Les épines dendritiques sont des caractéristiques cellulaires importantes du système nerveux. Ici, des méthodes d’imagerie en direct sont décrites pour évaluer la structure et la fonction des épines dendritiques chez C. elegans. Ces approches soutiennent le développement de criblages mutants pour les gènes qui définissent la forme ou la fonction de la colonne vertébrale dendritique.
Les épines dendritiques sont des sites spécialisés d’innervation synaptique modulés par l’activité et servent de substrats pour l’apprentissage et la mémoire. Récemment, les épines dendritiques ont été décrites pour les neurones DD GABAergiques comme les sites d’entrée des neurones cholinergiques présynaptiques dans le circuit moteur de Caenorhabditis elegans. Ce circuit synaptique peut maintenant servir de nouveau modèle in vivo puissant de morphogenèse et de fonction de la colonne vertébrale qui exploite la génétique facile et l’accessibilité facile de C. Elegans à l’imagerie de cellules vivantes.
Ce protocole décrit des stratégies expérimentales pour évaluer la structure et la fonction de la colonne vertébrale DD. Dans cette approche, une stratégie d’imagerie à super-résolution est utilisée pour visualiser les formes complexes des épines dendritiques riches en actine. Pour évaluer la fonction de la colonne vertébrale DD, l’opsine activée par la lumière, Chrimson, stimule les neurones cholinergiques présynaptiques, et l’indicateur de calcium, GCaMP, rapporte les transitoires de calcium évoqués dans les épines DD postsynaptiques. Ensemble, ces méthodes comprennent des approches puissantes pour identifier les déterminants génétiques des épines dendritiques chez C. elegans qui pourraient également diriger la morphogenèse et la fonction de la colonne vertébrale dans le cerveau.
Les épines dendritiques sont des structures cellulaires spécialisées qui reçoivent des informations des neurones voisins pour la transmission synaptique. L’activation des récepteurs des neurotransmetteurs élève le calcium intracellulaire et les voies de signalisation en aval dans ces protubérances neuronales caractéristiques1. En raison de l’importance fondamentale des épines dendritiques pour la neurotransmission et de leur mauvaise régulation dans les maladies neurodéveloppementales1, la découverte de facteurs qui modulent la morphogenèse et la fonction de la colonne vertébrale dendritique est d’un grand intérêt pour le domaine des neurosciences.
Récemment, des épines dendritiques ont été identifiées dans le système nerveux de C. elegans sur la base de caractéristiques clés partagées avec les épines de mammifères2. Cette détermination est cruciale car elle ouvre la possibilité d’exploiter les avantages de C. elegans pour étudier la biologie de la colonne vertébrale. Les épines dendritiques des motoneurones dorsaux D (DD) reçoivent l’entrée des neurones cholinergiques (VA et VB) dans le cordon nerveux ventral (Figure 1A)2,3,4. Ici, des méthodes d’imagerie sont présentées pour explorer la structure des épines dendritiques DD et leur fonction in vivo dans un système nerveux intact qui est facilement accessible à l’imagerie en direct et à l’analyse génétique. Pour surveiller la forme des épines dendritiques, (1) protéines fluorescentes cytosoliques, qui remplissent le processus dendritique et les épines; (2) les protéines fluorescentes liées à la membrane, qui décorent la bordure des épines dendritiques et des dendrites; ou (3) les marqueurs d’actine, LifeAct5 ou Utrophin6, enrichis en épines dendritiques sont utilisés, révélant ainsi leur forme. Pour surveiller la fonctionnalité des épines DD, la fluorescence GCaMP est utilisée pour détecter les transitoires Ca++ évoqués par l’activation de l’opsine décalée vers le rouge, Chrimson, dans les neurones cholinergiques présynaptiques7. Les deux stratégies devraient faciliter l’étude des épines dendritiques DD chez les animaux de type sauvage et mutants.
Le détecteur Airyscan a été choisi pour acquérir des instantanés d’épines DD car il offre un rapport signal sur bruit plus élevé et une meilleure résolution que les microscopes confocaux conventionnels19,20. L’imagerie AiryScan permet également l’utilisation de protéines fluorescentes conventionnelles (par exemple, GFP, mCherry, etc.), maintenant largement disponibles pour C. elegans. Bien que des images à plus haute résolution puissent être obtenues avec d’autres méthodes de super-résolution (par exemple, STORM, STED, PALM), ces méthodes nécessitent des protéines fluorescentes photo-activables ou photo-commutables21. Comme alternative à Airyscan, les microscopes confocaux conventionnels sont recommandés. Par exemple, l’imagerie avec acquisition de Nyquist (Figure 3) permet d’obtenir la taille des pixels en utilisant un objectif 40x/1,3 de 123,9 nm, suffisant pour distinguer les types morphologiques de la colonne vertébrale (Figure 2).
Pour déterminer la densité de la colonne vertébrale, il est recommandé d’utiliser une protéine fluorescente cytosolique telle que (1) mCherry ou GFP, (2) LifeAct pour marquer le cytosquelette d’actine ou (3) une protéine fluorescente myristoylée (par exemple, MYR::mRuby) pour marquer la membrane plasmique (Figure 1B). En comparaison, la protéine de liaison à l’actine F, l’utrophine, réduit la densité de la colonne vertébrale (Figure 1C), indiquant un effet négatif sur la morphogenèse de la colonne vertébrale lorsque l’utrophine est surexprimée.
