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诱导多能干细胞来源巨噬细胞吞噬死亡神经母细胞瘤细胞的体外定量成像分析

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DOI：

10.3791/62217

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2021年2月14日

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1James Martin Stem Cell Facility, Sir William Dunn School of Pathology, University of Oxford, 2Alzheimer’s Research UK Oxford Drug Discovery Institute, Nuffield Department of Medicine Research Building, University of Oxford, 3UK Dementia Research Institute, Cardiff University

本文内容

摘要

神经退行性疾病与小胶质细胞功能失调相关。本文介绍了一种利用iPSC来源的巨噬细胞体外吞噬神经母细胞瘤细胞的检测方法。文中描述了活细胞延时成像和固定细胞高内涵成像的定量显微镜读数分析方法。

摘要

小胶质细胞在多种神经退行性疾病（包括帕金森病和阿尔茨海默病）中协调神经免疫反应。小胶质细胞通过胞葬作用（一种特化的吞噬作用）清除死亡和濒死神经元。环境或遗传风险因素可干扰小胶质细胞的吞噬功能。本文介绍了一种快速、简便的体外 利用诱导性多能干细胞（iPSC）来源的小胶质细胞模型研究小胶质细胞吞噬作用的显微镜检测方案，采用经pH敏感性染料标记的SH-SY5Y人源神经母细胞瘤细胞系作为吞噬底物。该方法可高效获得大量死亡的神经母细胞瘤细胞，其细胞表面暴露磷脂酰丝氨酸，可被小胶质细胞识别为吞噬信号 "吃我信号" 通过吞噬细胞产生信号。该96孔板检测法适用于活细胞时间序列成像，也可在进一步处理前成功固定，并通过高内涵显微镜进行定量分析。固定细胞的高内涵显微镜检测使本实验可用于小分子抑制剂的高通量筛选，或评估携带遗传变异的诱导多能干细胞（iPSC）系的吞噬功能。尽管该检测最初是为研究iPSC来源巨噬细胞对完整死亡神经母细胞瘤细胞的吞噬作用而开发，但也可轻松适配用于其他与神经退行性疾病相关的吞噬底物（如突触体和髓鞘）以及其它吞噬性细胞类型。

引言

小胶质细胞是脑组织中的常驻巨噬细胞，其功能包括免疫监视、协调对损伤或感染的炎症反应、突触重塑，以及对死亡细胞、髓鞘、蛋白质聚集体和病原体的吞噬作用。吞噬作用是指小胶质细胞通过表面受体识别目标物质，并重组其细胞骨架，将目标包裹形成吞噬体，随后吞噬体与溶酶体融合，从而降解所摄入的物质。健康的小胶质细胞会吞噬凋亡的脑细胞，以防止其发展为坏死状态1。对凋亡细胞的吞噬也称为胞葬作用（efferocytosis），需要由濒死细胞在其表面暴露磷脂酰丝氨酸作为“吃我”信号2。多种小胶质细胞受体可直接结合磷脂酰丝氨酸，包括 TIM-4、BAI1、Stabilin-2 和 TREM2。小胶质细胞的 TAM 受体（如 MERTK）和整合素则分别通过辅助蛋白 GAS6 或 MFG-E8 间接结合磷脂酰丝氨酸。此外，识别濒死细胞可能还需要其他“吃我”信号，这些信号包括细胞表面蛋白的糖基化或电荷改变；细胞表面表达原本位于胞内的蛋白质如 ICAM3、钙网蛋白、膜联蛋白-I；氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）；或由小胶质细胞产生的补体 C1q 覆盖在凋亡细胞表面1,2。

神经退行性疾病，包括帕金森病、阿尔茨海默病、额颞叶痴呆和肌萎缩侧索硬化症，均与小胶质细胞功能障碍相关，表现为脑内废物（如死亡细胞、髓鞘碎片和蛋白质聚集体）的积聚，以及对这些刺激物产生过度的炎症反应3。在神经退行性疾病中，吞噬作用可能因衰老、炎症或特定遗传风险变异的共同作用而受损，从而促进疾病病理进程4,5。另一方面，来自动物模型的研究也表明，小胶质细胞可能异常地吞噬存活的神经元或突触6,7,8。该机制可能由受损神经突起表面暴露的磷脂酰丝氨酸引发，后者可被小胶质细胞的吞噬受体TREM2或GPR56直接识别，或通过可溶性补体C1q包被富含磷脂酰丝氨酸的膜结构而间接识别，进而通过CR3介导的途径触发吞噬作用9,10,11。

体外吞噬功能检测，例如评估小胶质细胞中遗传风险变异的表型影响，通常使用非生理性的货物，如乳胶珠4。荧光标记的细菌和酵母聚糖也常被使用，这些虽属生理性货物，但与神经退行性疾病无关。非生理性吞噬货物可用于检测吞噬作用基本机制中的缺陷，但无法准确模拟吞噬凋亡神经元过程中第一步的“识别”环节。货物的大小、形状、硬度和类型均决定了所激活的细胞内信号通路，从而导致小胶质细胞活化状态的不同结果。例如，E.coli细菌体积小且质地坚硬，与人类细胞不同，其表面的脂多糖可被Toll样受体4（TLR4）识别，进而激活吞噬作用及促炎性信号通路2,12。

在神经退行性疾病研究中，更相关的吞噬作用底物应是在哺乳动物细胞质膜上暴露磷脂酰丝氨酸，并且理想情况下应为人类神经元来源，以包含小胶质细胞可能遇到的信号。在本吞噬作用实验方案中，选用人源神经母细胞瘤细胞系 SH-SY5Y 作为易于培养的神经元模型。通过甲醛固定人工诱导细胞表面持续暴露磷脂酰丝氨酸，该方法此前已被证明可导致血小板暴露磷脂酰丝氨酸13。小胶质细胞模型采用人源诱导多能干细胞来源的巨噬细胞（iPSC-巨噬细胞），其可模拟人小胶质细胞的发育起源和转录谱特征，并具备吞噬能力14,15,16,17。iPSC-巨噬细胞并非目前最接近真实的小胶质细胞模型，例如其不能模拟小胶质细胞的形态；但如有需要，可替换为更真实的单培养 iPSC 小胶质细胞模型，如 Haenseler 等人15 所建立的模型。由于人类与小鼠神经退行性疾病组织中小胶质细胞转录模块的重叠度有限，因此在研究神经退行性疾病时，人源 iPSC 模型优于原代啮齿类小胶质细胞18。死亡的 SH-SY5Y 细胞使用一种酸敏感性荧光染料进行标记，该染料在中性 pH 下荧光较弱，而在吞噬溶酶体内 pH 较低时荧光增强，从而在吞噬作用发生后可被检测。使用酸敏感性染料可提高检测吞噬事件的准确性，并适用于活细胞和固定细胞的多种检测方式19。本实验方案同时描述了活细胞时间序列成像法观察吞噬过程，以及固定细胞高内涵成像法检测吞噬作用，两种方法在检测前采用相同的细胞制备步骤（图 1）。

SH-SY5Y 细胞转化为 iPSC-巨噬细胞的过程示意图；细胞染色、成像与数据分析。
图 1：实验方法示意图。 吞噬功能检测流程概览，其中 SH-SY5Y 细胞的制备与 iPSC-巨噬细胞的染色并行进行，随后将 SH-SY5Y 细胞接种至 iPSC-巨噬细胞上。可立即进行活细胞延时成像，或在 37 °C、5% CO2 条件下孵育所需时间后，固定细胞再进行高内涵显微镜检测。PFA：多聚甲醛，HBM：无酚红 HEPES 缓冲培养基，pHr：pH 敏感性红色荧光染料 STP 酯溶液，PRFMM：无酚红巨噬细胞培养基。 请点击此处查看该图的放大版本。

方案

本实验方案遵循英国牛津大学牛津帕金森病中心（伦理委员会：英国国家医疗服务体系、健康研究局、国家研究伦理委员会南中部伯克郡分部（编号：REC 10/H0505/71））所制定的人源iPS细胞系使用指南。人源诱导性多能干细胞（iPSCs）应在II级生物安全柜中操作，以保护操作人员免受可能存在的外源性因子污染。必须遵守当地、国家以及欧盟的健康与安全法规。表1详细列出了细胞培养基的组成成分，所有实验材料均列于补充材料的材料表中。

