高度准确的 体外 高通量检测系统被开发用于评估基于患者来源肿瘤类器官（PDOs）的抗癌药物，这类类器官类似于癌组织，但不适合用于 体外 采用96孔和384孔板的高通量检测系统。
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摘要
摘要
患者来源的肿瘤类器官（PDOs）被认为是一种比传统细胞培养模型更能准确重现疾病特征的临床前癌症模型。目前已成功从多种人类肿瘤中构建出PDOs，能够精确且高效地模拟肿瘤组织的结构与功能。然而，PDOs不适用于某些 体外 高通量筛选系统（HTS）或利用96孔板或384孔板进行细胞分析在评估抗癌药物时存在局限，因为类器官大小不一且在培养中易形成大细胞簇。此类培养与检测通常依赖Matrigel等细胞外基质以构建肿瘤组织支架。因此，患者来源类器官（PDOs）的通量较低、成本较高，难以开发出适宜的检测系统。为解决这一问题，已建立一种更为简便且精确的高通量筛选方法，利用PDOs评估抗癌药物及免疫治疗的药效。 体外 建立了一种利用源自实体瘤并在384孔板中培养的PDO进行高通量筛选（HTS）的方法。此外，还开发了一种在96孔板中培养PDO以评估抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）活性的HTS方法，用于模拟免疫应答。
引言
人类癌细胞系被广泛用于研究癌症生物学特性及评估抗癌药物。然而，这些细胞系在长期培养过程中，其形态、基因突变和基因表达谱可能发生改变，因而未必能保留其来源组织的原始特征。此外，大多数细胞系以单层形式培养或用作小鼠异种移植模型，这两种方式在物理结构上均不能真实模拟肿瘤组织。1,2因此，抗癌药物的临床疗效可能与在癌细胞系中观察到的效果不同。因此， 体外 系统，例如 离体 使用患者来源的肿瘤异种移植模型或患者来源的肿瘤类器官（PDOs）以及肿瘤球状体模型的检测方法已被开发，这些模型能够准确再现肿瘤组织的结构与功能。越来越多的证据表明，这些模型可通过与相应癌组织直接比较，预测患者对抗癌药物的反应。这些 体外 已针对不同类型的肿瘤组织建立了相应的体系，并开发了用于药物筛选的高通量检测系统（HTS）3,4,5,6,7. 异质的 离体 患者来源的原发性肿瘤或患者来源的肿瘤异种移植模型的类器官培养近年来受到广泛关注，因其培养简便，且能够维持肿瘤间质组织中细胞的复杂性8,9,10这些模型有望加深对癌症生物学的理解，并促进药物疗效的评估 体外.
最近，在福岛转化研究项目中，从不同类型的肿瘤组织创建了一系列新型PDO，命名为F-PDO。这些PDO形成较大的细胞簇，其形态与来源肿瘤相似，并可在体外培养超过六个月11。比较组织学和全面的基因表达分析表明，即使在长期培养条件下生长，PDO的特征仍与其来源肿瘤组织高度相近。此外，已为每种类型的PDO在96孔板和384孔板中建立了合适的高通量筛选（HTS）方法。这些检测方法被用于评估多种分子靶向药物和抗体。本文中，使用一名对紫杉醇和卡铂无应答的子宫内膜癌患者的F-PDO模型，评估了临床上常用的化疗药物（紫杉醇和卡铂）。结果显示，紫杉醇和卡铂对该PDO的细胞生长抑制活性较弱（IC50：>10 µM）。此外，先前的研究报道，某些F-PDO对化疗药物和分子靶向药物的敏感性与临床疗效具有一致性11,12,13。最后，利用三维细胞分析系统分析了抗癌药物引起PDO高级结构的变化12,13。基于PDO的高通量筛选对抗癌药物的评估结果与这些药物的临床结果具有可比性。本文提供了一种更简便且更精确的高通量筛选方案，可用于利用PDO模型评估抗癌药物及免疫治疗药物的药效。
方案
所有涉及人体来源材料的实验均遵循《赫尔辛基宣言》进行，并事先获得福岛医科大学伦理委员会的批准（批准编号分别为1953和2192；批准日期分别为2020年3月18日和2016年5月26日）。本研究中提供临床样本的所有患者均签署了书面知情同意书。
1. 类器官培养
