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基于片段的先导化合物发现中用于筛选的纳米差示扫描荧光法

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DOI：

10.3791/62469

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2021年5月16日

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1Oncode Institute and Division of Biochemistry, the Netherlands Cancer Institute, 2Institute for Organic Chemistry and Chemical Biology, Center for Biomolecular Magnetic Resonance (BMRZ), Johann Wolfgang Goethe-University

本文内容

摘要

监测目标蛋白熔解温度的变化即热移位分析（thermal shift assay, TSA）是一种用于筛选包含数百种化合物的片段库的高效方法。本文介绍了一种采用机器人辅助纳米微分扫描荧光法（nano-DSF）的TSA实验方案，通过监测内在色氨酸荧光和光背向散射进行片段筛选。

摘要

热 shift 测定（TSAs）用于研究靶蛋白的熔解温度（Tm）如何随其环境变化（例如，缓冲液组成）而改变。多年来，TSA 特别是纳米差示扫描荧光法（nano-DSF）的应用价值已得到广泛认可，既可用于寻找有助于稳定特定蛋白的条件，也可通过监测表观 Tm 的变化来研究配体结合。本文介绍了一种利用 nano-DSF 高效筛选 Diamond-SGC-iNEXT 预备片段库（DSi-Poised，共 768 种化合物）的方法，通过监测 Tm 变化识别潜在的片段结合。文中简要概述了开展 nano-DSF 实验对蛋白质量和浓度的基本要求，随后提供了详细的分步操作流程，该流程使用结构生物学实验室常用的纳升级机器人移液器，在 96 孔板中制备所需样品。本方案还描述了如何将试剂混合物转移至 nano-DSF 测量所需的毛细管中。此外，本文提供了测量热变性（监测内在色氨酸荧光）和聚集（监测光背向散射）的实验步骤，以及后续的数据传输与分析流程。最后，通过三个不同蛋白靶标的筛选实验，展示了该方法在先导化合物发现项目中的实际应用。所述方法的基本原理可轻松推广至其他片段库，或适配于其他仪器平台。

引言

药物发现项目通常始于筛选化学化合物与药物靶点（最常见的是蛋白质）相互作用和/或调节其功能的能力。此类筛选中发现的所谓“"苗头化合物"，构成了发现新型先导化合物和候选药物的基础，也是当今大多数新药获得许可的前提。因此，必须具备高通量方法，以便利用大量不同的化合物快速筛选海量的潜在靶点，从而迅速识别出与靶点紧密结合的化合物或能够调节靶点特定功能的化合物。在确定苗头化合物后，最具前景的苗头化合物-靶点组合将进入广泛的药物开发流程，借助其他通常成本较高且耗时较长的技术，进一步阐明“"构效关系"（SAR）。

结构生物学方法（例如由欧盟资助的“用于转化研究的核磁共振、电镜和X射线基础设施"（iNEXT）及其当前的后续项目 iNEXT-Discovery所提供的技术）常被用于深入研究大量化合物的相互作用，同时通过多轮合成化学优化初始苗头化合物的亲和力和药理学性质1。这些“从苗头到先导”"（hit to lead）"研究项目中产生的先导化合物将作为候选分子进入临床前研究阶段。目前成熟的分子筛选方法大致可分为两类：基于配体的先导化合物发现（LBLD）和基于片段的先导化合物发现（FBLD）。在LBLD研究中，蛋白受体通常使用数千种人工筛选的配体（基于天然配体结构或靶标结构）进行筛选，或使用包含数万种化合物的类药配体库进行筛选，后者可覆盖较大范围的化学空间。

通常，化合物的抑制活性通过活性测定实验进行检测，一般监测其酶学功能。然而，在基于片段的药物发现（FBLD）研究中2,3,4,5，会测试数百个通常比药物分子更小（100–200 道尔顿）的化合物，直接检测它们与靶标的结合能力，而无需依赖活性测定实验。这种结合可能干扰靶标的功能，并可通过多种生物物理方法直接检测片段与靶标结合的能力，或通过X射线晶体学6和核磁共振波谱学7等结构生物学方法进行检测，近年来也包括冷冻电子显微镜技术。当片段结合在蛋白质上彼此邻近的不同位点时，可将这些通常亲和力较低的结合片段通过合理的化学组合，合并为少量先导化合物，以便进一步深入研究。这种方法通常可获得亲和力更高、活性更强的化合物，且该策略已开始产生具有临床潜力的重要分子。如何选择一个能够高效利用化学基团的"理想"片段库，多年来一直是研究的热点领域8,9,10。