1. 实验前细胞培养

  1. 将iPSC在预先包被了符合hESC标准的基底膜基质的6孔板中，使用iPSC培养基（表1）进行培养，保持亚融合状态，并使用较低的传代次数。
  2. 将人iPSC分化为iPSC-巨噬细胞前体：将四百万个iPSC接种至低黏附性24孔微孔板中，每孔加入2 mL拟胚体培养基（表1），以促进拟胚体形成，并在5–6天内每天更换75%的培养基。将形成的拟胚体转移至T175培养瓶中，每瓶约150个拟胚体，每瓶加入20 mL工厂培养基（表1）。每周通过添加10–20 mL工厂培养基进行换液。
    注意：iPSC-巨噬细胞前体会在分化开始约2–3周后进入上清液，并可持续产生数月。本实验建议使用分化工厂建立后约6周的细胞。过早收获的iPSC-巨噬细胞可能仍保留一定的增殖能力，且贴壁性较差，不利于低密度均匀接种。目前尚未确定iPSC-巨噬细胞吞噬功能的上限使用期限。
  3. 将iPSC-巨噬细胞前体进一步分化为iPSC-巨噬细胞：通过吸取所需体积的上清液收获前体细胞；经40 µm细胞滤网过滤以去除细胞团块；在400 × g 条件下离心5分钟以收集细胞，弃上清后重悬于巨噬细胞培养基（表1）中。将iPSC-巨噬细胞以每孔20,000–30,000个细胞的密度接种至96孔组织培养（TC）处理的微孔板中，每孔加入100 µL巨噬细胞培养基，微孔板需具备黑色孔壁和光学透明底。避免使用边缘孔，边缘孔中应加入PBS以减少蒸发对实验结果的影响。在37 °C、5% CO2条件下孵育6–10天完成分化。
    注意：本实验使用了iPSC细胞系BIONi010-C（ECACC编号：66540023）；但也可替换为其他iPSC细胞系。
  4. 在T75培养瓶中使用20 mL SH-SY5Y培养基（表1）将SH-SY5Y细胞维持在亚融合状态，每3–4天传代一次。
名称基础培养基添加物，终浓度
iPSC 培养基mTeSR1-
拟胚体培养基mTeSR1BMP4, 50 ng/mL
VEGF, 50 ng/mL
SCF, 20 ng/mL
工厂培养基XVIVO15GlutaMAX, 2 mM
Penicillin, 100 units/mL
Streptomycin, 100 µg/mL
2-Mercaptoethanol, 50 µM
IL-3, 25 ng/mL
M-CSF, 100 ng/mL
巨噬细胞培养基XVIVO15GlutaMAX, 2 mM
Penicillin, 100 units/mL
Streptomycin, 100 µg/mL
M-CSF, 100 ng/mL
SH-SY5Y 培养基DMEM/F12Fetal bovine serum, 10%
Penicillin, 100 units/mL
Streptomycin, 100 µg/mL

表1：培养基配方。

本方案中所用细胞培养基的成分。培养基组分的更多细节见材料表。

2. 死亡 SH-SY5Y 细胞的制备

  1. 在 II 级生物安全柜中，加入 4 mL 含重组胰蛋白酶样酶和 1.1 mM EDTA 的细胞解离缓冲液（见材料表），使 SH-SY5Y 细胞解离，缓冲液应立即去除，仅保留不足 1 mL 的薄层覆盖细胞。于 37 °C / 5% CO2 条件下孵育 2–3 分钟。
  2. 向 T75 培养瓶中加入 10 mL HBSS 漂洗，并将 SH-SY5Y 细胞转移至 15 mL 圆锥形离心管中。以 400 × g 离心 5 分钟。吸除上清液，并将细胞重悬于 2 mL 无酚红 HEPES 缓冲培养基中（见材料表）。确保轻柔重悬细胞沉淀，使用 100–1,000 µL 移液器吹打以分散细胞团块，再进行固定。
  3. 向离心管中加入 2 mL 4% 多聚甲醛（终浓度为 2%），固定细胞。室温下孵育 10 分钟，期间轻柔振荡管体数次。
  4. 向管中加入 10 mL HBSS。以 1,200 × g 离心 7 分钟，再将细胞重悬于 2 mL 无酚红 HEPES 缓冲培养基中。
    注意：完成步骤 2.4 后，可通过使用 Annexin V-FITC 染色检测暴露的磷脂酰丝氨酸，并结合碘化丙啶染色通过流式细胞术评估细胞通透性，对固定后的 SH-SY5Y 细胞进行质量控制。可将固定后的细胞样本与步骤 2.2 获得的活 SH-SY5Y 细胞进行比较。参见第 7 节及补充图 S1。不建议在步骤 2.4 之后长期储存固定后的 SH-SY5Y 细胞，因其稳定性尚未评估。

3. 使用 pH 敏感性红色荧光染料标记死亡的 SH-SY5Y 细胞

  1. 完成步骤2.4后，对细胞进行计数，并将所需数量的细胞转移至一个2 mL低蛋白结合力离心管中。每100万个SH-SY5Y细胞，用不含酚红的HEPES缓冲培养基将2 mL离心管中的总体积补至300–500 µL。将离心管短暂置于37 °C水浴中预热。
  2. 重悬pH敏感性红色荧光染料STP酯（见材料表），按每百万个SH-SY5Y细胞加入12.5 µg染料的比例，加入到预热的含细胞的2 mL离心管中。通过移液轻轻混匀。室温避光孵育30分钟。
    注意：pH敏感性染料的STP酯形式可与伯胺发生反应，因此标记缓冲液中不得含有游离胺。由于该染料在水性缓冲液中溶解度可能有限，应仅将溶于DMSO的染料加入温热的水性缓冲液中，立即混匀，并在显微镜下检查是否有沉淀产生（表现为暗色颗粒）。
  3. 加入1 mL HBSS，于4 °C以1200 x g离心7分钟。弃去上清液，用2 mL HBSS重悬洗涤。重复离心一次。
  4. 弃去上清液，将细胞重悬于不含酚红的巨噬细胞培养基中（见材料表），调整细胞浓度至200,000–120万细胞/mL，使得50 µL含有10,000–60,000个细胞（即SH-SY5Y细胞数量为iPSC来源巨噬细胞的0.5–3倍）。
    注意：培养基中的酚红会增加背景荧光，因此若需进行活细胞成像，应使用不含酚红的培养基。不建议将标记后的SH-SY5Y细胞储存超过数小时，因尚未对此条件进行评估。标记后的SH-SY5Y细胞应置于冰上并避光保存。

4. iPSC-巨噬细胞染色

  1. 在生物安全柜中，用巨噬细胞培养基配制一种深红色荧光、可穿透细胞的琥珀酰亚胺酯反应性染料溶液（参见 材料清单）。加入 Hoechst 33342（参见 材料清单）。将工作液加热至 37 °C 在水浴中。
  2. 用多通道移液器将iPSC-巨噬细胞培养基中的细胞上清液轻柔吸出，转移至无菌储液槽中。加入 70 µL/well 将第4.1步制备的染料溶液加入iPSC来源的巨噬细胞中，使用多通道移液器操作。在37°C下孵育1小时 37 °C/5% CO₂2.
  3. 在不含酚红的巨噬细胞培养基中配制实验处理组。包括 10 µM 以细胞松弛素D作为阴性对照处理。孵育后，用多通道移液器非常轻柔地吸除iPSC来源巨噬细胞的培养基，并加入 100 µL/well 用 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）洗涤。轻轻吸除 HBSS 后立即加入 100 µL 培养基 ± 化合物。在 37 °C/ 5% CO₂2.
    注意：细胞松弛素D是一种强效的肌动蛋白抑制剂，可阻断吞噬作用。对于需要较长孵育时间（例如24–72小时）的任何实验处理，应在步骤4.1之前进行该实验处理。 100 µL/well 在完全巨噬细胞培养基中进行处理。按照方案步骤4.1-4.3操作，完成细胞染色后，将处理重新应用于不含酚红的巨噬细胞培养基中，继续完成吞噬作用检测的后续步骤。