注意：F-PDOs 会形成具有多种异质形态的细胞簇，并在悬浮培养中生长（图1）。此外，F-PDOs 可培养超过6个月，并可冷冻保存以供将来使用。
- 解冻保存的类器官（第0天）
- 在第0天解冻并接种类器官（例如 RLUN007，肺腺癌）（图1）。首先，向无菌的50 mL离心管中加入15 mL类器官培养基（见材料表），其中含1% B-27补充剂和30 ng/mL表皮生长因子。
- 从液氮中取出冻存管后，将其在37 °C水浴中轻轻振荡约2 分钟。随后将冻存管从水浴中取出，用70%乙醇擦拭管壁，并转移至生物安全柜中。
- 将冻存管中的内容物转移至含有15 mL类器官培养基的离心管中。使用3 mL移液管轻轻吹打5次，使类器官与培养基混匀。在约25 °C条件下以200 × g离心3分钟，弃去上清液。将类器官沉淀用5 mL新鲜培养基重悬，轻柔吹打后转移至一个25 cm2培养瓶（见材料表）。最后，将类器官置于37 °C、5% CO2的培养箱中培养。
- 每周更换两次培养基（第3–7天）。将类器官悬液离心以沉淀细胞团，更换4 mL培养基（占总体积的80%），并用新鲜培养基重悬细胞。
注意：大多数RLUN007表现为直径为100–500 µm的细胞团。当培养基中酚红颜色变为黄色（如图1A所示）时，应更频繁地更换培养基。若培养基在换液后次日即变黄，且每个细胞团融合形成直径>500 µm的大团块，则应以1:2的传代比例进行传代。 - 类器官的传代培养（第8–28天）
注意：由于难以准确计数单个细胞，传代时机主要依据细胞团的密度以及离心后类器官沉淀的体积（图1B）来确定。对于RLUN007，解冻后约两周，类器官沉淀体积可达30 µL（在25 cm2培养瓶中的饱和密度）。- 从一个25 cm2培养瓶传代至两个25 cm2培养瓶（P1）：将类器官悬液转移至离心管中，在约25 °C条件下以200 × g离心2分钟。估计类器官沉淀体积，弃去上清液。使用5 mL移液管将沉淀用5 mL新鲜培养基重悬，低速吹打5次。然后将悬液的一半体积（2.5 mL）分别转移至两个新培养瓶中，每瓶再补充2.5 mL新鲜培养基。在37 °C、5% CO2条件下培养。
- 从两个25 cm2培养瓶传代至一个75 cm2培养瓶（P2）：将两个培养瓶中的类器官悬液分别转移至两个离心管中，在约25 °C条件下以200 × g离心2分钟。随后估计类器官沉淀体积，并将每管沉淀用2.5 mL新鲜培养基重悬。之后将两管中的类器官悬液合并，转移至含有10 mL新鲜培养基的75 cm2培养瓶中。在37 °C、5% CO2条件下培养。首次传代后约1周，将两个25 cm2培养瓶中的类器官传代至一个75 cm2培养瓶（图1C）。
2. 生长抑制高通量筛选
注意：通过测量细胞内ATP含量来评估抗癌药物对PDO的生长抑制活性，如图2所示。该步骤使用 commercially available 细胞活力检测试剂盒进行（参见材料表）。
- 在第0天，将PDO（例如RLUN007）在培养瓶中培养，直至获得足够数量的细胞簇用于实验。接种前一天，将75 cm2培养瓶中的PDO悬液转移至15 mL离心管中，在200 x g条件下离心2分钟，以测定PDO沉淀体积。随后，将PDO沉淀重悬于15 mL新鲜培养基中，并转移回75 cm2培养瓶。于37 °C、5% CO2条件下培养细胞。
注意：所需PDO沉淀体积取决于每个PDO的扩增速率以及实验所用384孔板的数量。对于RLUN007，接种至十个384孔板需要200 µL的细胞沉淀体积。 - 在第1天（换液后24小时），使用细胞破碎与分散设备（见材料表），配合含有70 µm孔径滤膜的滤器装置对PDO进行切碎处理。然后将15 mL PDO悬液稀释10倍。使用细胞悬液分配器（见材料表），向384孔超低吸附球形培养微孔板（圆底）中每孔加入40 µL PDO悬液（见材料表）。