尽管最初的重点是覆盖完整的化学空间，但后续的关注点转向了如何将片段筛选命中物进行下游化学组合，以生成先导化合物。此类研究已催生了所谓的 "准备就绪" 文库，其中包含至少带有一个官能团的片段，可实现快速且低成本的后续合成化学修饰，从而高效推进构效关系（SAR）研究。iNEXT推动的活动之一是更新由Diamond Light Source和结构基因组联盟研究人员开发的预设文库。这一合作成果最终形成了DSi-Poised文库11，该方法在iNEXT中也已得到验证12随后，该文库与Enamine Ltd.的REAL数据库中的化合物可及性进行了匹配。Enamine Ltd.是一家化学研究机构，也是用于筛选的大规模构建单元和化合物文库的生产商。DSi-Poised目前可向公众销售，同时也可在多个iNEXT-Discovery合作实验室中用于支持片段筛选项目。

高端的X射线晶体学和核磁共振（NMR）结构生物学技术在基于片段的药物发现（FBLD）中各有优缺点。这两种方法都需要分离的目标样品，并能提供FBLD所需的高分辨率原子级细节。然而，X射线晶体学需要获得晶体，而片段通常结合在蛋白质有序区域中的空腔内，这些区域不参与三维晶格结构的形成。溶液态NMR通常能发现与X射线晶体学不同的结合片段，因为它不受晶体环境的影响，且能够有效检测部分有序蛋白质区域中的结合事件。然而，尽管基于配体的NMR实验相对快速，仍需要耗费较多的时间和样品量，通常仅适用于相对较小的蛋白质靶标或结构域。为了优先筛选适合进行晶体学或NMR实验的化合物，已采用多种生物物理方法13,14,15。

随着近期仪器设备和计算方法的进步，基于X射线晶体学的片段筛选（FBLD）能够高效地测定约1000个片段的结构并进行分析，因此在X射线相关研究中，预先筛选的重要性已有所降低。然而对于核磁共振（NMR）技术而言，仍希望采用成本更低、速度更快的实验方法对化合物库进行优先排序，以节省在高端仪器上的使用时间。同时，结合本质上不同的技术手段可为结合事件提供独立验证，甚至发现仅使用晶体学或NMR方法所遗漏的额外阳性片段。晶体学和NMR技术均需要昂贵的设备，通常只能在外部专业设施中、在本地高技能专家的协助下完成。此外，结果的准确分析也要求高水平的专业知识。尽管诸如iNEXT和iNEXT-Discovery等项目正在推动这些设施的普及化16，但人们已认识到，采用其他方法进行低成本、快速且高通量的FBLD筛选，可促使更广泛的实验室开展药物筛选项目。此类结果可作为依据，用于与药物化学家建立合作，并在NMR和晶体学设施对可筛选化合物数量有限制的情况下，优先将最昂贵的筛选实验用于最有前景的化合物。

TSA 是一种快速、高效且相对廉价易得的生物物理方法17，可用于基于片段的药物筛选（FBLD）。该方法已应用于多种场景，从辅助确定蛋白质结晶实验的稳定条件18，到发现与细胞内特定靶点结合的化合物19。TSA 还可用于测定配体与靶蛋白结合的解离常数，因为配体的结合通常会引起蛋白质热稳定性的改变。在所有 TSA 实验中，均通过缓慢升高温度，测量蛋白质变性温度（即其稳定性）的变化。一种有效监测加热过程中蛋白质变性的方法是差示扫描荧光法（DSF）或 Thermofluor 法，该方法通过定量检测疏水性染料（通常为 Sypro Orange）在与因温度升高而展开的蛋白质暴露出的疏水区域相互作用时产生的荧光淬灭来实现。