5. 成像吞噬作用

以下是两种不同的吞噬作用检测方法，请选择第 5.1 或 5.2 小节。

  1. 活细胞延时成像
    1. 吞噬作用开始前，开启活细胞延时成像显微镜（参见 材料表），计算机，环境舱，和 CO2 气体。打开图像采集软件。检查显微镜是否已安装DAPI、RFP和CY5滤光片组。点击 延时 | 培养 | 启用环境腔室 并选择加热至 37 °C 与 CO2 气体，同时确保取消选择湿度。让显微镜预热30分钟 37 °C.
    2. 在步骤4.3的化合物孵育期间，将iPSC-巨噬细胞板放入显微镜中。
    3. 点击 图像 | 捕获 | 血管专家选择 培养板 并选择一种96孔板类型。
    4. 在 图像 切换至相位通道，使用垂直滑块调节粗调和细调焦距，使细胞处于焦点位置。使用水平滑块调节光照强度。依次点击 DAPI、RFP 和 CY5 通道，并分别调节各通道的光照强度。
    5. 在 系统 标签，单击 校准容器对齐 并按照屏幕上的指示操作。
    6. 点击 时间推移 | 常规程序 | 创建新常规程序. 在第一个屏幕中 时间推移向导，命名该常规操作。点击 下一步在第二个界面中，选择20倍物镜，选择 单色 捕获，并选择 DAPI、RFP、CY5 和相差通道。请勿选择以下选项：自动寻找样本、自动精细聚焦、Z 轴层扫、自动照明。单击 下一步.
    7. 在下一个界面中，在每个孔的中心位置设置一个信标，这将使显微镜每次都能以相同的照明设置返回到相同的坐标位置。每个信标的聚焦和照明设置相互独立。设置信标的方法：将蓝色圆圈拖动至板图上的目标位置，使用粗调和微调对焦垂直滑块，确认无误后点击 添加 Beacon信标设置可稍后使用 更新所选内容 按钮。
    8. 准备开始吞噬作用检测时，取出检测板并置于生物安全柜中。使用多通道移液器加入 50 µL 每孔加入SH-SY5Y细胞，沿孔壁液体边缘侧向添加。
    9. 将酶标板放入显微镜，等待约30 min，使热漂移达到平衡。
      注意：在将培养板放入显微镜后的前30分钟内，由于检测板温度的变化会导致焦距发生偏移。如果未让培养板充分平衡温度，时间序列成像过程中所捕获的图像将失去焦点。
    10. 单击每个信标并更新对焦设置。单击 下一步. 在下一个屏幕的 时间流逝向导，选择文件格式 TIFF, 启用该选项以 保存各个通道，并启用该选项以 为每个信标创建视频，然后允许下方的选项 将以下信息作为水印包含在内. 点击 下一步.
    11. 设置 场景数量 1. 单击 下一步设置延时摄影的持续时间和间隔时间，例如 3 h，每 5 min 拍摄一次。请勿选择 仅捕获一帧. 点击 下一步.
    12. 开启环境室，温度设为 37 °C 和 CO2 （湿度对短时间实验为可选条件）。点击 下一步 两次。选择一个路径来保存数据。点击 下一步. 点击 开始 开始时间延时摄影。
  2. 固定细胞高内涵成像
    1. 使用多通道移液器加入 50 µL 每孔加入标记的 SH-SY5Y 细胞，加至每孔液体边缘侧壁。于 37 °C/ 5% CO₂2 3-5 小时。
    2. 吞噬作用孵育结束后，用多通道移液器轻柔吸取消化细胞上清液并弃去。用 100 µL PBS
    3. 通过添加固定板 100 µL 加入2%多聚甲醛，室温孵育15分钟。
    4. 吸去孔内液体，加入 100 µL PBS中。用板封膜和铝箔覆盖，于 4 °C 直至需要时
      注意：该检测板以此方式储存至少一周，信号不会明显降低；更长时间的储存尚未进行测试。
    5. 开启高内涵成像显微镜（参见 材料表）并打开图像采集软件。通过点击显微镜上的按钮将检测板载入显微镜 加载 屏幕顶部的图标。
    6. 选择 设置 在左上角框的下拉菜单中：选择合适的板型，选择自动对焦选项 双峰（默认），选择物镜 40倍水镜，NA 1.1，选择 共聚焦显微镜 模式，并选择合并像素 1.
    7. 使用前通过冲洗40倍水镜物镜，经由 设置 菜单
    8. 在 通道选择 方盒中，使用“+”图标添加 DAPI、Alexa 647 和 Alexa 568 通道。设置为在单个层面进行测量 1 µm优化 时间 和 功率 检测板染色效率的设置。
      注意：作为参考，DAPI 设置曝光时间为 200 ms，功率为 100%；Alexa 647 设置曝光时间为 1500 ms，功率为 100%；Alexa 568 设置曝光时间为 100 ms，功率为 40%。
    9. 确保通过单击来避免同时测量通道 通道序列 分离通道。
    10. 下 导航 | 定义布局选择待检测的孔，并为每孔选择9-12个视野。
    11. 设置过程中，点击平板图上的一个代表性区域，并依次检查每个检测通道，通过调整通道偏移确保染色存在且图像聚焦。
    12. 若要将数据上传至服务器以进行远程分析，请点击 在线工作 盒子及相应的屏幕名称；这将在成像后实现数据自动上传至服务器。
    13. 通过点击保存检测方案 保存 按钮。
    14. 点击 运行实验 点击顶部的选项卡并命名实验板，然后单击 开始.