注意：建议使用市售的细胞破碎与分散设备进行细胞簇的切碎处理（见材料表）。 - 接种后24小时（第2天），使用液体处理系统（见材料表）向PDO加入0.04 µL测试剂溶液，终浓度范围为20 µM至1.0 nM（10倍系列稀释）。
- 在第8天（给予测试物质处理后144小时），向检测孔中加入胞内ATP检测试剂。使用振荡器混匀微孔板，并在25 °C孵育10分钟。使用酶标仪（见材料表）检测胞内ATP含量，以发光信号表示。
- 计算细胞活力时，将测试孔中的ATP量除以溶剂对照孔中的ATP量（均扣除背景值）。计算6天内的生长速率时，将接种后24小时的溶剂对照孔ATP量作为分母，除以第8天的溶剂对照孔ATP量。
- 使用生物数据分析软件（见材料表）根据剂量-反应曲线计算50%抑制浓度（IC50）和曲线下面积（AUC）值。Z因子是一个无量纲参数，取值范围为1（无限分离）至<0，其定义为 Z = 1 - (3σc+ + 3σc−) / |µc+ − µc−|，其中σc+、σc−、µc+和µc−分别为高值对照（c+）和低值对照（c−）的标准差（σ）和平均值（µ）14。
3. 采用细胞挑选与成像系统进行生长抑制的高通量筛选
注意：如果使用方案2时数据出现较大偏差（检测时变异系数[CV]超过20%），可使用细胞挑选与成像系统将特定大小的PDO接种至96孔板或384孔板中（图2）。该步骤的操作方法与前一部分中2.1和2.2步骤所述相同。此操作需使用 commercially available 的细胞挑选与成像系统（见材料表）。
- 第1天，在细胞挑选与成像系统上放置一个384孔超低吸附球体微孔板，每孔加入40 µL培养基作为目的板。
- 向挑选室（见材料表）中加入6 mL培养基，以1,500 x g离心2分钟以去除气泡。将悬浮于培养基中的PDO（PDO沉淀体积为4 µL）加入挑选室，并将其置于系统上。
- 静置挑选室至少1 分钟，随后进行分散，使细胞簇沉降至室底部；然后对挑选室进行扫描。
- 在系统上将挑选尺寸设定为140–160 µm（面积15,386–20,000 µm2），以实现对细胞簇的自动选择。接着 ，在扫描图像上检查所选细胞簇的质量，并使用挑选吸头（见材料表）将每孔十个细胞簇转移至目的板中。
- 执行自步骤2.3起的后续实验流程。
4. 抗体依赖性细胞介导的细胞毒性高通量筛选
注意：此步骤使用一种市售系统（参见材料表），该系统为一种电学阻抗测量仪器，用于通过单克隆抗体和自然杀伤（NK）细胞介导的抗体依赖性细胞毒作用（ADCC）评估类器官（PDOs）的细胞裂解（图3）。NK细胞采用NK细胞生产试剂盒（参见材料表），按照制造商说明书由外周血单个核细胞制备而成。
- ADCC 活性测定
- 第 0 天，在 4 °C 条件下，将 50 µL 浓度为 10 µg/mL 的纤连蛋白溶液（每孔 0.5 µg）包被于 96 孔板（见材料表）中，过夜孵育。
- 第 1 天，去除纤连蛋白溶液后，向每孔加入 50 µL 培养基，以测定背景阻抗。
- 接种前，向类器官（PDOs，RLUN007：75 cm2 培养瓶中含 100 µL 类器官沉淀）中加入 5 mL 细胞培养解离试剂（见材料表），在 37 °C 的 CO2 培养箱中孵育 20 分钟，以分散类器官。加入 5 mL 培养基终止消化，离心并去除解离试剂。用新鲜培养基清洗类器官，并通过 40 µm 细胞筛网过滤（见材料表）。
- 使用细胞活力分析仪（见材料表）计数细胞数量。
- 将类器官悬液转移至储液槽中，使用多通道移液器混匀。将类器官悬液以每孔 5 × 104 个细胞的密度加入 96 孔板中，每孔终体积为 100 µL。随后，将培养板置于生物安全柜中，约 25 °C 条件下静置 30 分钟。
- 将培养板转移至 CO2 培养箱中的仪器内，在 37 °C 条件下每 15 分钟记录一次阻抗信号的变化，作为细胞指数（cell index）。