纳米级差示扫描荧光法（nano-DSF）通常指在无需外源性染料的情况下测定蛋白质的热稳定性。最早提供该功能的仪器之一是OPTIM1000，该仪器可测量样品的宽谱光强度以及光散射情况。该设备能够同时检测蛋白质去折叠（通常通过色氨酸荧光进行监测）和蛋白质聚集（由于形成的纳米颗粒导致在约400 nm处光散射增加）。随后，Prometheus仪器引入了背向反射技术用于检测聚集，并实现了荧光信号的高灵敏度检测，从而可在较高灵敏度下对低浓度蛋白质进行筛选20。下文将描述如何使用Prometheus开展片段筛选实验，以发现针对不同蛋白质靶标的阳性结合分子。内容首先简要介绍对蛋白质质量和数量的预期要求，随后提供片段筛选实验的详细操作步骤，涵盖样品准备、实验实施及数据分析。作为iNEXT-Discovery合作项目的一部分，文中展示了三种蛋白质的筛选结果作为示例数据。

方案

注意：纳米差示扫描荧光法（nano-DSF） 实验中所用的蛋白质应具有高纯度（>95%）且均一，可通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行评估。在开展片段筛选之前，应测定蛋白质在不同缓冲体系中的稳定性。应选用离子强度低、盐浓度低且对蛋白质干扰最小的缓冲液，以避免影响蛋白质与片段之间的直接相互作用。本方案中用于检测稳定性的常用缓冲液见补充表S1。本实验所需的蛋白质储备溶液浓度通常为0.2 mg mL-1。若要对整个DSi-Poised文库（768种化合物）进行筛选，总共需要约12 mL该浓度的蛋白溶液，即约2.5 mg蛋白总量。本实验所用的DSi-Poised文库以96孔板形式提供（图1）。片段化合物的浓度已调整为20%（v/v）二甲基亚砜（DMSO）中的100 mM。需注意，此处描述的混样方案最终产生的DMSO终浓度较低，为0.4%（v/v）；尽管该浓度极不可能影响蛋白质稳定性，但仍建议针对每一种新蛋白质验证DMSO的影响。

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图1：本实验所用培养板的类型。 （A）U型底培养板。（B）96孔板。（C）96孔板的局部放大图，显示亚孔1。请点击此处查看该图的放大版本。

1. 培养板制备

  1. 从 -20 °C/-80 °C 冰箱中取出一片片段板，在室温下于台式摇床上轻轻振荡使其解冻。以 500 × g 离心 30 秒，以收集附着在孔壁上的液滴。
    注意：由于片段文库溶于 DMSO-d6（熔点为 19 °C），必须确保每种化合物完全解冻并充分溶解。
  2. 取一个 MRC 2 孔结晶板（图 1A），向每个子孔中加入 14.7 µL 蛋白质储备溶液。为提高操作效率，将蛋白质溶液置于试剂储液槽中（材料表），并使用多通道移液器进行加样（图 2A、B）。
    ​注意：对于 DSi-Poised 文库，根据其格式不同，并非 96 孔板的所有孔都含有化合物。通常情况下，A 行、H 行以及第 1 列、第 12 列中填充的是 DMSO。因此，在下一步操作结束后，这些孔中将不含有任何片段，仅会由机器人转移入 DMSO，故 A 行、H 行以及第 1 列、第 12 列无需加入蛋白质溶液。请注意，不同板中的空白行和列可能有所不同。

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图2： 片段筛选流程示意图。（A）使用多通道移液器和试剂储液槽分配蛋白溶液。（B）在96孔板中分配蛋白溶液。（C）由分配机器人进行片段化合物的分配。（D）将蛋白溶液装入毛细管中。（E）显示毛细管支架的抽屉。（F）毛细管支架的特写视图。请点击此处查看该图的放大版本。

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图3：本实验所用设备的概览。（A）用于片段分配的纳升级分液机器人，图中标示了板位位置。（B）用于定义新板的程序界面。（C）分液程序的界面。（D）用于分配片段的分液程序。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 通过 Mosquito 机器人进行片段纳米分配

