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方法文章

用于线粒体疾病建模的人脑类器官生成

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DOI：

10.3791/62756

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2021年6月21日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of General Pediatrics, Neonatology and Pediatric Cardiology, Duesseldorf University Hospital, Medical Faculty, Heinrich Heine University, 2Institute of Neurobiology, Heinrich Heine University, 3Berlin Institute for Medical Systems Biology (BIMSB), Max Delbrueck Center for Molecular Medicine (MDC), 4Seaver Autism Center for Research and Treatment, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 5Max Delbrueck Center for Molecular Medicine (MDC)

本文内容

摘要

我们描述了一种详细的人诱导性多能干细胞来源的脑类器官的生成方案，及其在模拟线粒体疾病中的应用。

摘要

线粒体疾病是先天性代谢障碍中最大的一类，目前尚无治愈手段。这类疾病可导致神经发育缺陷，但其潜在机制仍有待阐明。一个主要障碍是缺乏能够重现患者早期神经功能损伤的有效模型。诱导性多能干细胞（iPSCs）技术的进步使得能够生成三维（3D）脑类器官，可用于研究疾病对神经系统发育和结构组织的影响。包括本文作者在内的研究人员近期已引入人类脑类器官来模拟线粒体疾病。本文报道了一种高效生成人源iPSC衍生脑类器官的详细实验方案，并介绍了其在线粒体生物能量学分析及成像研究中的应用。这些实验将有助于利用脑类器官研究代谢和发育功能障碍，并可能为解析线粒体疾病的神经病理机制提供关键信息。

引言

线粒体疾病是先天性代谢缺陷中最大的一类1。其病因是基因突变导致多种线粒体功能障碍，包括氧化磷酸化（OXPHOS）2、呼吸链组装、线粒体动力学以及线粒体DNA的转录或复制异常3。能量需求较高的组织尤其容易受到线粒体功能障碍的影响4。因此，线粒体疾病患者通常会出现早发性神经系统症状。

目前尚无针对线粒体疾病患儿的可用治疗方法5。线粒体疾病药物研发的主要障碍之一在于缺乏能够有效模拟人类疾病进程的模型6。目前研究的多种动物模型均未表现出患者中存在的神经学缺陷7。因此，线粒体疾病神经病理学背后的机制仍未被完全阐明。

近期研究从线粒体疾病患者中生成了诱导多能干细胞（iPSCs），并利用这些细胞获得了患者特异性的神经元细胞。例如，与线粒体疾病Leigh综合征相关的基因缺陷已被发现会导致细胞生物能量学8,9、蛋白质合成10以及钙稳态9,11出现异常。这些研究报告为线粒体疾病中发生的神经元功能障碍提供了重要的机制性线索，也为这些目前无法治愈的疾病的新药研发开辟了道路12。

然而，二维（2D）培养无法用于研究三维（3D）器官的结构复杂性和区域组织特性13。为此，利用患者特异性诱导多能干细胞（iPSCs）衍生的三维脑类器官14，可能使研究人员获得额外的重要信息，从而有助于解析线粒体疾病如何影响神经系统的发育与功能15。目前，已有研究采用iPSC来源的脑类器官来探究线粒体疾病，逐步揭示其神经发育层面的病理机制。

携带与线粒体脑肌病、乳酸酸中毒及卒中样发作综合征（MELAS）相关突变的脊髓类器官表现出神经发生缺陷以及运动神经元分化延迟16。源自患有线粒体疾病——Leigh综合征患者的大脑皮层类器官显示体积减小、神经上皮芽生成缺陷以及皮层结构的丧失17。来自Leigh综合征患者的脑类器官研究表明，该疾病的缺陷起始于神经前体细胞水平，这些细胞无法有效启动线粒体代谢，从而导致异常的神经元分支和形态发生18。因此，神经前体细胞可能代表了线粒体疾病的一个潜在细胞治疗靶点，促进其线粒体功能的策略可能有助于神经系统功能的正常发育。