- 在类器官接种当天，于 37 °C 水浴中解冻 NK 细胞。将细胞从冻存管转移至含 10 mL NK 细胞培养基（见材料表）的 15 mL 离心管中，在约 25 °C 条件下以 300 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 10 mL 新鲜培养基中。细胞计数后，调整细胞密度至 1 × 106 个细胞/mL，并转移至 75 cm2 培养瓶中。在 37 °C、5% CO2 培养箱中培养 NK 细胞。
- 第 2 天，在无菌 V 型底 96 孔板中配制抗体溶液（磷酸盐缓冲液），浓度为终浓度的 10 倍。
- 从每孔中移除 60 µL 培养基，向类器官中加入 10 µL 曲妥珠单抗或西妥昔单抗溶液（浓度分别为 10 µg/mL、1 µg/mL 和 0.1 µg/mL）。将培养板重新放回培养箱中的仪器，记录 1 小时的细胞指数。
- 将 NK 细胞悬液转移至 50 mL 离心管中并计数细胞数量。在 300 × g 条件下离心 5 分钟，用类器官培养基将 NK 细胞密度调整为 1 × 106 个细胞/mL 和 2 × 106 个细胞/mL。
- 向效应细胞（NK 细胞）中加入 50 µL NK 细胞悬液，使靶细胞（RLUN007）与效应细胞的比例为 1:1 或 2:1。抗体终浓度分别为 1 µg/mL、0.1 µg/mL 和 0.01 µg/mL。将培养板在约 25 °C 条件下静置 15 分钟后，放回仪器中继续监测。
- 数据采集与分析
- 使用分析软件（见材料表）将细胞指数转换为细胞裂解百分比（% cytolysis）值。
- 细胞裂解百分比表示 NK 细胞杀伤的靶细胞比例，以仅含靶细胞（类器官）的孔作为对照。在每个时间点，从样品孔的细胞指数中减去仅含 NK 细胞孔的细胞指数，并将各数值归一化至加抗体前的细胞指数。使用以下公式将归一化后的细胞指数转换为细胞裂解百分比：% cytolysis = (1 - 归一化细胞指数[样品孔]) / 归一化细胞指数[仅靶细胞孔] × 100。
结果
利用PDOs和384孔微孔板开发了一种高精度的高通量筛选方法用于评估抗癌药物，且此前已有针对每种PDO建立高通量筛选方法的报道10,11,12,13通过计算CV值和Z'因子来评估高通量筛选（HTS）的性能。Z'因子是广泛接受的用于验证检测方法质量和性能的指标，若该值大于0.5，则表明该检测适用于高通量筛选。 >0.514384孔板实验中使用RLUN007时，对照数据点变异极小，变异系数（CV）为5.8%，计算得到的Z'因子为0.83，如图所示。 图4这些结果表明，该检测方法在高通量筛选（HTS）中具有优异的性能。为利用HTS研究PDOs对抗癌药物的敏感性，采用RLUN007并以八种抗癌药物处理，评估其生长抑制效果，这些药物包括表皮生长因子受体（EGFR）抑制剂（阿法替尼、厄洛替尼、吉非替尼、拉帕替尼、奥希替尼和rociletinib）以及非小细胞肺癌的标准临床治疗药物紫杉醇，并以丝裂霉素C作为阳性对照。IC50 每个PDO的抗癌药物AUC值如图所示 图4. RLUN007表现出高敏感性（IC50 < 2 µM，AUC < 282）适用于所有EGFR抑制剂及其他抗癌药物。对所有数据计算的S型曲线表明，这些抗癌药物的生长抑制活性可被准确测定。
当使用上述方法时数据差异显著的情况下，可采用细胞挑选与成像系统。该系统能够准确挑选细胞簇且不对其造成损伤，通过匹配细胞簇大小以排除细胞碎片对高通量筛选（HTS）检测系统的干扰，从而实现精确的HTS检测。未使用该系统时，变异系数（CV）值为26.0%，Z'-因子值为0.23（数据未显示）；而使用该系统后，CV值和Z'-因子值分别改善至6.4%和0.81。