  1. 检查片段所提供的板类型（材料表）。
  2. 在Mosquito系统上检查片段和蛋白质板的定义。
    1. 开启纳米分配仪（图3A），确保移动部件周围无障碍物。
    2. 打开图形用户界面，点击设置选项卡，在甲板配置下，检查提供化合物的板类型以及第1步中已转移蛋白质的板类型是否已存在于可用板列表中。若不存在，请点击选项|板，通过填写正确的属性类型值来创建新的板定义（图3B）。
      注意：本实验所用MRC 2孔板和96孔板的相关参数值分别见补充表S2和补充表S3。
  3. 分配程序
    1. 在设置选项卡下，于甲板配置中指定板的位置。
      注意：本实验所用的Mosquito系统在甲板上有两个板位。位置1定义为源板，位置2为目标板。
    2. 使用下拉菜单，为位置1选择Greiner U底板，为位置2选择MRC 2-孔板（图2C），保存该实验方案。
  4. 片段分配
    1. 将片段板放置于甲板的位置1，将蛋白质板放置于位置2（图3A）。
    2. 在实验方案选项卡（图3D）中，点击文件，选择第2.3节中保存的用于片段分配的实验方案。设定待分配片段的体积，使用0.3 µL。对于典型的板，若第1列和第12列不含片段，则将起始位置设为第2列，结束位置设为第11列。若某些板中第2列或第11列为空白，则分别使用第3列和第10列作为起始和结束值。
      注意：由于Mosquito系统的设置，只能跳过列而不能跳过行；对于未含片段的行，系统将分配DMSO。请确保换枪头选项设置为始终更换，以避免片段库发生交叉污染。
    3. 点击运行以启动程序。分配过程约需2分钟，完成后从机器人上取下蛋白质板和片段板，并用压敏密封膜重新密封。在进行下一步之前，短暂离心蛋白质板（500 × g，30秒），以收集附着在孔壁上的液滴。

3. 纳米差示扫描荧光法（nano-DSF）的测定

注意：关于使用 Prometheus NT.48 进行热迁移稳定性分析（TSA）的详细描述此前已有发表20。本文仅提及与片段筛选相关的重点内容。

  1. 测量前的板检测
    1. 目视检查蛋白质板各孔中是否因加入片段而产生沉淀。若在多个孔中观察到沉淀，应降低片段浓度并重复实验。
      注意：建议将蛋白质板保持在室温；片段在较低温度下容易变得不溶。
  2. 准备 Prometheus 仪器
    1. 打开 Prometheus 仪器电源。在触摸屏上点击 Open Drawer 以进入毛细管加载模块。取下加载模块上的磁条，并用乙醇清洁镜面以去除任何灰尘颗粒。
  3. 从蛋白质-片段板转移至毛细管
    注意：此步骤涉及将蛋白质板中每个孔的蛋白质/片段混合样品通过毛细作用转移至毛细管，用于 Prometheus 仪器检测。尽管通常使用标准型毛细管，但在蛋白质浓度极低时也可使用高灵敏度毛细管。
    1. 将蛋白质板和毛细管放置在仪器旁边，以便于接近毛细管加载模块。
    2. 取一根毛细管，手持一端，用另一端接触蛋白质板中的溶液，通过毛细作用转移样品。操作时应始终佩戴手套，并避免触碰毛细管中部，以防手套上的杂质（例如，灰尘颗粒）影响测量结果。
    3. 将毛细管放入支架的指定位置，确保其正确对齐并居中。
    4. 重复步骤 3.3.2 和 3.3.3，填满加载模块中的所有位置。加载所有测量所需的毛细管。
      注意：单次运行最多可加载 48 根毛细管。
    5. 最后，将磁条放置在毛细管上方以固定其位置，然后点击 Close Drawer 开始实验。
  4. 进行纳米差示扫描荧光实验（nano-DSF）
    1. 荧光扫描
      1. 打开 Prometheus 软件 PR.ThermControl，点击 Start New Session 创建一个新项目，项目名称格式为 ProteinName_ScreenName_PlateNumber。首先执行 Discovery Scan 以检测样品的荧光信号。
        注意：理想情况下，每个样品的荧光计数应高于 3,000。荧光信号超过仪器饱和限值（20,000 计数）的样品将无法被准确测量。
      2. 通过调节激光的 Excitation Power 来调整样品的荧光信号（图 4）。
    2. 热变性实验
      1. 点击 Melting Scan 选项卡。设置 Start Temperature 为 20 °C，End Temperature 为 95 °C，温度斜率为 1 °C min-1，然后点击 Start Measurement 开始实验。
    3. 实验注释
      1. 实验开始后，点击 Annotation and Results 选项卡。为每根毛细管分配唯一的板编号和孔编号进行注释。
        注意：例如，毛细管 1B2 对应第 1 块板的 B2 孔。在此选项卡中可为实验添加额外列，例如 蛋白质名称、缓冲液、蛋白质浓度。实验结束后，结果也将在该选项卡中显示。建议在当天实验结束时暂停，实验通常过夜进行，次日可收集结果。
    4. 数据可视化与导出
      1. 实验结束后，点击 Melting Scan 选项卡查看各样品的熔解曲线和散射曲线。如需将结果导出为电子表格，点击 Melting Scan 选项卡中的 Export，并在下拉菜单中选择 Export Processed Data。