6. 数据分析

以下是两种不同的数据分析方法，如果之前执行了第5.1小节，则选择第6.1小节；如果之前执行了第5.2小节，则选择第6.2小节。

  1. 通过活细胞延时显微镜获取的吞噬作用图像分析
    1. 下载并安装推荐的开源软件（参见材料表）。打开该软件。
    2. 在“输入模块”框中，选择图像。
    3. 从Windows 资源管理器中打开包含数据的文件夹，该文件夹下有名为 Beacon-1、Beacon-2 等的子文件夹。选择所有 Beacon 文件夹并将其拖入文件列表框中。
    4. 在输入模块框中，选择元数据。对于是否提取元数据？，选择是。在元数据提取方法旁边的下拉菜单中选择从文件/文件夹名称中提取。对于元数据来源，选择文件夹名称。点击正则表达式右侧的放大镜图标，并在正则表达式文本框中输入“.*[\.*](?P.*)$”（不含引号）。点击提交。对于从何处提取元数据，选择所有图像。点击屏幕底部的更新。此时图像将按 beacon 分组。
    5. 在输入模块框中，选择命名与类型。以下过程将允许为每个时间点的图像分配到正确的荧光通道。为图像匹配规则命名（下拉菜单）。选择规则匹配条件为以下所有规则的全部（下拉菜单）。文件（下拉菜单），是否（下拉菜单），包含（下拉菜单），DAPI（文本框）。将这些图像命名为DAPI（文本框）。选择图像类型为灰度图像（下拉菜单）。强度范围设置为从图像元数据获取（下拉菜单）。
    6. 在屏幕底部点击添加另一图像，重复步骤 6.1.5。将DAPI替换为RFP，以便对 RFP 图像进行分组。
    7. 对 CY5 通道图像重复步骤 6.1.6。
    8. 点击屏幕底部的更新，图像文件现在将以三列形式列出，分别标记为 DAPI、RFP 和 CY5。
    9. 在输入模块框中，选择分组。对于是否对图像进行分组？，选择是。在元数据类别的下拉菜单中选择Beacon。
    10. 在分析模块框中，右键单击空白区域以调出所有模块的列表。
    11. 点击添加 | 图像处理 | 增强或抑制特征。在第一个下拉框中选择DAPI作为输入图像。将输出图像命名为“DAPIspeckles”。选择操作类型为增强，特征类型为斑点，特征大小为20像素。选择速度与精度选项为快速/六边形。
    12. 创建一个新模块。添加 | 对象处理 | 识别初级对象。在第一个下拉框中选择DAPIspeckles作为输入图像。将初级对象命名为“Nuclei”。输入对象的典型直径为10至35像素单位；此参数可优化。选择阈值策略为全局，阈值方法为RidlerCalvard，平滑方法为自动，阈值校正因子设为12，上下限为 0–1。将区分聚集对象的方法更改为形状，其余参数保持默认设置。
      ​注：在步骤 6.1.12 中，iPSC-巨噬细胞核经过图像处理步骤（减小直径并增强核对比度）后已大致完成分割。仅选择最亮的细胞核非常重要，因为 SH-SY5Y 细胞的细胞核较暗，若不加以区分可能被误认为 iPSC-巨噬细胞。如需调整所选细胞核的比例，可增加或减少阈值校正因子。在测试阶段，将结果中的细胞核选择情况与 beacon 的相差图像进行比较，通过细胞形态可轻松区分 iPSC-巨噬细胞与 SH-SY5Y 细胞。
    13. 创建一个新模块。添加 | 图像处理 | 校正照明计算。在第一个下拉框中选择CY5作为输入图像。将输出图像命名为“IllumCY5”。对于选择照明方式，从下拉菜单中选择背景。其余参数保持默认设置。
    14. 创建一个新模块。点击添加 | 图像处理 | 应用照明校正。在第一个下拉框中选择CY5作为输入图像。将输出图像命名为“CorrCY5”。对于选择照明图像，从下拉菜单中选择IllumCY5。对于选择照明方式，从下拉菜单中选择除法。
      注：步骤 6.1.13–6.1.14 的目的是校正 CY5 图像背景光照的变化，否则会影响细胞的正确分割。
    15. 创建一个新模块。点击添加 | 对象处理 | 识别次级对象。在第一个下拉框中选择CorrCY5作为输入图像。选择Nuclei作为输入对象。将次级对象命名为“Mac”。选择识别方法为距离-B。选择阈值策略为全局，阈值方法为RidlerCalvard，平滑方法为无平滑，阈值校正因子设为1，上下限为 0–1。其余参数保持默认设置。
      ​注：此细胞分割步骤可能需要通过调整阈值校正因子来优化细胞边界的扩大或缩小。也可通过增强 iPSC-巨噬细胞的染色强度或成像时增强 CY5 滤光片组的照明来提高分割效率。
    16. 创建一个新模块。点击添加 | 图像处理 | 增强或抑制特征。在第一个下拉框中选择RFP作为输入图像。将输出图像命名为“FilteredRFP”。选择操作类型为增强，特征类型为斑点，特征大小为15像素。特征大小可进一步优化。选择速度与精度选项为快速/六边形。
    17. 创建一个新模块。点击添加 | 对象处理 | 识别初级对象。在第一个下拉框中选择FilteredRFP作为输入图像。将初级对象命名为“pHr”。输入对象的典型直径为 5–20 像素单位。选择阈值策略为手动，并手动输入阈值，例如 0.005。将区分聚集对象的方法更改为形状，其余参数保持默认设置。
      注：在步骤 6.1.17 中，SH-SY5Y 细胞经过图像处理步骤（减小斑点直径并增强对比度）后已完成分割。必须进行手动阈值设定，因为吞噬颗粒中的 pH 敏感染料强度随时间逐渐增强，若采用其他阈值策略会导致早期时间点的 pH 敏感染料斑点数量被人为高估。每次后续实验重复时，必须使用测试模式对手动阈值进行调整。
    18. 创建一个新模块。点击添加 | 对象处理 | 关联对象。从下拉菜单中选择输入子对象为pHr。从下拉菜单中选择输入父对象为Mac。对于是否计算每个父对象的所有子对象测量值的平均值？，选择是。不计算子对象与父对象之间的距离（无）。
      注：步骤 6.1.18 将 pH 敏感染料信号与 iPSC-巨噬细胞相关联，从而可测量每个 iPSC-巨噬细胞平均吞噬的颗粒数量。
    19. 创建一个新模块。点击添加 | 文件处理 | 导出至电子表格。选择列分隔符为制表符，并为文件名添加前缀以标明 beacon 编号。选择以下指定的特定测量值进行导出（见步骤 6.1.19.1 – 6.1.19.4）；其余参数保持默认设置。
      1. 图像 | 计数 | 选择pHr和Mac
      2. 图像 | 文件名
      3. 图像 | 分组
      4. Mac | 子对象 | pHr
    20. 在输出框中，点击查看输出设置。在桌面上为此实验创建一个新文件夹，并将其设为默认输出文件夹。
    21. 保存流程：文件 | 另存为项目...。
    22. 通过点击左下角的启动测试模式，在代表性图像上测试并优化流程。程序将自动选择第一张图像进行测试，通过点击眼睛图标可查看流程的每一步输出，然后点击运行。如需更改用于测试的 beacon，在顶部菜单栏点击测试 | 选择图像组。如需更改 beacon 内的图像（时间点），在顶部菜单栏点击测试 | 选择图像集。需优化的参数已在前述步骤中说明。
    23. 当对流程满意后，点击退出测试模式，并点击打开的眼睛图标将其关闭。保存流程。点击分析图像以开始完整的图像分析。
    24. 生成的文本文件可使用适当的电子表格软件打开，“Image”文件将包含每一图像时间点的一行数据，各列代表不同参数。
      ​注：Count_Mac和Count_pHr分别表示图像中 iPSC-巨噬细胞的数量和识别出的 pH 敏感对象的数量。请勿使用 Count_pHr 数据，因为该计数包含未被吞噬的微弱荧光 SH-SY5Y 细胞。列Mean_Mac_Children_pHr_Count表示单个图像（即 beacon 的单个时间点）中每个 Mac（iPSC-巨噬细胞）平均吞噬的 pHr 对象数量（步骤 6.1.18 关联对象）。
    25. 整理数据，使每个 beacon 在电子表格中为单独一列，图像按时间顺序排列为行，不同参数位于电子表格工作簿的不同工作表中。
    26. 将测量值 Mean_Mac_Children_pHr_Count 乘以 Count_Mac，得到“每图像斑点数”参数。计算每个 Beacon 的平均 Count_Mac。将“每图像斑点数”除以该 beacon 的平均 Count_Mac，得到“每细胞斑点数”参数。
      ​注：步骤 6.1.26 通过将数据归一化至每个 Beacon 所有时间点的平均 iPSC-巨噬细胞数，校正了 iPSC-巨噬细胞计数（Count_Mac）可能出现的异常波动。
    27. 为每一图像行分配自吞噬作用开始以来的时间（单位：分钟）。
    28. 计算重复孔/Beacon 的均值与标准差。以“每细胞斑点数”为纵坐标（y 轴），时间为横坐标（x 轴）作图，以可视化吞噬速率。

