本文介绍了一种利用光学透明硅胶窗进行长期活体成像的方法，该窗口可直接粘接于目标组织/器官及皮肤上。 与其他目前常用的方法相比，这些窗口成本更低且更具灵活性，且手术植入过程对动物造成的炎症反应和不适程度较轻。
本文介绍了一种利用光学透明硅胶窗进行长期活体成像的方法，该窗口可直接粘接于目标组织/器官及皮肤上。 与其他目前常用的方法相比，这些窗口成本更低且更具灵活性，且手术植入过程对动物造成的炎症反应和不适程度较轻。
活体显微成像（IVM）能够在单细胞分辨率下可视化细胞的运动、分裂和死亡过程。通过手术植入成像窗口进行IVM尤其强大，因为它允许对同一组织进行数天至数周的纵向观察。传统的成像窗口通常由生物相容性金属框架中的玻璃盖玻片构成，并缝合至小鼠皮肤上。这类窗口可能限制小鼠的自由活动，引发强烈的炎症反应，并可能因玻璃破裂或缝线撕裂而失效，这些情况均可能导致需要实施安乐死。为解决这些问题，研究人员开发了用于长期腹部器官和乳腺成像的成像窗口 ，该窗口采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）薄膜制成，PDMS是一种光学透明的硅基聚合物，此前已被用于颅脑成像窗口。这种窗口可直接粘附于组织表面，缩短了植入所需时间。PDMS具有良好的柔韧性，有助于其在小鼠体内长期保持结构完整性——已有实验验证其可持续使用长达35天。纵向成像指在不同时间点对同一组织区域进行多次成像。本研究在窗口内部嵌入不锈钢网格，以精确定位相同区域，从而能够在相隔数天的成像中观察同一位置的动态生物学过程（如乳腺退化）。该硅胶窗口还实现了对单个播散性癌细胞随时间发展为微转移灶的持续监测。与金属框玻璃窗口相比，本研究所用的硅胶窗口植入更简便，且对成像组织引起的炎症反应较轻微。此外，内置的网格结构使得在重复成像过程中能够简便地追踪同一组织区域。
活体显微成像（IVM）是一种对麻醉动物体内组织进行成像的技术，可在完整组织中以细胞分辨率揭示生理和病理过程的动态变化。该技术的应用范围广泛，尤其在癌症生物学领域发挥了重要作用，有助于阐明癌细胞如何侵袭组织并发生转移、如何与周围微环境相互作用，以及对药物的响应机制。1,2,3此外，IVM 已成为深入理解调控免疫反应的复杂机制的关键手段，所提供的见解可与 离体 分析方法（例如流式细胞术）。例如，活体成像实验已揭示了与细胞迁移和细胞间接触相关的免疫功能的详细信息 并为量化损伤或感染后的时空动态提供了平台4,5,6,7许多此类过程也可通过组织学染色进行研究，但只有活体显微成像（IVM）能够追踪动态变化。事实上，组织学切片仅能提供特定时间点的组织静态图像，而活体成像则可在同一组织中随时间推移追踪细胞间和亚细胞水平的事件。特别是，荧光标记技术的进步以及分子报告系统的开发，使得分子事件能够与细胞行为（如增殖、死亡、运动性以及与其他细胞或细胞外基质的相互作用）相关联。大多数IVM技....
