本文介绍了一种大鼠部分异位骨肌皮瓣移植方案及其在中期随访中的潜在结果。
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摘要
摘要
血管化复合组织异体移植（VCA）为复杂组织缺损后无自体手术修复可能的患者提供了最先进的重建手段。面部与手部移植已改变了毁容患者的生活，赋予他们新的美观且具备功能的社会器官。尽管临床效果令人鼓舞，但由于需要终身免疫抑制所带来的合并症及感染并发症，VCA 的临床应用仍受到限制。大鼠是研究免疫通路和移植物排斥机制的 体内 实验的理想动物模型。大鼠也广泛应用于新型复合组织移植物保存技术的研究，包括灌注保存和冷冻保存等。用于大鼠 VCA 研究的模型必须具备可重复性、可靠性与高效性，并具有较低的术后发病率和死亡率。异位肢体移植术符合这些标准，且相较于原位肢体移植更易于操作。掌握啮齿类动物显微外科模型需要扎实的显微外科技术和动物护理经验。本文报道了一种可靠且可重复的大鼠部分异位骨肌皮瓣移植模型，以及术后结果和潜在并发症的预防措施。
引言
在过去二十年中，血管化复合组织移植（VCA）已成为治疗严重毁容患者的革命性手段，适用于面部1、上肢截肢2、阴茎3以及其他复杂组织缺损4,5的修复。然而，终身免疫抑制所带来的后果仍限制了这类复杂重建手术的广泛应用。基础研究对于改进抗排斥策略至关重要。延长VCA移植物的保存时间同样至关重要，有助于改善移植物流并扩大供体池（因为VCA供体需满足比实体器官供体更多的标准，包括肤色、解剖尺寸和性别等）。在此背景下，大鼠肢体移植被广泛应用于同种异体移植物免疫排斥研究6,7、新型耐受诱导方案研究8以及保存技术研究9,10,11。因此，掌握这些VCA模型是推进VCA转化研究的关键环节。
文献中已将骨肌皮瓣描述为研究大鼠血管化复合组织移植（VCA）的可靠模型8,12,13,14。尽管原位全肢体移植可实现对移植物功能的长期评估，但该手术耗时较长，且与较高的术后发病率和死亡率相关14。相比之下，异位肢体移植模型虽不具备功能，却能够实现对VCA的可重复性研究。在开展大鼠VCA移植研究之前，可较为可靠地预测术后结果。本研究报道了一种大鼠部分异位骨肌皮瓣移植模型，涵盖了术中及术后三周随访期间可能出现的常见结局与并发症。
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方案
所有动物的饲养和实验均遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物的护理和使用指南》的人道护理标准。所有动物实验方案均获得机构动物护理和使用委员会（IACUC-协议号 2017N000184）和动物护理与使用审查办公室（ACURO）的批准。所有实验均使用近交系雄性Lewis大鼠（250–400 g）。
1. 手术
- 使用异氟烷吸入法麻醉Lewis大鼠。在诱导室中以5%异氟烷诱导麻醉，通过呼吸面罩以1.5-3%异氟烷吸入维持麻醉状态。
- 在生存手术前涂抹眼用润滑剂。剃除手术区域毛发，使用脱毛膏处理，进行刷洗，并用无菌手术单覆盖。
- 在切口前及手术过程中定期通过夹趾试验确认完全麻醉状态。全程监测心率和呼吸频率。所有手术均应使用无菌器械、耗材、手术单和手套，以维持无菌条件。所用器械列表详见材料表。
2. 供体右侧部分后肢的获取
- 在小腿远端三分之一处的踝关节上方做一圈皮肤环形切口。
- 使用双极电凝镊分离并电凝隐动脉及腘动脉终末支。电凝并切除腓肠肌、比目鱼肌、胫骨前肌和股二头肌，直至暴露胫骨。
- 在右侧腹股沟皱襞处做一个2.5 cm的切口。分离出腹股沟脂肪垫并将其向远端牵拉，以暴露股血管。使用鱼钩状拉钩钩住腹股沟韧带，用持夹钳夹住腹股沟脂肪垫并向远端牵拉。
注意： 部分肢体取材时包含腹股沟脂肪垫。 - 解剖股动静脉，分离墨菲支（Murphy支，通常位于腹股沟韧带与腹壁上动脉分支之间的中点处的深部肌支侧支），并用8-0尼龙线结扎。
- 用27.5 G针头经阴茎背静脉向供体大鼠注射100 IU/kg肝素进行肝素化处理。
- 完成髋部周围的皮肤切口。
- 使用双极电凝镊烧灼股二头肌和浅臀肌。在股骨中段水平烧灼并切断坐骨神经。在股骨后嵴水平近端暴露股骨。
注意：不获取内收肌和股四头肌。保留髂腰肌蒂。 - 在腹股沟韧带水平用8/0尼龙线结扎股动静脉。在结扎线远端稍下方对股动脉进行动脉切开，并予以扩张，以便插入24 G动脉导管。
- 电凝并切断蒂下方残留的肌肉，暴露股骨前侧。
- 使用骨剪尽可能在近端和远端（中段）分别切断胫骨和股骨。
- 用 2 mL 肝素盐水（100 IU/mL）冲洗部分后肢，直至静脉流出液澄清。用无菌纱布包裹后置于冰上保存，直至进行显微血管移植。图1).