脑类器官的使用可能有助于揭示线粒体疾病的神经发育组分。线粒体疾病主要被视为早发性神经退行性疾病5。然而，患有线粒体疾病的患者也存在神经发育缺陷，包括发育迟缓和认知障碍19。患者特异性的脑类器官可能有助于研究这些方面，并阐明线粒体疾病如何影响人类大脑发育。线粒体功能障碍还可能在其他更常见的神经系统疾病中发挥致病作用，例如阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病4。因此，利用脑类器官阐明线粒体缺陷对神经发育的影响，也可能对这些疾病的研究具有重要意义。本文描述了一种生成可重复性脑类器官的详细方案，可用于线粒体疾病的疾病建模研究。

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方案

注意：使用人类诱导多能干细胞（iPSCs）可能需要获得伦理审批。本研究中使用的iPSCs系在获得当地伦理批准（#2019-681）后，从健康对照个体中分离获得。所有细胞培养操作均须在无菌细胞培养超净台内进行，并在转移至超净台前仔细对所有试剂和耗材进行消毒。用于分化的iPSCs传代次数应低于50代，以避免长期培养可能导致的基因组异常。在类器官生成前，应验证细胞的多能性状态，例如通过检测多能性相关标志物NANOG或OCT4的表达水平。应每周进行支原体检测，以确保细胞培养物无支原体污染。

1. 脑类器官的生成

  1. 人iPSC的培养
    1. 将人iPSC在包被的6孔板中，使用无饲养层条件的iPSC培养基（见材料表）进行培养，并置于37 °C、5% CO2的湿润组织培养孵箱中。
      ​注意：饲养层细胞的残留可能阻碍类器官的分化。至少在无饲养层条件下传代一次。
    2. 当细胞融合度达到80%时，使用无酶解离培养基以1:4至1:12的比例传代iPSC。为提高细胞存活率，每次传代后加入10 µM Rho相关蛋白激酶（ROCK）抑制剂（Y27632）。
  2. 解离iPSC（80%融合度）—第0天
    1. 配制皮质分化培养基I（CDMI）（表1）。在加入细胞前，将CDMI培养基于室温（22–25 °C）预温。
    2. 用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗含iPSC的孔，以去除死细胞和碎片。
    3. 每孔加入500 µL预温的试剂A（材料表），在37 °C孵育5分钟。在显微镜下观察以确认细胞已解离。
    4. 加入1 mL iPSC培养基以稀释试剂A，中和其活性。
    5. 使用1000 µL移液器反复吹打使细胞解离，将细胞悬液转移至15 mL离心管中。
    6. 在室温（22–25 °C）下以125 × g轻柔离心5分钟。
    7. 小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。
    8. 用1 mL CDMI重悬沉淀，获得单细胞悬液，并计数细胞数量。
    9. 配制接种培养基：每100 µL CDMI中加入9,000个iPSC，并补充20 µM ROCK抑制剂、3 µM WNT/β-catenin抑制剂（IWR1）和5 µM SB431542。
    10. 每孔加入100 µL接种培养基至96孔V型底板中。
    11. 将培养板置于37 °C、5% CO2的湿润组织培养孵箱中。
  3. 神经球生成
    1. 第1天，观察到具有清晰光滑边界的圆形细胞聚集体（神经球）正在形成。注意聚集体周围的死细胞。继续在37 °C、5% CO2孵箱中培养。
    2. 第3天，轻敲培养板侧面三次，通过振荡去除死细胞。
    3. 每孔加入100 µL CDMI，补充20 µM ROCK抑制剂、3 µM IWR1和5 µM SB431542。
    4. 将培养板放回37 °C、5% CO2的孵箱中。
    5. 第6天，小心从每孔中吸除80 µL上清液，避免接触孔底。
    6. 每孔加入100 µL CDMI，补充3 µM IWR1和5 µM SB431542。将培养板放回37 °C、5% CO2的孵箱中。
    7. 从第6天起，每3天重复步骤5和6，直至第18天。
  4. 神经球转移
    1. 第18天，配制皮质分化培养基II（CDMII）（表1），并将10 mL加入100 mm超低吸附细胞培养皿中。
    2. 使用剪去尖端的200 µL移液枪头，将圆形神经球从96孔板转移至100 mm超低吸附细胞培养皿中。
      注意：操作应轻柔，确保枪头开口足够宽，避免过快吸取导致神经球受损。
    3. 从含神经球的培养皿中吸除5 mL培养基，并加入5 mL新鲜CDMII。
      注意：此步骤有助于减少因神经球转移而残留的CDMI培养基量。
    4. 将培养皿置于37 °C、5% CO2的湿润组织培养孵箱内的轨道摇床上，以70 rpm振荡。
      注意：次日进行肉眼观察神经球状态。若神经球发生聚集或贴附于皿底，可适当提高轨道摇床转速。
    5. 每3天小心吸除上清液，更换为新鲜CDMII。保留少量培养基以防止神经球干燥。
    6. 第35天，配制皮质分化培养基III（CDMIII）（表1）。
      注意：基质成分应在冷的CDMIII中溶解。
    7. 吸除培养皿中的培养基，加入10 mL冷的CDMIII。
      注意：使用冷培养基更有效，可使基质成分均匀包被类器官而不形成团块。
    8. 换液后，将培养皿重新置于37 °C、5% CO2的湿润组织培养孵箱内轨道摇床上，以70 rpm振荡。
    9. 根据培养基颜色指示的生长速率，每3–5天更换一次培养基。
    10. 第70天，配制皮质分化培养基IV（CDMIV）（表1）。此后使用CDMIV培养基，直至类器官达到所需培养时间。在此期间，将培养皿持续置于37 °C、5% CO2的湿润组织培养孵箱内，轨道摇床保持70 rpm。
    11. 根据生长速率，每3–5天更换一次培养基。