Les méthodes d’imagerie actuelles devraient aider à identifier les variantes génétiques qui régissent la morphologie de la colonne vertébrale 1,16. La morphologie de la colonne vertébrale DD (c.-à-d. mince/champignon, filopodiale, trapue, ramifiée, voir la figure 2) peut être évaluée à partir de projections 2D uniques des images latérales du cordon nerveux ventral puisque la plupart des épines DD adoptent une orientation typiquement dirigée ventralement. Dans ces comparaisons, il est essentiel d’utiliser le même marqueur fluorescent pour chaque condition, car les types morphologiques apparents de la colonne vertébrale semblent être influencés par la méthode d’étiquetage (par exemple, MYR::mRuby vs. LifeAct::GFP). De plus, il a été noté que les formes de la colonne vertébrale sont dynamiques et changent probablement de forme en réponse aux signaux externes 2,16. Ainsi, il est également essentiel de comparer les formes de la colonne vertébrale entre les génotypes à des stades de développement similaires et dans des conditions similaires.
L’orientation du cordon ventral de C. elegans est essentielle pour l’acquisition d’images précises. Les cordons ventral et dorsal des côtés opposés de l’animal doivent être visibles dans le même plan Z, ce qui indique que le ver est orienté sur le côté (figure 1B). Il est préférable de ne pas collecter d’images de vers en mouvement ou en contact avec d’autres vers ou bulles près du cordon ventral, car cela peut dégrader les images d’épines.
Pour l’imagerie calcique in vivo , de nouvelles lames doivent être préparées immédiatement avant chaque acquisition. Il est préférable d’imager les vers en contact avec seulement de fines fibres de colle vs. des « globules » de colle qui ont tendance à dessécher les vers et à dégrader l’image (Figure 4B). Dans l’expérience illustrée à la figure 4, l’impulsion de la lumière de 561 nm active tout le champ de vision. Pour augmenter la résolution temporelle et spatiale afin de détecter les transitoires Ca++ locaux, par exemple, dans les épines DD individuelles, un mini scanner galvo mis en place pour la ligne laser 561 nm peut être utilisé pour stimuler une plus petite région d’intérêt17.
The authors have nothing to disclose.
L’imagerie et l’analyse sur Imaris ont été réalisées dans la ressource partagée d’imagerie cellulaire Vanderbilt (CIRS) prise en charge par les NIH (CA68485, DK20593, DK58404, DK59637 et EY08126). Le LSM 880 est soutenu par la subvention 1S10OD201630. L’imagerie sur un disque rotatif Nikon a été réalisée au Centre d’excellence Nikon. Nous remercions Jenny Schafer, directrice du CISR, et Bryan Millis pour leur formation et leurs discussions perspicaces, ainsi que les membres du laboratoire Burnette : Dylan Burnette, Aidan Fenix et Nilay Taneja pour leurs conseils. Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health à DMM (R01NS081259 et R01NS106951) et une subvention de l’American Heart Association à ACC (18PRE33960581).
All-trans retinal (ATR) | Sigma-Aldrich | R2500-100MG | Necessary cofactor for neuronal excitation with Chrimson |
diH2O | MilliQ | To prepare M9 buffer | |
Ethanol 100% | Sigma | 64-17-5 | To dilute ATR and make control plates for neuronal excitation |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (tricaine) | To immobilize animals for imaging dendritic spines | ||
ImageJ | NIH | (Schindelin J et al., 2012) | Open source image processing software |
KH2PO4 | Fisher Bioreagents | 7758-11-4 | To prepare M9 buffer |
Levamisole hydrochloride | Sigma | 16595-80-5 | To immobilize animals for imaging dendritic spines |
MgSO4 | Fisher Chemical | M63-500 | To prepare M9 buffer |
Microscope cover glass | Fisherbrand | 12542B | To mount animals for microscopy acquisition |
Na2HPO4 | Fisher Scientific | S369-500 | To prepare M9 buffer |
NaCl | Fisher Chemical | S671-3 | To prepare M9 buffer |
NIS Elements version 05.21 | Nikon | To analyze images and movies (e.g., Deconvolution, image alignment) | |
Polybeads carboxylate 0.05um microspheres | Polysciences, Inc | 15913-10 | To immobilize animals for imaging Ca++ transients |
Prism | For statistical analysis and graphing normalized Ca++ transients | ||
SeaKen ME agarose | Lonza | 50014 | To make agarose pads to mount animals for imaging |
Super Glue | The gorilla company | To immobilize animals for imaging Ca++ transients | |
Superfrost microscope slides | Fisherbrand | 22-034-980 | To mount animals for microscopy acquisition |
vaseline | Covidien | 8884430300 | To seal sample for confocal snapshots |
Wax | Fisherbrand | 23-021-399 | Paraplast tissue embedding medium |
Microscope for super-resolution imaging | |||
LSM880 | Zeiss | ||
AiryScan detector | Zeiss | ||
Plan Apochromat (oil) 63x/ 1.40 NA, WD = 0.19 mm | |||
Laser lines | |||
Stage controller | |||
Microscope for Nyquist image acquisition | |||
A1R Confocal | Nikon | ||
Plan Fluor (oil) 40x/1.3 NA, WD 0.24 mm | |||
488 nm, 16mW | |||
561 nm, 17mW | |||
Microscope to monitor evoked Ca++ transients in dendritic spines | |||
Spinning Disk Confocal | Nikon | ||
Andor DU-897 EMCCD camera | |||
Spinning disk Head CSU-X1 | Yokogawa | ||
Apo TIRF (oil) 100x/1.49 NA ,WD 0.12 mm | |||
488 nm, 65mW | |||
561 nm, 86mW | |||
525 nm (+/- 18 nm) | |||
605 nm (+/- 35 nm) |