为利用可长期监测细胞数量、形态及贴附状态的电学阻抗测量仪研究抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）对PDOs的细胞溶解效应，采用96孔板检测经抗体（曲妥珠单抗和西妥昔单抗）处理并以NK细胞作为效应细胞的RLUN007的阻抗信号变化。与仅含靶细胞的对照组相比，细胞溶解率随时间延长而升高；在效应细胞与靶细胞比例（E:T）为1:1的条件下，6小时后细胞溶解率分别达到45%或75%图5A, C）或 2:1（图5B，D）不加抗体。使用曲妥珠单抗时，自然杀伤细胞介导的细胞溶解在效靶比为1:1时分别约为60%和90%图 5A, 1 µg/mL）和 2:1（图5B, 1 µg/mL），6小时时分别表现出相应作用。相比之下，西妥昔单抗对自然杀伤细胞介导的细胞溶解具有剂量依赖性影响 (图5C，D）在西妥昔单抗最高浓度下，RLUN007 在效靶比为 1:1 和 2:1 时的杀伤率分别为 90% 和 100% (图5C，D）曲妥珠单抗的作用弱于西妥昔单抗，仅产生60%的细胞毒性。这些结果表明，PDO检测系统可利用基于实时阻抗的技术评估ADCC活性。
图1：PDO培养的关键步骤。（A）培养基的颜色变化。（B）通过将含有PDO的离心管与标有50–200 µL刻度的对照管并列比较，根据沉淀物大小估算PDO数量。（C）PDO密度。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：使用384孔微孔板构建高通量检测系统的实验流程概要。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：高通量ADCC活性检测方案概要。 ADCC，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；NK，自然杀伤细胞。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：抗癌药物生长抑制的高通量检测系统。 RLUN007对抗癌药物的剂量-反应曲线。将切碎的PDO接种于384孔板中，用十种不同浓度的抗癌药物（10 µM 至 1.5 nM）处理6天。数据代表三次重复实验的平均值±标准差。请点击此处查看该图的放大版本。
图5高通量ADCC活性检测 (A，B曲妥珠单抗。C,D西妥昔单抗。A,CRLUN007 与效应细胞以 1:1 的比例混合。B,D) 以1:2的RLUN007与效应细胞比例进行细胞裂解。效应细胞加入后12小时测定活性。数据表示为三个重复样本的均值±标准差。ADCC，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。 请点击此处以查看此图的放大版本。
讨论
PDO 的独特特征是在培养或检测过程中不会通过酶消化分离为单个细胞，而是在培养中保持细胞簇的形态。因此，无法在显微镜下准确计数细胞数量。为解决这一问题，可通过将含有细胞的离心管与标有 50–200 µL 刻度的对照管并列，目视判断细胞数量（图 1B）。此外，由于在 25 cm2 培养瓶中培养的细胞簇其沉淀体积难以通过肉眼准确测量，传代时间的确定依赖于培养基颜色由红色变为黄色，以及单个细胞或碎片明显增多等指标（图 1A、C），这些变化即作为 PDO 传代的判断依据。每次更换培养基后，均需在离心后通过目视评估 PDO 沉淀物的量。当沉淀物体积不再增加，且在换液后第二天培养基即变为黄色时，表明培养体系中细胞密度已达饱和，需进行传代。每个 PDO 系的沉淀物体积均有其特定标准。若 PDO 增殖缓慢，则在换液时将换液量由 80% 调整为 50%，以提高培养中 PDO 的密度。
已开发出适用于患者来源类器官（PDO）的高通量筛选方法。该方法的通量至少可达到每75 cm2培养瓶的PDO处理十至二十块384孔板，且每日处理的板数至少为50块。此外，已有利用PDO进行高通量筛选评估多种抗癌药物的研究结果报道。
在进行高通量筛选（HTS）时，最初可通过将过滤网的孔径更改为100 µm，以解决因使用细胞破碎与分散设备处理F-PDOs导致的滤网堵塞问题。下一步是减少加样至玻璃容器中的PDO悬液的体积。在为高通量筛选配制测试物质溶液时，小分子量化合物通常溶解于二甲基亚砜中，而抗体则溶解于磷酸盐缓冲液中。应使用适当的溶剂作为测试物质，并以所用溶剂获得对照数据。