2. 脑类器官的免疫染色

  1. 组织制备
    1. 配制 4% 多聚甲醛（PFA）溶液，并置于通风橱中。
      注意：操作 PFA 时请穿戴个人防护装备。
    2. 收集脑类器官，使用钝头 3 mL 塑料巴斯德移液管轻柔地将其转移至盛有 PFA 的 6 孔板中。
      注意：建议使用培养时间超过 40 天的类器官，以便观察具有更高细胞复杂性的结构。
    3. 在室温下将类器官置于 PFA 溶液中固定 1 小时。
    4. 用 3 mL 塑料巴斯德移液管小心吸除 PFA，并用 PBS 洗涤固定后的类器官三次。
    5. 将固定好的类器官保存在 4 °C 的 PBS 中，待后续使用。
  2. 脑类器官切片制备
    1. 配制 3% 琼脂溶液，缓慢加热至完全液化。
    2. 将模具（10 mL 注射器的切端）放置在一张吸水滤纸上（光滑面朝上），并在其上滴加一滴琼脂液。
    3. 用刮匙迅速从 6 孔板中取出单个类器官，并用滤纸吸去多余的 PBS。
      注意：避免滤纸直接接触类器官。
    4. 将类器官放置在琼脂液滴上。
    5. 重复此操作，最多可处理三个类器官。
      注意：操作需迅速，以防止琼脂在此过程中凝固。
    6. 继续向模具中添加琼脂，直至完全覆盖所有类器官。
    7. 等待琼脂开始凝固，然后将包含类器官的整个模具（连同吸水滤纸）轻柔转移至冷却装置上。
      注意：若无冷却装置，可将模具短暂置于 4 °C 冰箱中数分钟。
    8. 同时准备切片操作：将剃刀刀片（用丙酮清洗并以双蒸水冲洗干净）安装至振动切片机（vibratome）刀架上，固定于浴槽中，并加入 PBS。
    9. 将模具从（已凝固的）琼脂中取出，使用解剖刀修整成方形块状。
    10. 使用粘附凝胶（见材料表）将含类器官的琼脂块固定在振动切片机的载片板上，并放入含 PBS 的浴槽中。
    11. 调节振动切片机（见材料表），设置切片厚度为 150 µm。
      注意：振动切片机的参数设置（刀片角度、振幅、频率和速度）可参考用于新生早期动物固定脑组织切片的条件。然而，最佳参数高度依赖于所用振动切片机的型号，需在初次操作时优化，以避免切片过程中组织变形或撕裂。
    12. 开始切片操作。使用玻璃移液管或刮匙将每一片新切下的组织轻柔转移至盛有 PBS 的 24 孔板中。
    13. 将含有切片的 24 孔板置于 4 °C 保存（可保存数天），待后续处理。
    14. 使用玻璃移液管或刮匙将切片从孔板中转移至载玻片上。每张载玻片至少放置 2 片切片。
    15. 用注射器小心去除琼脂和多余的 PBS。