展示iPSC-巨噬细胞中SH-SY5Y内化的细胞分割示意图。
图2：高内涵吞噬分析中的细胞分割。 示意图用于展示靠近一个未被吞噬的SH-SY5Y细胞时，iPSC-巨噬细胞良好与不良分割的效果对比，其中另一个SH-SY5Y细胞被完全吞噬。两种细胞均以灰色显示，计算机分析所划定的iPSC-巨噬细胞边界以蓝色轮廓标出。被计为吞噬事件的SH-SY5Y细胞以绿色轮廓标出，若被排除在分析之外则以红色轮廓标出。中间图像显示分割效果较差：iPSC-巨噬细胞的边界划分不理想，将未被吞噬的SH-SY5Y细胞错误地包含在细胞边界内，导致其被误判为吞噬事件。右侧图像显示分割效果良好，这是由于采用了更严格的参数来定义iPSC-巨噬细胞的边界，从而正确地将未被吞噬的SH-SY5Y细胞排除在分析之外。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 高内涵显微镜获取的吞噬作用图像分析
    1. 登录推荐的图像处理软件（参见 材料表).
    2. 选择屏幕名称文件夹，然后从左侧菜单中选择成像运行子文件夹。单击 图像分析 图标（一个带有放大镜的屏幕）。在板布局中选择一个具有代表性的孔，用于建立分析流程。
    3. 第一个分析模块是输入图像。保留堆栈处理的默认设置（单个平面）以及平场校正（无。单击该模块右上角的 + 号以添加下一个构建模块，然后选择 寻找细胞核.
    4. 在 寻找细胞核，将通道设置为 DAPI，ROI群体作为 无，分割方法作为 C方法框包含一个下拉菜单，可选择待优化的参数，设置常见阈值（如 0.40）和面积（如 >30 µm2）。将输出群体命名为“细胞核”。通过点击“+”符号添加下一个构建模块，并选择 寻找细胞质.
    5. 在 寻找细胞质，将通道设置为 Alexa 647 以及该方法作为 B方法框包含一个下拉菜单，可优化参数，设有常用阈值（例如 0.45）和个体阈值（例如 0.20）。通过点击 + 符号添加下一个构建模块，并选择 选择群体.
      注意：必须对细胞质分割进行适当优化，以排除尚未被吞噬的相邻 SH-SY5Y 细胞，同时确保不遗漏已被吞噬的货物（参见 图2).
    6. 在 选择群体，保持默认设置，即为群体 细胞核方法 常用滤光片，蜱虫的标志 去除边界对象，输出群体命名为“Nuclei Selected”。通过点击+符号添加下一个模块，并选择 计算形态学特性.
    7. 在 计算形态学特性，将种群设置为 细胞核筛选，该区域 细胞，该方法用于 标准在下拉菜单中，确保已选择面积和圆度（µm2）。将输出群体命名为“形态学细胞”。通过点击 + 符号添加下一个构建模块，并选择 选择群体.
    8. 在 选择群体（2）, 选择种群 细胞核筛选，以及该方法 按属性筛选. 在下方的下拉框中 滤膜 F1，选择 细胞形态面积 [µm2]. 选择 > 从右侧的下拉框中选择，并输入 160 在右侧的框中。将输出群体命名为“选中的细胞核 2”。通过点击“+”符号添加下一个构建模块，并选择 寻找斑点.
      注意：此步骤将排除任何分割不当的细胞以及死亡细胞，不再进行后续分析。可能需要通过增大或减小截断尺寸来优化结果。
    9. 在 寻找斑点，选择通道 Alexa 568，ROI群体 细胞核筛选 2，ROI区域 细胞方法 B，并将输出群体命名为“斑点”。如有必要，可通过下拉菜单优化该方法，设置检测灵敏度（例如，0.20）和分割灵敏度（例如，0.400）。点击“+”符号添加下一个构建模块，并选择 计算形态学特性.
    10. 在 计算形态学特性（2），选择种群 斑点，区域 斑点，以及方法 标准在下拉菜单中，确保已选择面积和圆度（µm2）。将输出属性命名为“形态学斑点”。通过点击 + 符号添加下一个构建模块，并选择 选择群体.
    11. 在 选择群体（3），选择种群 斑点 以及该方法 按属性筛选在下拉框中 过滤器 F1，选择 斑点面积 [px2], >, 20。在下拉框中，位于 过滤器 F2选择 斑点面积 [px]2], <, 2500。在下拉框中 滤膜 F3选择 形态学斑点圆度, >, 0.6。在下拉框中，位于 滤器 F4选择 点到区域强度， >, 2.5将输出群体命名为“选中的斑点”。通过点击“+”符号添加下一个构建模块，并选择 选择群体.
      注意：自动斑点选择会分割出许多微小的荧光颗粒，这些颗粒源于iPSC-巨噬细胞内的自发荧光物质。此步骤旨在通过对斑点的面积、圆度和强度施加严格阈值，过滤掉自发荧光物质，可能需要进行一些优化。
    12. 在 选择群体（4），选择种群 细胞核筛选 2 以及该方法 按属性筛选。在下拉框中，位于 过滤器 F1，选择 斑点数量， >, 0.5. 将输出群体命名为“Spot 阳性细胞”。通过点击 + 符号添加下一个构建模块，并选择 定义结果.
    13. 在 定义结果，选择第一种方法作为 输出列表。默认设置为计算每个群体中对象的数量。单击下拉菜单以 群体：已选核 2 并确保 物体数量 已勾选，并在 应用于全部 下拉菜单选择 急性淋巴细胞白血病。对于该人群 斑点阳性细胞，确保 物体数量 已勾选。对于其他群体，无需报告任何参数。选择第二种方法作为 公式输出，然后输入公式 (a/b)*100. 选择变量 A 阳性细胞数-物体数量，变量B选择 细胞核筛选 2- 物体数量将输出命名为“阳性细胞百分比（%）”。
    14. 保存流程：点击图标 将分析结果保存至磁盘 （带向下箭头的软盘）
    15. 点击图标 批量分析 （屏幕顶部有一个漏斗和齿轮的符号）。从左侧的实验文件夹中，选择原始数据文件，这将更新所选测量值的数量 1。在 分析选项 区域，点击下拉菜单以选择 方法，并选择 现有分析. 单击“脚本文件”旁边的 … 符号，浏览并选择已保存的分析文件（后缀为 .aas）。然后，单击“开始分析”旁边的绿色箭头。可通过单击来监控分析进度 工作状态 （位于屏幕右上角）。
    16. 分析完成后，单击标签页 导出，选择实验文件夹，并选定目标文件夹。保留默认设置（导出数据但不导出TIFF图像），然后开始导出。
    17. 在适当的电子表格软件中打开下载的文件作为电子表格。孔板以行排列，参数以列排列。选择标记为“Spot Positive Cells (%)”、“Nuclei Selected 2 - Number of Spots - Mean per Well”和“Nuclei Selected 2 - Total Spot Area - Mean per Well”的列中的数据，并将这些数据分别复制到每个参数的新电子表格中。计算每种条件下重复孔的参数平均值，并进行适当的作图分析。

7. 固定 SH-SY5Y 细胞均一性的质量控制检测

  1. 从步骤2.2中收集一份活的SH-SY5Y细胞等分试样，并用annexin V-FITC染色试剂盒中的annexin结合缓冲液重悬（参见 材料表浓度约为 200,000 个细胞/mL。
  2. 从步骤2.4中取一份固定后的SH-SY5Y细胞等分试样，用annexin结合缓冲液重悬，细胞浓度约为200,000个/mL。
  3. 准备两支试管 5 µL annexin V-FITC 的 5 µL 碘化丙啶的（参见 材料清单）。加入 500 µL 将活的 SH-SY5Y 细胞加入一个离心管中， 500 µL 固定SH-SY5Y细胞的另一种方法。
  4. 准备三个对照管：其中一个包含 5 µL FITC标记的V型膜联蛋白，其中一个 5 µL 碘化丙啶，另一管留空。将活的和固定的 SH-SY5Y 细胞以 1:1 的比例混合后加入 500 µL 向每个对照管中加入等量的上述溶液。
  5. 轻轻吹打混匀各管。室温避光孵育10分钟。
  6. 立即使用流式细胞仪（激发波长 = 488 nm；发射波长 = 530 nm）检测，annexin V-FITC 信号采用 FITC 荧光检测器（通常为 FL1），碘化丙啶信号采用藻红蛋白发射信号检测器（通常为 FL2）。
  7. 使用任意流式细胞仪分析软件显示 FITC 与 PI 信号的散点图，并使用矩形门控工具选择双阴性群体。在双阴性群体中，显示 FSC 与 SSC 的散点图，并使用多边形门控工具在 FSC 和 SSC 信号极低的群体周围创建排除门，该群体被归类为碎片，因此从后续分析中排除。将剩余的事件以 FITC 与 PI 信号的散点图形式显示，并利用单染和未染色对照设置象限门，以区分 FITC−/PI−、FITC+/PI−、FITC−/PI+ 和 FITC+/PI+ 事件。
    注意：避免剧烈操作、涡旋震荡或对活的 SH-SY5Y 细胞进行长时间孵育，这些操作可能人为诱导磷脂酰丝氨酸外翻。应立即进行流式细胞术分析。理想结果是 FITC-/PI- 事件的比例 <5% 的固定 SH-SY5Y 细胞中。代表性结果如图所示 补充图 S1.

结果

采用先前所述方案进行活细胞延时成像，将野生型iPSC来源的巨噬细胞以每孔20,000个细胞的密度接种。加入不同数量的SH-SY5Y细胞（根据步骤3.1的细胞计数估算为每孔10,000–30,000个），并对部分孔预先孵育吞噬抑制剂细胞松弛素D（1小时），作为对照以抑制各SH-SY5Y细胞数量条件下的吞噬作用。在加入SH-SY5Y细胞40分钟后开始成像，随后每5分钟采集一次图像，持续3小时（数据包含初始40分钟的延迟时间）。代表性延时视频见补充数据，定量分析结果见图3。当每孔加入10,000个SH-SY5Y细胞时，每个细胞吞噬的颗粒（斑点）数量随时间呈线性增加，并被细胞松弛素D抑制约50%。细胞松弛素D的抑制效果弱于预期，最可能的原因是技术重复或生物学重复不足，因为每种条件下仅对一个孔的三个成像视野进行了成像。当每孔SH-SY5Y细胞数量更高（20,000和30,000个）时，吞噬作用的时间线性关系较差，可能是由于在更密集的视野中iPSC-巨噬细胞与SH-SY5Y细胞的分割效果不佳所致。

