在图案化神经元上共培养胶质母细胞瘤干细胞样细胞以研究迁移和细胞相互作用

摘要

本文介绍了一种易于使用的共培养实验方法，用于分析胶质母细胞瘤（GBM）细胞在图案化神经元上的迁移。我们开发了一个FiJi软件宏，可简便地定量GBM细胞在神经元上的迁移，观察到神经元可改变GBM细胞的侵袭能力。

摘要

胶质母细胞瘤（GBM）是四级恶性胶质瘤，因其侵袭性强而成为人类最致命的癌症类型之一。尽管在这些肿瘤的遗传学方面已取得显著进展，但GBM细胞如何侵入健康脑实质仍不甚清楚。值得注意的是，已有研究表明GBM细胞可通过不同途径侵入瘤周区域，本文主要关注沿白质纤维束（WMTs）的侵袭路径。肿瘤细胞与瘤周神经细胞成分之间的相互作用尚未被充分阐明。本文介绍了一种用于评估神经元对GBM细胞侵袭影响的方法。该研究提出了一种先进的体外共培养检测技术，通过分析GBM干细胞样细胞在神经元上的迁移行为，模拟其沿白质纤维束的侵袭过程。利用开源且免费的软件进行自动追踪，可实时监测GBM细胞在神经元存在条件下的行为变化。该方法具有广泛的应用价值，尤其适用于功能与机制研究，以及评估可抑制GBM细胞在神经元上迁移的药理学试剂的作用效果。

引言

原发性恶性胶质瘤（包括胶质母细胞瘤，GBM）是极具破坏性的肿瘤，GBM患者的中位生存期仅为12至15个月。目前的治疗手段主要依赖于大范围肿瘤切除术，并结合化疗与放疗，但仅能将生存期延长数月。治疗失败与血脑屏障（BBB）导致的药物递送困难以及肿瘤细胞在血管周围间隙、脑膜和白质纤维束（WMTs）中的侵袭性生长密切相关¹。血管周围侵袭，也称为血管共选择（vascular co-option），是一个已被深入研究的过程，其分子机制正逐步被阐明；然而，GBM细胞沿白质纤维束（WMTs）侵袭的过程尚不明确。肿瘤细胞会沿着Scherer所描述的次级结构向健康脑组织迁移²。事实上，近一个世纪前，Hans-Joachim Scherer描述了GBM的侵袭路径，这些路径现被称为神经元周围卫星现象（perineuronal satellitosis）、血管周围卫星现象（perivascular satellitosis）、软脑膜下播散以及沿白质纤维束（WMT）的侵袭（图1A）。

某些趋化因子及其受体（如基质细胞衍生因子-1α（SDF1α）和C-X-C基序趋化因子受体4（CXCR4）），但不包括血管内皮生长因子（VEGF），似乎参与了白质微管（WMT）侵袭³。最近，研究发现跨细胞的NOTCH1-SOX2轴是胶质母细胞瘤（GB....

方案

所有患者均签署了知情同意书（根据挪威卑尔根哈肯兰医院当地伦理委员会的规定）。本方案遵循波尔多大学人类与动物研究伦理委员会的指导方针。怀孕大鼠饲养并处理于波尔多大学的动物实验中心。通过使用CO₂对妊娠E18期的大鼠实施安乐死。所有动物实验均按照机构指南进行，并经当地伦理委员会批准。所有商用产品均在材料表中列出。

1. 图案化载玻片的制备

1. 微图案化基底的制备
   1. 将18 mm圆形玻璃盖玻片进行空气/等离子体活化处理5分钟。将盖玻片置于密闭容器中，在干燥器内加入100 µL的(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷，处理1小时。
   2. 在10 mM碳酸盐缓冲液（pH > 8）中，加入100 mg/mL的聚乙二醇-琥珀酰亚胺戊酸酯（分子量5,000，Peg-SVA），孵育1小时。用超纯水充分冲洗，并在化学通风橱中干燥。
      ​注意：此步骤完成后，样品可在避光条件下于4 °C保存以备后续使用。
   3. 在磷酸盐缓冲液（PBS）中加入光引发剂4-苯甲酰基苄基-三甲基氯化铵（PLPP），终浓度为14.7 mg/mL。
      注意：也可使用浓缩形式的PLPP，即PLPP凝胶。使用凝胶可缩短紫外光（UV）照射时间，从而更快地降解PEG刷层（所需剂量为100 mJ/mm²）。
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结果