    16. 让切片自然干燥，直至其牢固贴附于载玻片上。
      注意：虽然载玻片可暂时储存在盛有 PBS 的塑料染色缸中（4 °C），但建议在切片完成后尽快进行染色。
  3. 免疫组织化学染色
    1. 配制封闭液（见表 1）。
    2. 使用 PAP 笔在载玻片上的切片周围画出疏水性边界，以防止液体扩散。
    3. 小心地将封闭液滴加至载玻片上，在室温（22–25 °C）孵育 1 小时。为避免损伤组织，切勿将液体直接滴在切片表面。
    4. 吸除封闭液，加入用封闭液稀释的目标一抗。
    5. 将载玻片置于湿盒中，于 4 °C 过夜孵育。
    6. 用 1× PBS 漂洗载玻片三次，每次 10 分钟。
    7. 在避光条件下，加入用封闭液稀释的特异性二抗，并同时进行 Hoechst 染色（1:2,500），室温孵育 1 小时。
      注意：请务必设置阴性对照，以确认无非特异性结合或自发荧光。
    8. 在避光条件下，用 1× PBS 漂洗三次，每次 10 分钟。
    9. 在切片上滴加一滴封片剂，将盖玻片边缘接触液滴，缓慢放下盖玻片，避免产生气泡。
    10. 将载玻片在室温下静置过夜。在盖玻片边缘涂抹指甲油以进一步密封。如需长期保存，应置于 4 °C 保存。
  4. 染色结果记录
    1. 为获取大视野图像并进行拼接，使用配备高精度物镜的电动直立式宽场显微镜（详见材料表），并配置以下滤光片组：DAPI 滤光片组（例如，激发光（EX）：340–380 nm，二向色镜（DM）：400 nm，发射滤光片（BA）：435–485 nm）；异硫氰酸荧光素（FITC）滤光片组（例如，EX：465–495 nm，DM：505 nm，BA：515–555 nm）；Alexa594 滤光片组（例如，ET 575/40；T 600 LPXR；HC 623/24）；数字相机；高性能图像采集软件，支持自动拼接与层叠操作。
    2. 图像处理时，使用具备生成 8 位 tif 文件、裁剪拼接图像、调节对比度与亮度、合并通道（如蓝、绿、红）以及添加比例尺功能的图像处理软件。
    3. 为观察细节，使用配备高精度物镜、紫外激光（EX：408 nm）、氩离子激光（EX：488 nm）、氦氖激光（EX：543 nm）以及共聚焦显微镜成像软件的电动共聚焦激光扫描显微镜。
    4. 处理细节图像时，使用具备生成共聚焦 z 层叠图像的最大强度投影（例如，每层光学切片厚度为 0.6 µm）、生成 8 位 tif 文件、调节对比度与亮度、合并通道（如蓝、绿、红）以及添加比例尺功能的图像处理软件。
    5. 使用图形编辑软件对图像进行排版。