采用前述方案对固定细胞进行高内涵成像分析，实验中使用野生型iPSC来源的巨噬细胞（每孔20,000个细胞），并设置多种不同数量的SH-SY5Y细胞（每孔10,000–80,000个），在共孵育5小时后固定并成像。图4A展示了吞噬作用的代表性图像，分析结果见图4B17。随着SH-SY5Y细胞数量的增加，每个巨噬细胞吞噬的颗粒（斑点）数量也随之上升；然而，SH-SY5Y细胞数量加倍仅导致每个细胞的斑点数增加1.5倍，表明所测试的细胞数量并未成为吞噬作用的限速因素。随后，使用多种吞噬抑制剂对高内涵成像吞噬实验进行了验证（图4C）17。在吞噬前预孵育1小时后，肌动蛋白聚合抑制剂cytochalasin D和jasplakinolide分别显著抑制吞噬作用达91%和90%。当以cytochalasin D或jasplakinolide作为阴性对照时，该实验的稳健Z'值分别为0.7和0.820。溶酶体酸化抑制剂bafilomycin A1在吞噬前孵育1小时后，显著抑制吞噬作用达31%。溶酶体酸化抑制剂的作用弱于肌动蛋白抑制剂，提示对内吞货物的检测可能并不依赖吞噬体的完全酸化。使用重组annexin V作为对照，特异性阻断暴露在SH-SY5Y细胞表面的磷脂酰丝氨酸，从而阻止吞噬受体识别这一关键的“吃我”信号。在加入SH-SY5Y细胞前立即向孔中添加重组annexin V，可显著降低吞噬作用达30%。通过荧光标记的annexin V探针证实，固定的SH-SY5Y细胞表面暴露磷脂酰丝氨酸，而活的SH-SY5Y细胞则无annexin V染色信号（图4D）。

小胶质细胞吞噬受体 TREM2 既往已被证实对凋亡神经元的吞噬作用具有重要作用21。TREM2 的 R47H 突变是晚发性阿尔茨海默病的风险基因，据推测会降低 TREM2 与配体的结合能力23。为了评估 R47H TREM2 及 TREM2 敲除（KO）的吞噬功能，采用具有野生型（WT）/R47H/敲除型 TREM2 的同基因 iPSC 来源巨噬细胞系，进行了固定细胞高内涵吞噬实验17。通过分步添加吞噬底物（40,000 个 SH-SY5Y 细胞），测试了从 1 到 5 小时不等的多种吞噬持续时间。结果显示，信号在 4 小时内呈线性增加，5 小时时略有平台期（图 5）17。与野生型相比，TREM2 敲除细胞的吞噬速率和能力（斑点阳性细胞百分比）明显降低，而 R47H TREM2 突变体未表现出吞噬功能的改变。TREM2 敲除细胞中的吞噬缺陷并未在 R47H TREM2 突变中重现，这似乎是因为 TREM2 的功能仍足以维持正常的吞噬作用。

荧光显微镜图，Phrodo 斑点数随时间变化，SH-SY5Y 细胞；细胞松弛素 D 的影响
图 3：活细胞时间延时吞噬作用检测的示例数据。 野生型 iPSC 巨噬细胞 BIONi010-C（ECACC 编号：66540023）对死亡 SH-SY5Y 细胞的摄取，以每 5 分钟一次的频率成像，持续 3 小时。图中显示的时间从吞噬作用开始时计算，包括最初未进行测量的 40 分钟。数据点表示三个重复孔中每个细胞的平均斑点数。使用 10 µM 细胞松弛素 D 预处理 1 小时可抑制对 10,000 个 SH-SY5Y 细胞的吞噬作用；而当 SH-SY5Y 细胞数量较高（20,000 和 30,000）时，吞噬作用的定量结果次优。数据表示为均值 ± 标准差（SD），N = 1 次实验。 请点击此处查看该图的放大版本。

细胞成像与孢子计数图：SH-SY5Y细胞的显微镜图像与数据分析。
图 4：固定细胞高内涵吞噬实验的优化与验证。（A）野生型iPSC巨噬细胞BIONi010-C（ECACC编号：66540023）吞噬SH-SY5Y细胞的代表性高内涵显微图像。显示的是加入40,000个SH-SY5Y细胞后3小时的时间点。荧光通道已合并，其中iPSC巨噬细胞染色呈红色，细胞核呈蓝色，SH-SY5Y细胞呈黄色。插图是原图像放大3倍的局部区域。（B）在不同数量的货物添加条件下，野生型iPSC巨噬细胞在5小时内每细胞吞噬的死亡SH-SY5Y细胞斑点数。数据为N = 3次独立收获的均值 ± 标准误（SEM）。（C）使用10 µM 细胞松弛素D（Cyt）、1 µM 巴佛洛霉素A1（Baf）、1 µM 茉丝柯林肽（预处理1小时；Jas）以及13 µg/mL重组膜联蛋白V（与死亡SH-SY5Y细胞同时加入；Ann）处理后，吞噬作用（3小时）受到抑制。未加入SH-SY5Y细胞的iPSC巨噬细胞作为阴性对照（-ve），未处理的iPSC巨噬细胞加入SH-SY5Y细胞作为阳性对照（+ve）。数据已归一化至该实验重复的平均值。数据为N = 3–6次独立收获的结果，使用两种野生型细胞系（SFC840-03-03，该细胞系的表征见Fernandes等21，以及BIONi010-C）。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Dunnett事后检验，与未处理组进行比较。*p < 0.05，***p < 0.001。（D）新固定的SH-SY5Y细胞对磷脂酰丝氨酸暴露（膜联蛋白V-FITC）呈均匀染色，且细胞通透性有限（碘化丙啶染色）。活的SH-SY5Y细胞不被膜联蛋白V-FITC或碘化丙啶染色，仅在培养中少量死亡细胞上可见局部染色。本图经Alzheimer's Research & Therapy17许可转载。请点击此处查看该图的高清版本。

吞噬作用分析图；TREM2 变异体的实验数据；随时间变化的细胞斑点指标。
图 5：在 TREM2 敲除的 iPSC-巨噬细胞中吞噬作用降低，但在 R47H TREM2 iPSC-巨噬细胞中未降低。使用每孔 40,000 个 SH-SY5Y 细胞进行高内涵吞噬作用检测，并采用分步加样方式。对以下参数取平均值：每个细胞的斑点数量、每个细胞的斑点总面积（µm2）以及每视野含吞噬颗粒细胞的百分比。数据经标准化处理，以每种基因型在各实验中的平均值为基准。结果以均值 ± 标准误（SEM）表示，N = 3 次收获样本。采用重复测量双因素方差分析（ANOVA），Dunnett 事后检验，各时间点与野生型（WT）进行两两比较：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。该图经《阿尔茨海默病研究与治疗》（Alzheimer's Research & Therapy）17 许可复制。 请点击此处查看此图的放大版本。

补充图 S1：SH-SY5Y 细胞制备的示例质量控制。 分离的 SH-SY5Y 细胞分别用 0%（活细胞）、1% 和 2% 多聚甲醛（PFA）固定 10 分钟，随后进行洗涤。细胞经 annexin V-FITC 和碘化丙啶（PI）染色后立即进行流式细胞术检测。使用单染和未染色对照样本，在流式细胞分析软件中绘制密度图并设置象限门控。各象限中标注了位于该象限内的事件百分比。活细胞主要位于 Q4 象限，固定后的细胞主要位于 Q2 象限。Q1 = annexin V-/PI-，Q2 = annexin V+/PI+，Q3 = annexin V+/PI-，Q4 = annexin V-/PI-（活细胞）。请点击此处下载该文件。

补充视频：活细胞延时吞噬作用。 野生型iPSC-巨噬细胞BIONi010-C（ECACC编号：66540023）吞噬SH-SY5Y细胞的代表性延时视频。图像每5分钟采集一次，持续3小时。视频经过裁剪，以每秒3帧播放，展示实验最后1.5小时的过程。经酸敏感染料染色的SH-SY5Y细胞显示为红色，其信号强度随吞噬体酸化而增强。细胞核经Hoechst 33342染色后显示为蓝色。请点击此处下载该视频。