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图4：调节激发光功率和荧光信号。 （A）在80%激发光功率下，大多数样品的荧光信号超出饱和极限。（B）将激发光功率降低至60%，荧光信号降至可测量范围。 请点击此处查看该图的放大版本。

4. 迭代

  1. 重复步骤 1-3，对包含 768 种化合物的完整 Enamine 化合物库进行 16 次运行（16 × 48 = 768）。
  2. 由于每块板的测量约需 1.5 小时才能完成，因此在完成当前板的注释（3.4.3）的同时，通过重复第 1 和第 2 部分中的步骤，准备下一块蛋白质-片段复合物板。
    ​注意：在典型的工作日内，可根据操作经验完成 4-6 块板的测量。整个 DSi 化合物库的筛选可在总共 3-4 天内完成。

5. 数据分析

  1. 分析生成的数据
    1. 每次运行完成后，单击 注释与结果 切换以显示结果。对于每个样品，重点关注本概述中两个最重要的计算值：1）散射起始温度（散射起始点 #1），表明样品散射事件开始增加时的温度，是聚集的特征；2）Tm (比率的拐点 #1从330 nm与350 nm处荧光事件的比值中提取的数值——该比值通常对应于色氨酸荧光在其环境变化时发生最大改变的特征值。
    2. 务必检查每个毛细管的散射曲线和熔解曲线 熔解曲线分析 确保这些数值可靠。
  2. 导出并检查到电子表格
    1. 将所有不同运行的数据导出至电子表格软件以进行检查，方法如3.4.4节所述，并用于创建概览表格和图表。点击电子表格文件中的各个工作表，查看每个工作表中的信息。
      1. 在 概述 表格中，每一行对应一个实验。沿参数概览（例如，起始温度与终止温度），观察计算得到的Tm 以及散射起始点（参见上文5.1中的名称和解释，及 补充文件 1 和 2 （例如）。由于软件会计算两个或更多个 Tm 对于某些样本，观察熔解转变曲线以确定比率的拐点值（拐点 #1 和 #2）对应的 Tm 数值正确。
      2. 在 比率 表格中，每一列对应一个样本，每一行对应每个温度步骤的读数。观察每个温度步骤对应的荧光计数值，并利用这些数据绘制特定样本的熔解曲线，以温度列对荧光计数列作图。请注意，Ratio（一阶导数）、330 nm、330 nm（一阶导数）、350 nm、350 nm（一阶导数）中的数据用于以类似格式计算比值及其一阶导数（该导数在变化速率最大时达到峰值）。
      3. 观察到散射中存在类似的数据 散射 将每个样品的散射曲线通过散射列对温度列作图生成。查找散射一阶导数对应的表格。
  3. 创建并验证所有片段的全局概览
    1. 在验证正确的Tm 片段的数值，合并各列 样本编号 和 拐点 330/350 nm 比值的m) 将所有运行结果中的这些列复制到一个全新的结果文件中。
    2. 使用平均 Tm 天然蛋白的值（通常基于十次运行计算得出），并从 T 中减去该值m 每个样本的值，以获得 ΔTm. 对结果进行排序 ΔTm 按降序排列以确定导致最大偏移的样本。
    3. 根据片段大小将它们分装到不同的容器中 ΔTm 移位，并通过绘图生成整个文库的频率表 ΔTm 每个区间的片段数量图5）。为方便起见，将代表片段数量的坐标轴以对数尺度显示。对样本进行分箱处理 ΔTm ±1，并根据每次运行的情况调整其他区间，以经验方式调整异常值的数量。

结果

对三个具有医学意义的蛋白质进行了DSi-Poised文库（768个片段）的全筛，这些蛋白质分别为：在癌症中高表达的外层动粒蛋白Hec1（Hec1，或Ndc80）、单极纺锤体激酶1（Mps1）的调节性四肽重复（TPR）结构域，以及SARS-CoV-2的3C样蛋白酶Nsp5，后者可在11个位点切割复制酶多蛋白的C末端。每种蛋白质所选用的缓冲条件、蛋白浓度及其Tm值详见补充表S4。