3. 脑类器官的生物能量谱分析

  1. 用于能量代谢分析的类器官制备
    1. 按照制造商提供的方案配制木瓜蛋白酶和DNase溶液。
    2. 将3–5个类器官转移至6孔板中，用预热的PBS洗涤两次。
    3. 加入2 mL预热的含DNase的活化木瓜蛋白酶溶液，使用刀片将类器官切割成小块。
    4. 将培养板置于细胞培养箱内（37 °C，5% CO2）的轨道摇床上，设置转速为27 rpm，孵育15–20分钟。
      注：孵育时间取决于类器官的发育阶段。早期阶段的类器官可直接使用；对于培养超过3个月的类器官，建议在解离前将其切成2–3小块，并在37 °C、27 rpm振荡条件下孵育15–20分钟。该步骤有助于去除晚期类器官中可能存在的坏死组织。
    5. 将消化后的组织收集至15 mL离心管中，加入5 mL类器官培养基CDMIV（表1）。
    6. 用10 mL塑料移液管反复吹打10–15次以充分解离组织，静置使未解离的组织块沉降至管底。
    7. 小心地将细胞悬液转移至另一15 mL离心管中，避免转移未解离的组织块。使用40 µm细胞筛网过滤溶液（例如带筛网帽的聚苯乙烯圆底管）。
    8. 在室温下以300 × g 离心5分钟，收集细胞沉淀。
    9. 使用台盼蓝评估细胞数量和活力。
    10. 将所需数量的细胞（约20,000/孔）接种至包被的96孔微孔板中。接种后6–8小时更换为神经元培养基（表1）。
    11. 将包被的96孔微孔板置于CO2培养箱（37 °C，5% CO2）中孵育4天。
  2. 能量代谢分析
    1. 在解离细胞重新接种后的第3天，向96孔微孔板底部每孔加入200 µL校准液，并将顶部绿色传感器盒插入已水化的微孔板上。
      注：请将传感器盒以正确方向放置于微孔板上，并确保校准液覆盖所有传感器。
    2. 将已水化的96孔微孔板置于不含CO2的培养箱中，37 °C过夜孵育。
    3. 开启分析仪，使仪器在37 °C下稳定过夜。
    4. 在重新接种后的第4天，在显微镜下检查96孔板中的解离类器官培养状态，确认细胞形成融合单层。
    5. 配制检测培养基（表1）。
    6. 使用移液器从所有孔中吸除神经元培养基，注意不要触碰孔底以避免损伤细胞。也可将整块板小心倒置后在洁净滤纸上吸干。操作应迅速，以防细胞死亡。
    7. 用预热的200 µL检测培养基洗涤细胞两次，每孔最终加入180 µL检测培养基。将96孔微孔板置于不含CO2的培养箱中，37 °C孵育1小时。
    8. 在检测培养基中配制10 µM的线粒体抑制剂溶液。注意：注射后的终浓度为1 µM。
    9. 向已水化微孔板上的传感器盒各加样孔中加入10倍浓度的线粒体抑制剂溶液。
      1. 向A孔加入18 µL线粒体抑制剂1。
      2. 向B孔加入19.8 µL线粒体抑制剂2。
      3. 向C孔加入21.6 µL线粒体抑制剂2。
      4. 向D孔加入23.4 µL线粒体抑制剂3。
    10. 将加载完成的传感器盒放回已水化的微孔板中，置于不含CO2的培养箱中37 °C保存，直至开始检测。
    11. 在仪器软件中设置运行程序（表2）。
    12. 点击START，从不含CO2的培养箱中取出加载好的传感器盒，放入分析仪中进行校准。
      注：确保微孔板以正确方向插入，且不带盖。
    13. 校准步骤完成后，移除校准板，从不含CO2的培养箱中取出96孔细胞培养微孔板并放入分析仪中，点击CONTINUE开始测量。
    14. 运行结束后，从分析仪中取出96孔细胞培养微孔板，收集各孔中的培养基，注意不要扰动细胞。
      注：收集的培养基可于-20 °C保存，后续使用合适的乳酸检测试剂盒测定细胞释放至培养基中的乳酸含量。
    15. 每孔加入200 µL 1x PBS洗涤细胞。
    16. 吸除PBS后，将微孔板在-20 °C冷冻保存。
      注：冷冻后的微孔板可用于定量各孔中的细胞数、蛋白质或DNA含量，这些数据将用于标准化所获得的能量代谢速率。请遵循制造商提供的细胞、蛋白质或DNA定量检测方案说明。

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结果

本方案可高效生成球形类器官(图1A)。所生成的类器官包含成熟的神经元，可通过特异性标记轴突（SMI312）和树突（微管相关蛋白2（MAP2））的蛋白标志物进行观察(图1B)。成熟的类器官不仅含有神经元细胞（MAP2阳性），还含有胶质细胞（例如，星形胶质细胞标志物S100钙结合蛋白B（S100ß）阳性）(图1B)。

通过使用共聚焦显微镜分析切片后的脑类器官，可以识别并监测不同类型细胞及细胞结构的详细分布与组织方式。这有助于深入了解线粒体疾病可能如何影响神经系统发育。例如，可监测神经元轴突（SMI312阳性）和树突（MAP2阳性）(图2A)，或神经元细胞（MAP2阳性）与胶质细胞（S...

