  1. 在GBM细胞接种后立即把样品放置在配备有恒温箱的倒置显微镜载物台上。使用配备电动载物台的显微镜，通过软件中的多维采集工具记录多个位置，进行活细胞成像。在温度（37 °C）和气体（5% CO2）控制的环境中，使用20倍物镜每5分钟采集一次明场和落射荧光GFP/Tomato图像，持续12小时。

4. 图像分析

注意：使用 Fiji 软件，通过一种自制且用户友好的工具（可在此地址获取：https://github.com/Guyon-J/Coculture_Gliomas-Neurons/blob/main/README.md），对二维（2D）图像 堆栈进行半自动化的预处理或处理，该工具采用 IJ1 宏语言编写（图 2A）。自动化的流程和操作步骤总结于 图 2B 中。

  1. 神经元网络分析（图2生物)
    1. 选择图像堆栈中的一个图像。在图像上单击右键 网络 用于打开相应项的工具 选项 对话框并调整设置（例如， 阈值 = 三角，Li，Huang…, 高斯模糊，以及 中位数 滤波器 = 1, 2, 3…) 以实现图像的精确分割。然后，单击 好的.
    2. 左键单击 网络 自动激活以下程序的工具。
      1. 复制所选图像，并 分离 将其分为三个颜色通道（红色-灰色-绿色）。
      2. 选择灰度通道（明场），并执行 对比度拉伸增强 （毛细管区带电泳，CSE）以增强不同区域之间的分离效果。使用 Sobel 边缘检测器 （SED）执行二维信号处理卷积运算，该运算已被归入 寻找边缘 命令
      3. 对于 双过滤 （F）应用高斯模糊和中值滤波以减少噪声并平滑目标信号。 转换为蒙版 通过执行改进的阈值算法获得二值图像（BIN-grey），其中黑色像素代表细胞区域，白色像素代表背景。 骨架化 （Sk）将细胞区域简化为一个简单的网络（NET），并 过滤颗粒物 通过去除微小的非网络状颗粒，对NET图像中的（EP）进行处理。
      4. 对于红色和绿色通道（细胞核和细胞膜），执行 双过滤, 转换为蒙版 使用改进的阈值法，并允许BIN-green确定细胞形态 分析颗粒 命令
      5. 使用各通道的兴趣区域（ROI）合并所有通道 或 （合并）操作符，并将其初始颜色重新调整为简单的RGB图像。
  2. 单细胞运动性分析（图2Bii)
    1. 右键单击 单细胞追踪 用于打开相应文件的工具 选项 对话框，并调整设置（例如， 步道类型 细胞核或细胞膜 阈值 = 三角，Li，Huang…, Z 投影 最大强度，总和切片… 高斯模糊 和 中位数 滤波器 = 1, 2, 3…) 以实现图像的精确分割。然后，单击 好的.
    2. 左键单击 单细胞追踪 自动激活以下程序的工具。
      1. 移除灰色通道。应用一个 Z 投影 在堆栈上，将生成一个随时间变化的图像堆栈（T-堆栈）。 双过滤 和 转换为蒙版 细胞留下的轨迹。对BIN-red/green图像去除小颗粒。
      2. 使用 ROI 选择细胞轨迹的每个轮廓，并勾选该框 跳过边缘检测 在 选项 用于跳过此预处理步骤的对话框，以便进行后续步骤。
      3. 分离 红色通道（步道类型 = 细胞核）在原始图像序列上。选择一个 ROI 并去除外围区域。 双过滤器 所有图像和 转换为蒙版 （BIN-红色）。确定每个二值化细胞核的质心X/Y位置。
    3. 使用已发表的电子表格软件宏13，计算该细胞的均方位移、方向性比率和平均速度。
  3. 多细胞追踪分析（图2Biii)
    1. 右键单击 追踪 用于打开相应项的工具 选项 对话框并调整设置（例如， 阈值 = 三角，Li，Huang…, 高斯模糊 和 中位数 滤波器 = 1, 2, 3…) 以实现图像的精确分割。然后，单击 好的.
    2. 左键单击 追踪 用于自动激活以下程序的工具。
      1. 移除灰色通道。
      2. 分离 红色和绿色通道， 双滤器，以及 转换为蒙版.
      3. 使用合并通道 图像计算器… 命令与 与 操作者，仅保留膜中发现的细胞核信号。
        注意：可使用 Fiji 中的多个插件同时确定该二值化预处理图像中多个细胞的 X/Y 位置（参见 材料表).
    3. 使用先前描述的宏13，计算这些细胞的轨迹图、均方位移、方向性比率和平均速度。
  4. 神经基质上类球体的迁移图2Biv)
    1. 右键单击 迁移 打开相应内容的工具 选项 对话框并调整设置（例如， 阈值 = 三角，Li，Huang…, 高斯模糊 和 中位数 滤波器 = 1, 2, 3…) 以实现图像的精确分割。然后，单击 好的.
    2. 左键单击 迁移 用于自动启动以下程序的工具。
      1. 移除红色通道。
      2. 分离 绿色和灰色通道。
      3. 对于灰度通道， 绘制 手动勾画神经元网络的轮廓，并测量其面积。
      4. 对于绿色通道， 双滤器 堆栈和 转换为蒙版去除图案外部区域（BIN），并确定每幅图像的二值化细胞面积。
        ​注意：上述参数可通过左键单击相应图标并调整其数值进行校准。此处理过程可手动完成。然而，当涉及大量图像（每次采集约一百张）、多个通道（通常为3个通道）以及多个处理步骤时，采用自动化或半自动化工具更为理想。