讨论

小胶质细胞具有多种重要功能，影响神经退行性疾病的起始与进展，包括对凋亡神经元的吞噬作用。小胶质细胞吞噬功能受损以及对突触的异常吞噬均与神经退行性疾病相关，但其潜在机制及因果关系尚不明确。4,23本文介绍了一种用于检测iPSC来源的巨噬细胞（iPSC-巨噬细胞）对凋亡细胞吞噬作用的吞噬功能检测方法，该方法可采用活细胞延时成像、固定细胞高内涵显微镜检测，或在同一实验中结合两种读出方式。这种灵活性使得该检测既可用于在少量孔中随时间追踪单个吞噬事件，也可用于包含多种条件或处理的高内涵筛选。由于高内涵检测是在单一时间点进行固定检测，因此可同时制备多个检测板。该高内涵检测方法在表征携带疾病相关遗传变异的巨噬细胞/小胶质细胞，或筛选影响吞噬功能的小分子抑制剂方面具有潜在应用价值。该检测方法亦可轻松适配于其他小胶质细胞模型，甚至可能用于星形胶质细胞的吞噬研究。此外，该吞噬检测可与活细胞成像染料进行多重联用，例如线粒体、钙离子或活性氧（ROS）指示剂；并在固定后进行目的蛋白的免疫荧光染色。相较于现有使用凋亡神经元细胞的吞噬检测方法，本方案的主要优势在于吞噬底物的制备过程相对简便快速，且可获得均一的产物。其他方法通常需使用S-亚硝基-L-半胱氨酸处理神经元或SH-SY5Y细胞2小时以诱导凋亡25，冈田酸处理3小时22，4-16 小时佛波酯（staurosporine）处理26,27,28,29 或紫外线照射24小时30，可能导致细胞处于凋亡的不同阶段。据作者所知，此前尚未有研究描述活细胞成像和高内涵成像的检测结果。使用多聚甲醛固定制备吞噬性货物的主要局限在于，其无法完全模拟凋亡过程，因为固定会阻止细胞裂解为凋亡小体，而体积更小的凋亡小体更可能被快速吞噬。目前尚不清楚固定对核苷酸分泌的影响如何。 "找到我" 信号（如ATP、UDP），这些信号可吸引吞噬细胞。与凋亡细胞类似，固定的SH-SY5Y细胞对碘化丙啶表现出一定的膜通透性。膜通透性与信号分子的释放相关 "找到我" 信号；然而，这一现象在固定的 SH-SY5Y 细胞中尚未被研究，且如果核苷酸释放过快，在 SH-SY5Y 细胞添加至 iPSC 来源的巨噬细胞之前，就可能已被洗脱。

该实验方案的第一步关键操作是使用对pH敏感的红色荧光染料的STP酯对死亡的SH-SY5Y细胞进行染色。该染料可快速且共价地与死亡SH-SY5Y细胞表面的游离伯胺基团发生反应。染色时间无需优化；但在标记前处理染料时需格外小心。标记反应不得在含有游离胺的缓冲液中进行。此外，若将DMSO储存液稀释至低温水相缓冲液中或终浓度较高时，存在沉淀风险。沉淀物在显微镜下会呈现为致密的暗色颗粒。另外，该pH敏感性染料溶液易吸附于普通塑料离心管管壁，且难以彻底洗脱；因此，建议在标记步骤中使用低吸附性离心管。使用pH敏感性染料而非永久性荧光染料，有助于区分被吞噬的颗粒与邻近细胞质膜的颗粒。由于该染料在中性pH下仍具有一定的荧光信号，因此需将吞噬性货物颗粒与iPSC来源巨噬细胞的密度控制在足够低的水平，以实现准确的图像分割，同时又需保持足够数量以捕获大量吞噬事件。高内涵显微成像技术可在孔内货物颗粒中等密度（每iPSC来源巨噬细胞对应超过2个SH-SY5Y细胞）条件下准确识别吞噬作用。相反，由于显微镜在远红光谱范围内的灵敏度较低，在活细胞延时成像数据中对iPSC来源巨噬细胞的分割置信度较低，因此必须使用极低的货物密度以降低假阳性结果的发生概率（每两个iPSC来源巨噬细胞对应1个SH-SY5Y细胞）。应通过比较未处理组与细胞松弛素D处理组的实验结果，验证图像分割的准确性及货物密度的适宜性。在优化良好的实验体系中，细胞松弛素D处理应使每个细胞的平均荧光斑点数较未处理样本减少90%。

该实验方案中的另一个关键步骤是iPSC来源的巨噬细胞染色，这一步可使细胞在图像分析中被识别和分割，从而在计数时排除任何外部的SH-SY5Y细胞。推荐使用的染料具有细胞膜通透性，可在细胞质内转化为不溶性荧光产物，且可固定、无毒性（参见材料表）。该染色步骤已针对iPSC来源的巨噬细胞与高内涵成像吞噬实验的联用进行了优化，若使用其他细胞类型，建议重新进行优化。可延长细胞染色时间以增强不溶性荧光产物在细胞内的沉积。若对染料浓度进行优化，需注意避免有机溶剂载体达到毒性水平。

实验成功的第三个关键因素是数据分析。所提供的分析流程旨在提供指导而非强制规定，因为染色强度或细胞形态的差异可能降低现有流程在分割效果上的有效性。因此，需要进行一些优化，应使用适当的阳性和阴性对照对流程进行测试，且方案文本中已指明应优化的参数。阴性对照应包括一种条件：在加入SH-SY5Y细胞前，先用强效的吞噬抑制剂（如细胞松弛素D）预处理iPSC来源的巨噬细胞。另一个可能的阴性对照是在实验结束前10分钟，即固定前，将SH-SY5Y细胞加入未经处理的iPSC巨噬细胞孔中，该条件允许货物发生一定程度的沉降，但时间不足以产生可检测量的吞噬作用。吞噬事件被定义为位于iPSC巨噬细胞边界内的红色荧光物体，该边界由软件算法通过深红色荧光通道确定。如果细胞分割效果不佳（图2），则许多未被吞噬但靠近iPSC巨噬细胞的SH-SY5Y细胞可能会被错误地纳入分析，即产生假阳性结果。实现良好分割的最重要因素是对iPSC巨噬细胞进行严格清晰的界定。两种分析的分割均为自动完成，因此无法对每个细胞都实现完美分割；然而，可以参考少量测试图像，调整若干参数以使分割更趋优化。细胞松弛素D对照对于评估最佳分割至关重要，因为在该条件下若检测到大量吞噬事件，则表明分割效果不理想。理想情况下，应反复优化数据分析流程，直至在细胞松弛素D处理条件下，每细胞的吞噬事件数量比无抑制剂条件低80%-90%。

吞噬作用检测实验中最可能出现的问题包括：（1）阳性对照中pH敏感性荧光信号较弱，（2）实验结束时巨噬细胞分布稀疏或不均匀，或（3）分析过程中将未被吞噬的SH-SY5Y细胞误判为阳性，导致假阳性数量偏高。针对pH敏感性荧光信号弱的问题，首先应检查SH-SY5Y细胞染色后形成的细胞沉淀是否呈现明显的紫红色。若颜色较浅，需确保使用新鲜的染料储备液，确认标记缓冲液不含胺类物质，在染色前对SH-SY5Y细胞额外进行一次洗涤，核对染色的SH-SY5Y细胞数量是否正确，确认无染料沉淀产生，并优化染料的标记浓度。若SH-SY5Y细胞染色充分，则需检查加入实验板中的细胞浓度是否正确，并确保iPSC来源的巨噬细胞状态良好且未过度老化。第二类问题即巨噬细胞分布不均，可能源于移液过程中细胞丢失，因此应采取措施减少细胞所受的移液剪切力，避免使用孔径过小的吸头。若问题仍然存在，可缩短iPSC巨噬细胞负载细胞通透性染料的孵育时间。第三类问题涉及将未被吞噬的颗粒错误纳入分析，表明分析流程尚需进一步优化。故障排查应首先聚焦于细胞分割效果，以及软件是否将邻近物体错误纳入分析。相关步骤下方的注释中已建议可调整的具体参数（活细胞延时成像分析参见步骤6.1.11–6.1.15，高内涵分析参见步骤6.2.4–6.2.8）。若细胞分割效果无法进一步改善，高内涵分析中设有额外步骤（步骤6.2.8），可排除分割异常的iPSC巨噬细胞。此外，还可优化在iPSC巨噬细胞内筛选pH敏感性荧光信号点的模块，提高可接受对象的荧光强度阈值，有助于排除未被吞噬的SH-SY5Y细胞（活细胞延时成像分析参见步骤6.1.17，高内涵分析参见步骤6.2.11）。

我们为吞噬作用检测开发了两种类型的显微镜读出方法，每种方法均有其优势与局限性。活细胞延时成像的优点在于能够提供有关吞噬动力学的额外信息，且相较于高内涵成像平台，其设备更为普及。推荐使用的开源软件不依赖于显微镜品牌，可与任何高质量的荧光显微镜配合使用，无论是否具备活细胞延时成像功能。活细胞成像的主要局限在于其灵敏度和光学性能有限，这使得对iPSC来源的巨噬细胞（iPSC-macrophages）进行准确检测和良好分割更具挑战性。该局限可通过延长iPSC-巨噬细胞染色时间，或在条件允许时更换为更灵敏的显微镜予以缓解。若具备高内涵成像系统，建议采用高内涵成像吞噬检测作为首选读出方式。高内涵成像系统可实现更高的通量和更可靠的数据，因而适用于筛选实验，预期可获得≥0.7的稳健Z'值。 "每细胞斑点数" 输出20与活细胞延时成像方法相比，高内涵显微成像检测具有更高的灵敏度、更高程度的自动化与检测速度，可处理更多孔板和成像视野，并能生成高分辨率的共聚焦图像。高质量图像有助于更有效的细胞分割，且高内涵成像分析软件提供了更多适用于形态高度不规则细胞的分割方法，进一步辅助分割过程。此外，相较于开源软件，高内涵成像分析软件可计算更多吞噬作用相关参数，例如吞噬细胞的百分比。高内涵吞噬检测的主要局限性在于成像系统及分析软件的成本较高且不易获得。