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图5：熔解温度变化值的频率分布（ΔTm本研究中作为代表性结果展示的三种蛋白质 Hec1、Mps1 和 Nsp5 的） 缩写：Hec1 = Highly Expressed in Cancer 1蛋白；Mps1 = 单极纺锤体激酶1；Nsp5 = 严重急性呼吸综合征冠状病毒2 3C样蛋白酶 请点击此处查看此图的放大版本。

使用上述方案进行的三次筛选结果以 Tm 变化值相对于片段数量的频率分布图形式展示，如图5所示。这些图谱的生成方法如方案第5.3节所述，即绘制观察到的 Tm 变化频率。偏移值的显著性需根据不同项目进行主观界定，具体讨论见下文讨论部分。负值表示在片段存在下熔解温度降低，正值则表示 Tm 升高。从这些图谱中可以明显看出，对于 Nsp5，所有片段均表现出去稳定作用；而对于 Hec1 和 Mps1，则同时观察到稳定性和去稳定性的阳性结果。这一现象是可预期的，下文将对此进行讨论。

讨论

本方案描述了一种利用常见机器人系统和测量仪器进行片段库筛选的中高通量方法。例如，阿姆斯特丹NKI蛋白质中心可常规开展此类方案所述的筛选实验，通常作为iNEXT-Discovery服务的一部分，用户在提交申请并通过同行评审后，往往可免费获得该服务。在此类服务中，DSi-Poised文库可由该中心提供，但其他文库的使用也可根据每位用户的特定应用和服务协议进行协商。本方案中所选用的仪器代表了多数实验室的实用解决方案，但不应被视为金标准。在进行片段筛选时，建议采用无标记方法来检测靶标蛋白的热稳定性，而非使用对环境敏感的标记物来检测逆转录聚合酶链式反应（PCR）仪中蛋白去折叠的方法。

无标记方法（例如本文使用的 Prometheus 仪器）具有一些优势：所需蛋白用量极少，通常比其他方法少一到两个数量级；可同时测量样品的散射信号，从而检测聚集情况；而在其他方法中用于检测去折叠的标记物可能与不同片段产生差异性相互作用，导致测量假象。本方案结合 Mosquito 机器人进行描述，该机器人能够移取极小体积的样品（0.3 µL），这是手动操作无法实现的。Mosquito 是一种广泛应用于结构生物学和药物发现研究实验室的自动化设备；然而，本方案显然也可采用其他低体积移液技术替代。

片段化合物库中的化合物通常溶解于DMSO中。一个初始挑战是确定蛋白质保持稳定且化合物保持溶解状态的最佳DMSO浓度。这需要在不同DMSO浓度下进行测量，以确定筛选的最佳条件。本实验中采用的蛋白质与片段的稀释比例导致DMSO终浓度为0.2%；大多数蛋白质在此条件下具有较好的稳定性。对包含768种化合物的库进行筛选所需的蛋白质总量约为2–3 mg，因为实验通常在较低的蛋白质浓度（0.2 mg mL-1）下进行。采用如此相对较低的蛋白质浓度不仅可降低蛋白质制备成本，还能减少蛋白质沉淀的可能性。低蛋白质浓度不会影响对片段结合的检测，因为实验中片段的浓度约为2 mM，足以识别出弱结合分子。

由于这些实验中的熔解转变检测基于荧光强度，一个关键方面是确定进行测量时所使用的激光激发功率。化合物与蛋白质的相互作用可能（i）对其内在荧光无影响，（ii）导致荧光淬灭，或（iii）增强其内在荧光。此外，由于实验中使用的是低蛋白浓度，天然蛋白质的荧光计数会较低。因此，必须调整激发功率，以确保大多数样品均可被检测。每次运行的散射曲线提供了有关片段添加可能引发的聚集效应的重要信息。此外，温度对化合物溶解度的影响也可在散射曲线中观察到。

出乎意料的是，对于许多化合物 ，观察到散射信号实际上随温度升高而降低（图6）。因此，必须同时考察熔解转变曲线及其对应的散射谱图，以评估每次实验的可靠性，特别是对于那些拟进行X射线晶体学或核磁共振波谱等更复杂测量的候选片段，或拟作为后续化学优化起点的“命中”片段。该方法在片段筛选应用中的一个具体局限性在于，DSi-Poised文库中的许多片段具有显著的本征荧光，有时甚至超出检测器的饱和极限，因此即使在低激发功率下，这些片段也无法被准确检测其与靶标的结合情况。该方法另一个需要注意的方面是，其仅适用于含有色氨酸残基的蛋白质。