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讨论

本文描述了人诱导多能干细胞（iPSC）来源的脑类器官的可重复生成方法及其在线粒体疾病建模中的应用。此处所述方案基于先前发表的研究20进行了改进。本方案的一个主要优势在于无需将每个类器官手动包埋至支架基质中。实际上，基质溶液只需直接溶解于细胞培养基中即可。此外，无需使用昂贵的生物反应器，类器官可在置于培养箱内轨道摇床中的标准组织培养6孔板中进行培养。该方法还支持同时培养多个含有来自不同个体细胞系的类器官的培养板，从而提高实验通量，并允许监测不同类器官在生长特征上可能出现的差异。我们使用来自健康对照者及线粒体疾病患者的多种iPSC对该方案进行了测试，结果具有一致性。

在构建线粒体疾病模型时，必须使用不同的标记物来观察线粒体网络的形态和组织结构。该方法可用于研究源自线粒体疾病患者的脑类器官中，线粒体的数量、形态或分布是否可能发生改变。脑类器官中神经前体细胞的存在及其组织结构对于模拟线粒体疾病可能具有关键意义。我们最近发现，导致线粒体疾病——Leigh综合征的突变会破坏患者来源的脑类器官中神经前体细胞的细胞结构及其分布

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披露

作者声明不存在任何竞争性财务或非财务利益。

致谢

感谢 Miriam Bünning 提供的技术支持。本研究得到了德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG）（项目号 PR1527/5-1，授予 A.P.）、Spark 基金会与柏林健康研究所（Berlin Institute of Health, BIH）（BIH 验证基金，授予 A.P.）、联合线粒体病基金会（United Mitochondrial Disease Foundation, UMDF）（Leigh 综合征国际联盟基金，授予 A.P.）、杜塞尔多夫大学医院（University Hospital Duesseldorf，UKD 研究委员会基金，授予 A.P.）以及德国联邦教育与研究部（Bundesministerium für Bildung und Forschung, BMBF）（e:Bio 青年研究员基金，编号 AZ 031L0211，授予 A.P.）的支持。C.R.R. 实验室的工作还获得了德国研究基金会（DFG）（项目 FOR 2795 "Synapses under stress"，项目号 Ro 2327/13-1）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-巯基乙醇Gibco31350-010
Affinity DesignerSerif (Europe) Ltd排版软件；矢量图形编辑器
Alexa Fluor 488 驴抗豚鼠抗体Sigma AldrichSAB4600033-250UL1:300
Alexa Fluor 488 驴抗小鼠抗体Thermo Fisher ScientificA-315711:300
抗霉素ASigma Aldrich1397-94-0
抗-β-微管蛋白III (TUJ-1)Sigma AldrichT85781:2000
氩离子激光器Melles Griot其他任何激光器，例如发射488 nm的二极管激光器也可使用
抗坏血酸SigmaA92902
含维生素A的B-27添加剂Gibco17504044
Bacto 琼脂Becton Dickinson3% PBS溶液，储存于-20 °C
BDNFMiltenyi Biotec130-093-0811
cAMPSigmaD0627
Cell Star 细胞培养6孔板Greiner-Bio-One657160
化学成分明确的脂质浓缩液Gibco11905031
共聚焦激光扫描显微镜C1Nikon Microscope Solutions模块化共聚焦显微镜系统
Corning Matrigel 生长因子减少型（GFR）基底膜基质，无酚红，无LDEVCorning356231基质组分
CyQUANT 细胞增殖检测试剂盒Thermo FisherC7026
DMEM/F12ThermoFisher31330038
DMSOSigmaD2660-100ML
驴抗山羊Cy3抗体Merck MilliporeAP180C1:300
驴抗小鼠Cy3抗体Merck MilliporeAP192C1:300
驴抗兔Cy3抗体Merck MilliporeAP182C1:300
DPBSGibco14190250
DS-Q1Mc相机Nikon Microscope Solutions
Eclipse 90i 直立宽场显微镜Nikon Microscope Solutions
Eclipse E 600FN 直立显微镜Nikon Microscope Solutions
Eclipse Ts2 倒置显微镜Nikon Microsope Solutions
EZ-C1 Silver Version 3.91Nikon Microscope Solutions共聚焦显微镜成像软件
FCCPSigma Aldrich370-86-5