综上所述，本文介绍的定量吞噬作用检测方法是一种用于体外模拟小胶质细胞吞噬死亡神经元的有用工具。该体系使用诱导性多能干细胞来源的巨噬细胞（iPSC-巨噬细胞）模拟小胶质细胞，使用多聚甲醛固定的SH-SY5Y细胞模拟死亡神经元。尽管这些模型并非目前已发表的最接近真实的小胶质细胞或死亡/凋亡神经元模型，但其制备简便且可扩展。该检测方法本身具有高度灵活性，文中详细描述了两种成像读出方式，并具备适应于不同小胶质细胞/巨噬细胞单培养模型，或更换其他类型细胞作为吞噬靶标的潜力。高内涵成像读出方式有利于获取定量数据，且可扩展用于筛选小分子吞噬调节剂，或检测iPSC-巨噬细胞中的遗传变异。然而，由于高内涵成像系统成本较高且产生大量数据，本方案中还提供了另一种替代性成像读出方式，即使用活细胞延时显微镜，必要时也可替换为任何高质量的传统荧光显微镜。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢 Val Millar 博士和 Sohaib Nizami 博士在高内涵显微镜技术方面的协助，以及 Daniel Ebner 博士提供的高内涵显微镜使用权限。此外，作者感谢 Emma Mead 博士在检测方法开发方面的建议，以及 Cathy Browne 女士在诱导多能干细胞方面的支持。本研究由阿尔茨海默病研究英国牛津药物发现研究所（ARUK ODDI，资助编号 ARUK-2020DDI-OX）资助，牛津詹姆斯·马丁干细胞研究中心（S.A.C.）还获得了牛津马丁学社（LC0910-004）、帕金森病英国基金会纪念碑信托发现奖（J-1403）、英国医学研究理事会痴呆症研究平台干细胞网络设备基金（MC_EX_MR/N50192X/1）、合作项目 MR/N013255/1 和 Momentum MC_PC_16034 奖项的额外支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
15 mL 圆锥形离心管Falcon352096用于细胞离心
2-20 µL，20-200 µL，100-1000 µL单通道微量移液器
2-巯基乙醇 50 mMGibco31350010工厂培养基组分
PBS 中的 4% 多聚甲醛Alfa AesarJ61899用于细胞固定
6孔板，组织培养处理
AggreWell-800 24孔板STEMCELL Technologies34815用于拟胚体形成的微孔低黏附24孔板
Annexin V-FITC 凋亡染色/检测试剂盒Abcamab14085用于固定后 SH-SY5Y 细胞质量控制检测的 annexin V-FITC 染色试剂盒。试剂盒包含 annexin 结合缓冲液、annexin V-FITC 和碘化丙啶。
自动细胞计数器
台式离心机
台式微量离心机
CellCarrier-96 超微孔板，组织培养处理，黑色，96 孔，带盖Perkin Elmer6055302用于吞噬作用检测的96孔组织培养（TC）处理微孔板，孔壁为黑色，孔底光学透明
CellProfiler 软件用于分析活细胞延时显微镜获取的吞噬作用图像的开源软件。可从网站（http://cellprofiler.org/）免费下载，本方案使用版本 2.2.0。
CellTracker Deep Red 染料赛默飞世尔科技C34565深红色荧光、可穿透细胞、可与琥珀酰亚胺酯反应的染料，用于染色iPS来源的巨噬细胞胞质。将CellTracker Deep Red染料溶于DMSO中，配制成2 mM（1.4 mg/mL）溶液。使用浓度为1 μM，通过用巨噬细胞培养基稀释DMSO储备液制备。 
II级层流空气安全柜
CO2 气瓶EVOS FL Auto 附件
CO2 37℃培养箱°C 和 5% CO₂2
哥伦布图像数据存储与分析系统Perkin Elmer哥伦布Opera Phenix 数据存储与分析平台。支持所有主流高内涵筛选仪器。
细胞松弛素DCayman11330吞噬作用检测的阴性对照处理。用DMSO重悬至10 mM，分装后于-20℃保存°C，避免反复冻融。使用时浓度为10 µM.
DMEM/F12Gibco11320074SH-SY5Y 培养基组分
DMSOSigmaD8418细胞追踪剂和 pHrodo 染料的溶剂
EVOS FL Auto 成像系统赛默飞世尔科技AMF4300活细胞延时成像显微镜
EVOS Light Cube CY5赛默飞世尔科技AMEP4656EVOS FL Auto 附件
EVOS Light Cube DAPI赛默飞世尔科技AMEP4650EVOS FL Auto 附件
EVOS Light Cube RFP赛默飞世尔科技AMEP4652EVOS FL Auto 附件
EVOS Onstage 培养箱赛默飞世尔科技AMC1000EVOS FL Auto 附件
胎牛血清SigmaF4135SH-SY5Y 培养基组分
流式细胞仪
流式细胞术分析软件
Geltrex LDEV-Free、hESC认证、低生长因子基底膜基质InvitrogenA1413302适用于iPSC培养的hESC认证基底膜基质
GlutaMAX 补充剂Gibco35050-038工厂培养基和巨噬细胞培养基的共同组分
HBSSLonzaBE 10-547F汉克’用于洗涤步骤的平衡盐溶液
人重组BMP4GibcoPHC9534胚胎体培养基组分
人重组IL-3GibcoPHC0033工厂培养基和巨噬细胞培养基的共同组分
人重组 SCFMiltenyi Biotech130-096-695胚胎样小体培养基组分
人重组VEGFGibcoPHC9394胚胎样小体培养基组分
活细胞成像溶液赛默飞世尔科技A14291DJ用于标记死亡 SH-SY5Y 细胞的酚红-free HEPES 缓冲培养基
低蛋白吸附 2 mL 管Eppendorf30108.132用于染色SH-SY5Y细胞
M-CSF赛默飞世尔科技PHC9501工厂细胞和巨噬细胞培养基的共同组分
mTeSR1 培养基STEMCELL Technologies85850iPSC 培养基
多通道 20-200 μL 移液器用于96孔板的液体处理
NucBlue Live ReadyProbes 试剂赛默飞世尔科技R37605Hoechst 33342 滴瓶制剂，用于iPS来源巨噬细胞的细胞核染色，每毫升巨噬细胞培养基中加入0.5滴。
Opera Phenix 高内涵筛选系统Perkin ElmerHH14000000高内涵成像显微镜，配合 Harmony 软件 4.9 版使用。
青霉素-链霉素Gibco15140-122工厂、巨噬细胞和SH-SY5Y培养基的组分
pHrodo iFL Red STP-酯赛默飞世尔科技P36011pH敏感性红色荧光染料，用于标记死亡的SH-SY5Y细胞。将pHrodo iFL Red STP酯粉末用DMSO重悬至5 mg/mL浓度。每100万个SH-SY5Y细胞加入2.5 μL（12.5 μ将 pHrodo iFL Red STP 酯储备液加入悬浮于预热的活细胞成像溶液中的细胞中。 
血清移液管吸液器
T175 培养瓶，组织培养处理用于iPSC-巨噬细胞前体分化的容器，称为 "工厂"
T75 培养瓶SH-SY5Y细胞培养容器
透明板封膜机Greiner Bio-One676001用于检测板的储存与运输
TrypLE Express (1X)，无酚红Gibco12604013含重组类胰蛋白酶和1.1 mM EDTA的细胞解离缓冲液，直接使用。
37℃水浴锅°C
含L-谷氨酰胺、庆大霉素和酚红的X-VIVO 15培养基LonzaBE04-418F工厂细胞与巨噬细胞培养基组分
X-VIVO 15 培养基（含 L-谷氨酰胺；不含庆大霉素和酚红）Lonza04-744Q无酚红巨噬细胞培养基，用于无添加剂或生长因子条件下的吞噬作用实验

参考文献

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诱导多能干细胞来源巨噬细胞吞噬死亡神经母细胞瘤细胞的体外定量成像分析
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