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图6：温度对化合物溶解度的影响。 Hec1与两种不同化合物的熔融转变曲线及散射谱图。（A）散射谱图显示，该样品的溶解度不受温度影响。（B）散射谱图显示，该样品的溶解度随温度升高而增加，因此该情况下的熔融转变曲线不可靠。请点击此处查看该图的放大版本。

一个尚未解决的问题是，何种程度的变化应被视为T的显著改变m，不是从数学的角度，而是从实际应用的角度：T 发生怎样的变化m 在这些示例中，小于 1 °C 分别有74%的片段显示出与Hec1结合，66%与Mps1结合，53%与Nsp5结合。考虑到 1 °C “显著变化”几乎不会产生值得通过后续化学手段深入研究的阳性结果。在概览图中（图5），温度梯度区间为1、2、5或大于5度m 偏移，无论是正向还是负向，均被纳入考虑。需根据每种具体情况作出相应调整，以提供清晰的总体视图，并支持基于信息的决策，确定后续步骤。值得注意的是，对于某些蛋白质，根据所考虑的片段不同，可观察到靶蛋白的稳定化与去稳定化现象。这两种情况均具有研究价值，因为二者均可能源于片段结合，并均有可能导向具有良好后续潜力的分子，以调控蛋白质行为。

最后一个问题仍然存在，即“什么才算是一个有意义的命中结果？”事实上，答案取决于具体情境。例如，对于Hec1，所有能使蛋白稳定性提高超过2度或降低超过5度的片段，均被提交给我们的化学合作团队，他们基于这些命中结果设计了新的分子。然而，对于Nsp5，最具去稳定作用的命中结果则被提交给我们的核磁共振（NMR）合作团队，以通过NMR实验验证纳米差示扫描荧光法（nanoDSF）获得的命中结果。换句话说，本方案获得的筛选结果应谨慎分析，并根据具体背景进行判断，结合特定科学问题及相关方法学做出合理决策。无论如何，本文所述方法是对现有技术（如基于X射线和NMR的筛选）的有益补充，可用于验证结果、优先排序或为化学研究提供新思路。

补充表 S1：用于蛋白质筛选的缓冲液列表。 缩写：HEPES = 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸；DTT = 二硫苏糖醇；MOBS = 4-(N-吗啉代)丁磺酸。请点击此处下载该表格。

补充表 S2：纳米分配机器人所用 MRC 2孔板的性能参数。请点击此处下载该表格。

补充表 S3：纳米分配机器人适用的 96 孔 V 型底板的性能参数。 请点击此处下载该表格。

补充表 S4：代表性结果中讨论的蛋白质所使用的缓冲液、蛋白浓度及 Tm 值。缩写：DTT = 二硫苏糖醇；Hec1 = 癌症高表达蛋白 1（Highly Expressed in Cancer 1 protein）；Mps1 = 单极纺锤体激酶 1（monopolar spindle kinase 1）；Nsp5 = SARS-CoV-2 3C 样蛋白酶（SARS-CoV-2 3C-like protease）。请点击此处下载该表格。

补充文件 1：概述参数—示例数据。 请点击此处下载该文件。

补充文件 2：406 个片段的 Tm 和 ΔTm 值——示例数据。 请点击此处下载该文件。

致谢

"本研究得益于访问NKI蛋白质设施中心（NKI Protein Facility），该中心为Instruct-ERIC中心。财务支持由iNEXT（项目编号653706）和iNEXT-Discovery（项目编号871037）提供，两项项目均由欧洲委员会“地平线2020”计划（Horizon 2020 program）资助"。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
ClearVue 片材Molecular Dimensions用于蛋白板的压敏封膜
CORNING 6570 铝箔封膜CORNING用于片段板的压敏封膜
DSi 预置化合物库Enamine本研究中使用的含 768 种化合物的片段库
ELISA 试剂储液槽ThermoFisher Scientific15075用于移取蛋白试剂的储液槽
Greiner 圆底（U 型）微孔板货号 650201片段化合物提供时所用的微孔板
Mosquito X1 型移液系统sptlabtech部件号 3019-0003纳升级液体分配仪
MRC 双孔结晶板MRC96T-PS
Pierce ELISA 试剂储液槽Pierce
Prometheus 高灵敏度毛细管目录号 PR-C006
Prometheus NT.48 nanoDSFNanotemper目录号 PR001（+ 聚集检测光学模块，目录号 PR-AGO）纳米差示扫描荧光法（nanoDSF）与光背向散射检测
Prometheus 标准型毛细管目录号 PR-C002
TX-1000Thermoscientific微孔板离心机