- 在动物处于全身麻醉状态下，通过放血法实施安乐死。通过呼吸运动和心跳消失确认死亡。
图1：大鼠部分后肢被采集。 一根24 G套管针插入股动脉，准备进行异位显微血管移植。请点击此处查看该图的放大版本。
3. 受体手术
- 手术前，剃除大鼠颈部背面的毛发，并皮下注射0.01–0.05 mg/kg的丁丙诺啡。将大鼠仰卧位放置于加热垫上。
- 在右侧腹股沟皱襞处做一条2.5 cm长的切口。分离腹股沟脂肪垫并将其向远端翻转，以暴露股血管。使用钩子牵开腹股沟韧带，并用夹持镊子将腹股沟脂肪垫向远端固定。
- 解剖股血管，分离出Murphy分支，并用8/0尼龙线结扎。
- 在腹壁下血管上方用8/0尼龙线结扎两条血管。在近端放置对合钳，扩张血管断端，并用肝素化生理盐水冲洗。
- 在左侧腰部髋部上方做一切口，并通过皮下隧道在腹股沟皱襞处创建一个皮下囊袋。
注：植入切口应位于髋关节活动范围之上，以确保动物后肢运动正常。此外，在移植物植入部位与显微血管移植部位之间保留一段皮肤桥，有助于更好地固定移植物（图2）。 - 将部分肢体的近端和腹股沟脂肪垫经皮下隧道引至显微血管吻合部位。使用10/0尼龙缝线完成静脉和动脉吻合。移除两个对合钳，观察肢体再灌注情况。对两条血管进行“挤奶试验”，以评估每处吻合口的通畅性。
注：静脉吻合通常需要8至9针，动脉吻合平均需要6针。 - 在移植肢体内侧做一纵向皮肤切口，植入移植物。修剪移植物多余的皮肤，使用可吸收的4/0缝线行间断缝合与连续缝合关闭切口。
- 使用两根单独的可吸收缝线将移植肢体与受体的腹股沟脂肪垫缝合在一起，并在最后检查显微血管吻合情况后，最终闭合腹股沟皱襞。
注：应紧密缝合腹股沟脂肪垫，以在吻合口上方形成一层保护性脂肪组织，确保移植物及其血管蒂位置稳固。精细的缝合有利于伤口愈合，同时可防止伤口残留出血并降低自残风险。 - 根据围手术期出血量，皮下补充1–3 mL生理盐水以补偿液体丢失。
- 在动物颈部佩戴伊丽莎白圈，并在皮肤上施加2针松散缝线以保持其正确位置。
- 停止异氟烷吸入，在加热垫上持续监测动物，直至其完全清醒并能自主活动。
图 2：骨肌皮瓣植入前的围手术期图像。 在腹股沟皱褶切口与髋部上方移植物植入处之间，保留约 1 cm 的皮肤桥。移植物置于该桥下方，以保持其稳定，便于进行显微血管移植。请点击此处查看该图的放大版本。
4. 术后护理
- 术后72小时内每日观察动物两次，之后在术后第7天（POD 7）前每日一次，随后每周两次。
注意：应根据动物及移植物状况调整监测频率（例如，眼睛苍白可能提示需要补充液体，眼鼻部分泌物染色可作为动物疼痛的指标，移植物颜色或温度异常等），并应与兽医讨论是否需要进一步护理。在整个研究期间，受体大鼠必须单笼饲养，以避免移植物受到任何损伤。 - 根据IACUC指南，通过皮下注射布托啡诺和/或非甾体抗炎药进行镇痛处理。
- 每日使用同一设备对移植物进行评估，并拍照记录，同时进行体格检查。
注意：在移植物皮肤上使用脱毛膏有助于更准确地评估移植皮肤的颜色。
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结果
在本项单人操作的研究中，共进行了30例同基因异位部分肢体移植。术后第21天未出现血管化复合组织移植失败或需实施安乐死的并发症即定义为手术成功。移植物的正常演变过程见图3。供体部分肢体获取和受体移植植入的平均操作时间分别为35分钟和105分钟；平均缺血时间为105分钟。随访期间出现了两类并发症（表1）——早期或晚期。部分并发症需实施安乐死，其余得以挽救，所有病例均与兽医人员进行了讨论（表2）。本研究报告了作者在啮齿类动物显微外科领域的经验，并为初学者提供了建议（补充表1）。
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讨论
已有文献报道了啮齿类动物的原位肢体移植模型16,17,18；然而，该模型需要进行神经修复、肌肉再附着以及股骨的完美骨愈合，而骨愈合可能是一个非常困难的步骤。此外，这类模型在啮齿类动物中还伴随较高的发病率和死亡率14，尤其是在短期随访中，因为移植后肢恢复正常功能可能需要数月时间19。然而，若移植成功，则可实现对移植物功能的长期评估。异位肢体移植的主要局限性在于，由于移植物缺乏再神经支配，会导致肌肉萎缩。如先前文献所述，去神经支配后仅5天即可出现肌纤维损伤20。这会导致一个月后出现显著的肌肉萎缩和脂肪变性，因此该模型不适用于持续超过三周的in vivo研究。从这一角度来看，部分异位骨-肌-皮瓣模型最适合用于组织保存10、组织生物工程以及免疫抑制策略<...