胎牛血清Gibco10270-106
GDNFMiltenyi Biotec130-096-291
格拉斯哥MEMGibco11710-035
玻璃巴斯德吸管Brand747715倒置使用
GlutamaxGibco35050-061
氦氖激光器Melles Griot其他任何激光器，例如发射594 nm的二极管激光器也可使用
肝素MerckH3149-25KU
HERACell 240i CO2 培养箱Thermo Scientific51026331
Hoechst 33342InvitrogenH35701:2500
Image J 1.53cWayne Rasband 国立卫生研究院图像处理软件
Injekt Solo 10 mL/鲁尔接头Braun4606108V
Knockout 血清替代物Gibco10828010
激光器（407 nm）Coherent其他任何激光器，例如发射407 nm的二极管激光器也可使用
Map2Synaptic SystemsNo. 1880041:1000
Maxisafe 2030i
MEM NEAAGibco11140-050
mTeSR PlusStemcell Technology85850iPSC培养基
Multifuge X3R 离心机Thermo Scientific10325804
MycoAlert 支原体检测试剂盒Lonza# LT07-218
N2添加剂Gibco17502-048
一次性使用针头（23G x 1” TW）Neoject10016
NIS-Elements Aadvanced Research 3.2Nikon成像软件
寡霉素ASigma Aldrich75351
Heidolph Unimax 1010 轨道摇床Heidolph543-12310-00
PAP笔SigmaZ377821-1EA用于在载玻片上绘制疏水屏障
木瓜蛋白酶解离系统试剂盒WorthingtonLK003150
多聚甲醛Merck8187154% PBS溶液，储存于-20 °C
巴斯德吸管 7mLVWR612-1681刻度至3 mL
青霉素-链霉素Gibco15140-122
Plan Apo VC 20x / 0.75 空气 DIC N2  ∞/0.17 WD 1.0Nikon Microscope Solutions干式显微镜物镜
Plan Apo VC 60x / 1.40 油镜 DIC N2 ∞/0.17 WD 0.13Nikon Microscope Solutions油浸显微镜物镜
聚苯乙烯培养皿（100 mm）Greiner Bio-One664161
带细胞筛盖的聚苯乙烯圆底管（5 mL）Falcon352235
氯化钾Roth6781.1
ProLong Glass 抗荧光淬灭封片剂InvitrogenP36980
定性滤纸VWR516-0813
ROCK抑制剂MerckSCM075
鱼藤酮Sigma83-794
S100βAbcamAb111781:600
SB-431542Cayman Chemical Company13031
手术刀片Heinz Herenz Hamburq1110918
SMI312Biolegend8379041:500
碳酸氢钠Merck/Sigma31437-1kg-M
氯化钠Roth3957
磷酸二氢钠Applichem131965
丙酮酸钠Gibco11360070
SOX2Santa Cruz BiotechnologySc-173201:100
StemPro Accutase 细胞解离试剂Gibco/StemProA1110501试剂A
超级胶水凝胶UHU63261粘合凝胶
SuperFrost PlusVWR631-0108
一次性使用注射器（1 mL）BD Plastipak300015
TB2 恒温模块Biometra
TC 24孔培养板Sarstedt83.3922
TC 6孔培养板Sarstedt83.392
TGFbeta3Miltenyi Biotec130-094-007
组织培养罩ThermoFisher51032711
TOM20Santa Cruz BiotechnologySC-114151:200
Triton-XMerckX100-5ML
UltraPure 0.5M EDTAInvitrogen15575020
振动切片机 Microm HM 650 VThermo Scientific已停产，其他任何可调式切片机亦可使用
振动切片机 Wilkinson Classic 剃刀刀片Wilkinson Sword70517470
Whatman BenchkoteMerck/Sigma28418852
Wnt拮抗剂IEMD Millipore Corp3378738
XF 96 细胞外通量分析仪Seahorse Bioscience100737-101
XF 检测用DMEM培养基Seahorse Bioscience103680-100
XF 校准液Seahorse Bioscience100840-000
XFe96 FluxPak（96孔微孔板）Seahorse Bioscience102416-100

参考文献

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