以下是关于如何处理检测数据中变异性的说明。如果在使用384孔板进行检测时数据变异较大，应将检测板改为96孔板格式。在接种平板后，还需检查PDO的稀释倍数（接种的细胞簇数量）。最后，可利用细胞挑选与成像系统选择用于检测的PDO大小。在将PDO加入检测腔室之前，应通过低速离心去除单个细胞和小型细胞簇，以确保能够准确识别PDO。如果在将PDO加入腔室后仍可见单个细胞或小型细胞簇，可进行多次分散操作以去除这些单细胞。接下来，尽管细胞挑选与成像系统具有保持平板温度的功能，但由于系统长时间运行会导致培养基蒸发，因此不使用该功能。此外，由于PDO体积是通过平面图像识别的，其实际体积未知。而且，若两个或多个PDO发生重叠，则无法准确识别单个PDO。然而，在移动后通过扫描图像检查，可利用“移除”功能去除不需要的PDO。
电学阻抗测量仪器通常用于监测贴壁生长的靶向癌细胞在增殖过程中阻抗的变化。因此，非贴壁生长的类器官（PDO）的细胞指数变化无法被检测到。为解决这一问题，有必要根据PDO的类型，研究其接种条件，例如PDO密度以及酶处理条件（细胞解离酶种类及处理时间）。此外，培养板的孔须用适当的细胞外基质进行包被，以利于PDO的接种。根据PDO类型的不同，某些情况下可不经过酶处理直接进行接种。本研究中使用RLUN007，在经酶处理分散后将其接种于96孔板以测量阻抗。RLUN007使用细胞培养解离试剂在37 °C下处理20分钟，以实现细胞分散并使其贴附于96孔板的孔中。由于解离后的RLUN007细胞会迅速形成聚集体，因此建议在过滤筛过滤后立即进行接种。将细胞悬液从离心管转移至储液槽后，在接种至孔板前，需将储液槽轻轻左右移动两到三次，并用移液器吹打五次。每次向孔中加样时也需混合悬液。随后将培养板置于生物安全柜中静置30分钟（针对PDO）或15分钟（针对NK细胞），以使细胞在孔内均匀分布。第二个关键点是，抗体处理和NK细胞的加入应选择在细胞指数达到平台期之前，且细胞指数值不低于0.5时进行。对于RLUN007，最佳检测起始时间为接种后20–22小时，接种细胞数量为每孔5 × 104个细胞。
通常，肿瘤类器官的培养和检测需要使用细胞外基质（如Matrigel）来构建肿瘤组织支架，或使用胰蛋白酶和胶原酶等酶类来解离类器官3,4,5,6,7。本方法的优势在于，在培养和检测过程中（使用电学阻抗测量仪器的检测除外）无需添加细胞外基质或进行酶处理，从而显著降低了人力需求和成本。此外，该方法相对容易与高通量筛选（HTS）检测系统及多种测量系统相兼容。然而，在某些研究目的下，使用细胞外基质仍是可取的，因为它可作为细胞的支架，并影响组织的形态发生、分化和稳态。
本研究采用具有EGFR突变（L858R）且临床上对EGFR抑制剂敏感、同时EGFR基因高表达（数据未显示）的PDOs（RLUN007）来评估EGFR抑制剂的效果。结果表明，RLUN007对EGFR抑制剂的敏感性高于其他肺源性F-PDOs13 (图4因此，利用保留肿瘤组织特性的患者来源类器官（PDOs）进行高通量筛选（HTS），在评估潜在抗癌药物方面具有优势，为药物评价和个体化医学的发展提供了机遇。尽管高通量筛选适用于药物的初步筛选，但其无法模拟肿瘤微环境，因而不能准确评估药物的疗效。 体内因此，一个 体外 能够模拟人体肿瘤组织的系统 体内 通过与血管内皮细胞和其他基质细胞共培养，或在无动物模型的情况下利用器官芯片技术，目前正处于开发阶段。
披露
富士胶片和光纯药株式会社是富士胶片和光纯药化学品公司的子公司，通过许可转让拥有F-PDO及F-PDO培养基的商业所有权。
致谢
我们感谢提供本研究中所用临床样本的患者。本研究得到了福岛县转化研究项目资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 384孔超低吸附球体微孔板 | Corning | 4516 | 高通量筛选用板 |