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致谢
本研究由美国国防健康事务助理部长办公室通过国会指定医学研究项目资助，项目编号为 W81XWH-17-1-0680。观点、解释、结论和建议均为作者个人观点，不一定代表美国国防部的立场。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 24 号 GA 导管针 | BD Insyte Autoguard | 381412 | |
| 4-0 缝线 黑色单丝不可吸收缝线 | Ethicon | 1667 | 用于将伊丽莎白圈缝合至颈部背面 |
| 4-0 缝线 涂层薇乔抗菌缝线（Coated Vicryl Plus Antibacterial） | Ethicon | VCP496 | |
| 阿登组织镊，11 cm，1×2 齿，带打结平台 | ASSI | ASSI.ATK26426 | |
| 双极电凝线 | ASSI | 228000C | |
| 黑色聚酰胺单丝缝线，USP 10-0，4 mm 3/8 弧形 | AROSurgical | T04A10N07-13 | 用于进行微血管吻合 |
| 盐酸丁丙诺啡 | Pharmaceutical, Inc | 42023-179-01 | |
| 扩张镊 | Fine science tools (FST) | 18131-12 | |
| 解剖剪，15 cm，圆柄，直径 8 mm，直形细锥形刀刃，7 mm，利普舒尔茨型 | ASSI | ASSI.SAS15RVL | |
| 双微型夹钳，5.5 × 1.5 mm | Fine science tools (FST) | 18040-22 | |
| 伊丽莎白圈 | Braintree Scientific | EC-R1 | |
| 镊子，长 13.5 cm，扁柄，直头宽 9 mm，头端直径 0.1 mm（×2） | ASSI | ASSI.JFL31 | |
| 哈尔西微型持针器 | Fine science tools (FST) | 12500-12 | |
| 肝素封闭冲洗液，USP，100 单位/mL | BD PosiFlush | 306424 | |
| 异氟烷 | Patterson Veterinary | 14043-704-06 | |
| 珠宝商双极镊，防粘，11 cm，直尖头，头端直径 0.25 mm | ASSI | ASSI.BPNS11223 | |
| Lone Star 弹性牵开器 | CooperSurgical | 3314-8G | 用于牵开腹股沟韧带以暴露股动静脉 |
| Lone Star 自持式牵开器 | CooperSurgical | 3301G | |
| 微型蚊式止血钳 | Fine science tools (FST) | 13010-12 | 用于远端牵开腹股沟脂肪垫 |
| 持针器，15 cm 圆柄，直径 8 mm，超细弯头钳口，头端直径 0.2 mm，无锁扣 | ASSI | ASSI.B1582 | |
| 尼龙缝线，黑色单丝，8-0，6.5 mm 3/8 弧形 | Ethilon | 2808G | 用于结扎股血管上的侧支 |
| 偏移式骨剪 | Fine science tools (FST) | 16101-10 | |
| S&T 血管夹，5.5 × 1.5 mm | Fine science tools (FST) | 00398-02 | |
| 沃尔顿剪 | Fine science tools (FST) | 14077-09 |
参考文献
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