参考文献

  1. Hoffer, L., Muller, C., Roche, P., Morelli, X. Chemistry-driven hit-to-lead optimization guided by structure-based approaches. Molecular Informatics. 37 (9-10), 1800059(2018).
  2. Lamoree, B., Hubbard, R. E. Current perspectives in fragment-based lead discovery (FBLD). Essays in Biochemistry. 61 (5), 453-464 (2017).
  3. Ress, D. C., Congreve, M., Murray, C. W., Carr, R. Fragment-based lead discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 3 (8), 660-672 (2004).
  4. Carr, R. A. E., Congreve, M., Murray, C. W., Rees, D. C. Fragment-based lead discovery: Leads by design. Drug Discovery Today. 10 (14), 987-992 (2005).
  5. Bradley, A. R., et al. The SGC beyond structural genomics: Redefining the role of 3D structures by coupling genomic stratification with fragment-based discovery. Essays in Biochemistry. 61 (5), 495-503 (2017).
  6. Davies, T. G., Tickle, I. J. Fragment screening using X-ray crystallography. Topics in Current Chemistry. 317, 33-59 (2012).
  7. Ma, R., Wang, P., Wu, J., Ruan, K. Process of fragment-based lead discovery - A perspective from NMR. Molecules. 21 (7), 854(2016).
  8. Troelsen, N. S., Clausen, M. H. Library design strategies to accelerate fragment-based drug discovery. Chemistry. 26 (50), 11391-11403 (2020).
  9. Shi, Y., von Itzstein, M. How size matters: Diversity for fragment library design. Molecules. 24 (15), 2838(2019).
  10. Taylor, A., Doak, B. C., Scanlon, M. J. Design of a fragment-screening library. Methods in Enzymology. 610, 97-115 (2018).
  11. Cox, O. B., et al. A poised fragment library enables rapid synthetic expansion yielding the first reported inhibitors of PHIP(2), an atypical bromodomain. Chemical Science. 7, 2322-2330 (2016).
  12. Sreeramulu, S., et al. NMR quality control of fragment libraries for screening. Journal of Biomolecular NMR. 74 (10-11), 555-563 (2020).
  13. Pfaff, S. J., Chimenti, M. S., Kelly, M. J. S., Arkin, M. R. Biophysical methods for identifying fragment-based inhibitors of protein-protein interactions. Methods in Molecular Biology. 1278, 587-613 (2015).
  14. Fattori, D., Squarcia, A., Bartoli, S. Fragment-based approach to drug lead discovery: Overview and advances in various techniques. Drugs in R & D. 9 (4), 217-227 (2008).
  15. Winter, A., et al. Biophysical and computational fragment-based approaches to targeting protein-protein interactions: Applications in structure-guided drug discovery. Quarterly Reviews of Biophysics. 45 (4), 383-426 (2012).
  16. Boelens, R., et al. iNEXT: a European facility network to stimulate translational structural biology. FEBS Letters. 592 (12), 1909-1917 (2018).
  17. Zhang, R., Monsma, F. Fluorescence-based thermal shift assays. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 13 (4), 389-402 (2010).
  18. Boivin, S., Kozak, S., Meijers, R. Optimization of protein purification and characterization using Thermofluor screens. Protein Expression and Purification. 91 (2), 192-206 (2013).
  19. Martinez Molina, D., Nordlund, P. The cellular thermal shift assay: a novel biophysical assay for in situ drug target engagement and mechanistic biomarker studies. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).
  20. Bruce, D., Cardew, E., Freitag-Pohl, S., Pohl, E. How to stabilize protein: stability screens for thermal shift assays and nano differential scanning fluorimetry in the Virus-X Project. Journal of Visualized Experiments JoVE. (144), e58666(2019).

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