| 40-µm 细胞筛 | Corning | 352340 | |
| AdoptCell-NK试剂盒 | Kohjin Bio | 16030400 | NK细胞制备试剂盒 |
| 肿瘤细胞扩增培养基plus | Fujifilm Wako Pure Chemical | 032-25745 | F-PDO培养用培养基 |
| ALyS505N-175 | Cell Science & Technology institute | 10217P10 | NK细胞培养基 |
| CELL HANDLER | Yamaha Motor | - | 细胞挑选与成像系统 |
| CellPet FT | JTEC | - | 细胞破碎与分散设备 |
| CellTiter-Glo 3D细胞活力检测 | Promega | G9683 | 基于荧光素酶的细胞活力检测法，用于检测细胞内ATP含量 |
| Echo 555 | Labcyte | - | 液体处理系统 |
| EnSpire | PerkinElmer | - | 微孔板读板仪 |
| E-plate VIEW 96 | Agilent | 300601020 | 专为xCELLigence RTCA系统设计的细胞实验用微孔板 |
| 纤维连接蛋白溶液 | Fujifilm Wako Pure Chemical | 063-05591 | xCELLigence RTCA系统的包被用试剂 |
| F-PDO | Fujifilm Wako Pure Chemical 或 Summit Pharmaceuticals International | - | F-PDO可从Fujifilm Wako Pure Chemicals或Summit Pharmaceuticals International购买 |
| Morphit软件，版本6.0 | The Edge Software Consultancy | 生物学数据分析软件 | |
| Multidrop Combi | ThermoFisher Scientific | 5840300 | 细胞悬液分配仪 |
| Precision Chamber | Yamaha Motor | JLE9M65W230 | 用于CELL HANDLER系统挑选细胞簇的腔室 |
| Precision Tip | Yamaha Motor | JLE9M65W300 | 用于CELL HANDLER系统挑选细胞簇的微型吸头 |
| RLUN007 | Fujifilm Wako Pure Chemical 或 Summit Pharmaceuticals International | 来源于肺癌的F-PDO | |
| TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12604021 | 细胞培养解离试剂 |
| 超低吸附25 cm² 培养瓶 | Corning | 4616 | 用于PDO培养的培养瓶 |
| 超低吸附75 cm² 培养瓶 | Corning | 3814 | 用于PDO培养的培养瓶 |
| Vi-CELL XR细胞活力分析系统 | Beckman coulter | - | 细胞活力分析仪 |
| xCELLigence免疫治疗软件，版本2.3 | ACEA Bioscience | - | xCELLigence RTCA系统的分析软件 |
| xCELLigence RTCA系统 | ACEA Bioscience | - | 用于细胞溶解检测的电学阻抗测量仪器 |
参考文献
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