按照方案部分所述，制备了与荧光标记的胶质母细胞瘤（GBM）细胞共培养的图案化神经元，并进行了细胞迁移追踪实验。GBM细胞在神经元上迁移时迅速改变其形态（图1B：第6个面板和视频1）。细胞沿着神经元突起以随机运动方式迁移（视频1）。荧光标记的GBM细胞与无荧光的神经元可被清晰区分，从而可按照方案部分所述，利用Fiji宏对细胞运动进行追踪（图2）。Fiji是一款开源软件，可促进图像处理与分析。对于大量图像的分析，传统手动操作相对耗时，而通过宏可实现自动化。图像可通过拖放方式导入，随后进行处理与定量分析，并利用ROI管理器生成可用数据。

当将 Gliomas-Neurons 工具放置于 Fiji.app | macros | toolsets 文件夹中后，该工具会出现在 More Too.......

讨论

胶质母细胞瘤通过多种模式广泛侵袭脑实质：周围血管共选项、间质性侵袭或沿白质纤维束（WMTs）侵袭¹⁸。由于难以建立与WMT侵袭相关的合适体外（in vitro）或体内（in vivo）模型，文献中对后一种侵袭模式的研究尚不充分。本研究提出了一种简化模型，即在层粘连蛋白包被的表面构建培养的大鼠神经元图案，并将荧光标记的胶质母细胞瘤（GBM）干细胞样细胞接种于神经元之上。本研究采用网格状图案，以提高对肿瘤细胞黏附、侵袭和增殖的分析效率。GBM细胞在神经元上的迁移效率高于直接在基质（本实验中为层粘连蛋白）上的迁移。在记录过程中，细胞形态发生改变，同时细胞表面积增加。GBM干细胞样细胞可能通过特定信号通路（如NOTCH2/SOX2）⁴的激活，或神经元自身分泌的因子和信号被神经元纤维束吸引。该系统非常适合分析GBM细胞与神经元之间的分子交换，这些分子可能包括代谢物、神经递质或细胞因子。

最近，Venkatesh 及其合作者描述了一种神经胶质瘤突触的形成，其中谷氨.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷	Sigma	440140-100ML	氨基可用于mPEG-SVA的生物偶联
96孔圆底板	Sarstedt	2582624	用于制备球状体
Accutase	Gibco	A11105-01	长期储存于-20 °C，短期储存于4 °C，用于球状体解离的酶
B27	Gibco	12587	储存于-20 °C，使用前需解冻
碱性成纤维细胞生长因子	Peprotech	100-18B	储存于-20 °C，使用前需解冻
Countess 细胞计数载玻片	Invitrogen	C10283	用于细胞计数
盖玻片	Marienfeld	111580	细胞培养基底
干燥剂盒	Sigma	Z363456-6EA	用于在(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷处理过程中减少湿度
DPBS 10倍浓缩液	Pan Biotech	P04-53-500	储存于4 °C
Fiji软件，MTrack2宏	ImageJ		用于图像分析
75 cm²培养瓶	Falcon	10497302
HBSS	Sigma	H8264-500ML
肝素钠	Sigma	H3149-100KU	储存于4 °C
层粘连蛋白		114956-81-9	促进神经元黏附
Leonardo软件			用于加载预设的微图案
MetaMorph软件	Molecular Devices LLC	NA	显微镜自动化软件
甲基纤维素	Sigma	M0512	用NBM稀释至终浓度为2%
Neurobasal培养基	Gibco	21103-049	储存于4 °C
Nikon TiE（S Fluor，20x/0.75 NA）			配备电动载物台的倒置显微镜
青霉素-链霉素	Gibco	15140-122	储存于4 °C
PLPP	Alveole	PLPPclassic_1ml	光引发剂，用于降解PEG刷层
聚乙二醇-琥珀酰亚胺基戊酸酯（mPEG-SVA）	Laysan Bio	VA-PEG-VA-5000-5g	用作抗污染涂层
PRIMO	Alveole	PRIMO1	基于数字微镜器件（DMD）的紫外光投影装置
0.4%台盼蓝	ThermoFisher	T10282	用于细胞计数
胰蛋白酶-EDTA	Sigma	T4049-100ML	用于解离贴壁细胞