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结果

按照方案部分所述，制备了与荧光标记的胶质母细胞瘤（GBM）细胞共培养的图案化神经元，并进行了细胞迁移追踪实验。GBM细胞在神经元上迁移时迅速改变其形态（图1B：第6个面板和视频1）。细胞沿着神经元突起以随机运动方式迁移（视频1）。荧光标记的GBM细胞与无荧光的神经元可被清晰区分，从而可按照方案部分所述，利用Fiji宏对细胞运动进行追踪（图2）。Fiji是一款开源软件，可促进图像处理与分析。对于大量图像的分析，传统手动操作相对耗时，而通过宏可实现自动化。图像可通过拖放方式导入，随后进行处理与定量分析，并利用ROI管理器生成可用数据。

当将 Gliomas-Neurons 工具放置于 Fiji.app | macros | toolsets 文件夹中后，该工具会出现在 More Too...

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讨论

胶质母细胞瘤通过多种模式广泛侵袭脑实质：周围血管共选项、间质性侵袭或沿白质纤维束（WMTs）侵袭18。由于难以建立与WMT侵袭相关的合适体外（in vitro）或体内（in vivo）模型，文献中对后一种侵袭模式的研究尚不充分。本研究提出了一种简化模型，即在层粘连蛋白包被的表面构建培养的大鼠神经元图案，并将荧光标记的胶质母细胞瘤（GBM）干细胞样细胞接种于神经元之上。本研究采用网格状图案，以提高对肿瘤细胞黏附、侵袭和增殖的分析效率。GBM细胞在神经元上的迁移效率高于直接在基质（本实验中为层粘连蛋白）上的迁移。在记录过程中，细胞形态发生改变，同时细胞表面积增加。GBM干细胞样细胞可能通过特定信号通路（如NOTCH2/SOX2）4的激活，或神经元自身分泌的因子和信号被神经元纤维束吸引。该系统非常适合分析GBM细胞与神经元之间的分子交换，这些分子可能包括代谢物、神经递质或细胞因子。

最近，Venkatesh 及其合作者描述了一种神经胶质瘤突触的形成，其中谷氨...

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

本工作由 Fondation ARC 2020、法国抗癌联盟（吉伦特省委员会）、ARTC、2021 年癌症计划（Plan Cancer 2021）以及 INCA PLBIO 资助。Alveole 公司获得法国国家研究署（Agence Nationale de la Recherche）资助（项目编号：Labex BRAIN ANR-10-LABX-43）。Joris Guyon 获得图卢兹大学医院（CHU Toulouse）博士后奖学金资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷Sigma440140-100ML氨基可用于mPEG-SVA的生物偶联
96孔圆底板Sarstedt2582624用于制备球状体
AccutaseGibcoA11105-01长期储存于-20 °C，短期储存于4 °C，用于球状体解离的酶
B27Gibco12587储存于-20 °C，使用前需解冻
碱性成纤维细胞生长因子Peprotech100-18B储存于-20 °C，使用前需解冻
Countess 细胞计数载玻片InvitrogenC10283用于细胞计数
盖玻片Marienfeld111580细胞培养基底
干燥剂盒SigmaZ363456-6EA用于在(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷处理过程中减少湿度
DPBS 10倍浓缩液Pan BiotechP04-53-500储存于4 °C
Fiji软件，MTrack2宏ImageJ用于图像分析
75 cm²培养瓶Falcon10497302
HBSSSigmaH8264-500ML
肝素钠SigmaH3149-100KU储存于4 °C
层粘连蛋白114956-81-9促进神经元黏附
Leonardo软件用于加载预设的微图案
MetaMorph软件 Molecular Devices LLCNA显微镜自动化软件
甲基纤维素SigmaM0512用NBM稀释至终浓度为2%
Neurobasal培养基Gibco21103-049储存于4 °C
Nikon TiE（S Fluor，20x/0.75 NA）配备电动载物台的倒置显微镜 
青霉素-链霉素Gibco15140-122储存于4 °C
PLPPAlveolePLPPclassic_1ml光引发剂，用于降解PEG刷层
聚乙二醇-琥珀酰亚胺基戊酸酯（mPEG-SVA）Laysan BioVA-PEG-VA-5000-5g用作抗污染涂层
PRIMOAlveolePRIMO1基于数字微镜器件（DMD）的紫外光投影装置
0.4%台盼蓝ThermoFisherT10282用于细胞计数
胰蛋白酶-EDTASigmaT4049-100ML用于解离贴壁细胞

参考文献

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