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所述所有操作均遵循冷泉港实验室外科指南进行，并已获得冷泉港实验室机构动物护理与使用委员会的批准。
1. 铸造硅胶窗口
2. 准备小鼠以植入硅胶窗
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通过成像窗口进行活体成像可用于在数小时至数周的时间内，以单细胞分辨率观察、追踪和定量多种细胞与分子事件。理想的成像窗口应具备以下特性：a）对小鼠的健康状况及组织生理状态影响较小；b）具有良好的耐用性；c）植入操作简便；d）具备清晰的定位标志，便于对同一区域进行重复成像。该方法最终获得一种多功能、惰性的硅胶窗口，易于制备和植入，并可配备网格标记，以便在多次成像过程中准确定位同一视野区域。
窗口由PDMS制成，这是一种价格低廉、柔韧且透明的材料。大多数实验室均可方便地采购到相关材料来浇铸窗口。为此，可使用 commercially available 24孔板盖上已蚀刻好的圆形模具（直径22 mm），效果良好。通过调节单位面积上使用的聚合物用量，可以控制窗口的厚度。为了记录窗口厚度对成像分辨率的影响，采用40 nm荧光微球进行点扩散函数（PSF）分析，以比较通过不同厚度PDMS窗口的成像效果与通常用于活体成像窗口的玻璃盖玻片（厚0.17 mm）的成像效果。为了模拟活体成像所用的实验设置，PSF成像使用相同的双光子显微镜和水浸物镜，并以超声耦合凝胶作为浸没介质进行。
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活体成像窗口是用于随时间推移以细胞分辨率直接观察生理和病理过程的重要工具。本文所述的在小鼠体内铸造并植入柔性硅胶成像窗口的新方法，克服了目前常用成像窗口存在的一些常见问题（如渗出、破裂以及对正常活动的干扰），提高了小鼠的安全性，并增强了该技术的可操作性。
目前最常用的成像窗由一个金属框架和固定在其上的玻璃盖玻片组成。使用这类典型成像窗的主要障碍在于，固定金属环需要繁琐的缝合操作，因而要求操作人员具备高级外科手术技能。此外，制造这些金属框架成本较高，且需要专用设备。PDMS 成像窗克服了上述两个问题。插入 PDMS 成像窗的操作无需缝合，显著降低了该技术的学习门槛。制作该成像窗的材料成本低廉，且易于采购。此外，该成像窗的形状以及手术操作均可根据需要进行调整，适用于对乳腺、肝脏、胰腺、脾脏和肠道等多种器官的成像。
尽管现有的活体成像窗口通常可支持数天的纵向成像，但一些常见问题限制了其应用 长时间使用这些窗口。玻璃窗的重量和尺寸可能妨碍小鼠的自由活动，且渗出物可能在窗口处积聚。小鼠还可能损坏玻璃盖玻片，导致伤口和感染。相比.......
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M.E. 是 Insmed 公司关于 brensocatib 的研究咨询委员会成员；Vividion Therapeutics 公司科学咨询委员会成员；Protalix 公司顾问；并持有 Agios Pharmaceuticals 公司股份。D.A.T. 是 Mestag Therapeutics 公司的联合创始人，并在 Mestag Therapeutics、Leap Therapeutics、Surface Oncology 和 Cygnal Therapeutics 公司担任科学咨询委员会成员且持有股份。其他作者声明不存在竞争利益。
感谢 Rob Eifert 在设计和优化激光切割不锈钢网格方面提供的帮助。本工作由冷泉港实验室癌症中心（P30-CA045508）以及美国国立卫生研究院（NIH）对 M.E. 的资助（1R01CA2374135 和 5P01CA013106-49）、冷泉港实验室（CSHL）与北威尔健康（Northwell Health）、Thompson 家族基金会、Swim Across America 组织，以及西蒙斯基金会（Simons Foundation）对冷泉港实验室的资助支持。M.S. 受美国国立卫生研究院下属国家普通医学科学研究所医学科学家培训项目培训奖（T32-GM008444）以及 NIH 国家癌症研究所奖项 1F30CA253993-01 的支持。L.M. 获得詹姆斯·S·麦克唐纳基金会博士后奖学金的支持。J.M.A. 是癌症研究所/欧文顿博士后奖学金（CRI 奖项 #3435）的获得者。D.A.T. 受 Lustgarten 基金会胰腺癌研究专用实验室及 Thompson 家族基金会的支持。示意图使用 Biorender.com 制作。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
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| 酒精棉片 | BD | 326895 | |
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| c-fms-EGFP（MacGreen）小鼠 | Jackson Laboratory | 18549 | |
| C57BL/6J 小鼠 | Jackson Laboratory | 664 | |
| CD45 单克隆抗体（30-F11） | Invitrogen | 14-0451-82 | |
| CD68 抗体 | Abcam | ab125212 | |
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| 驴抗山羊 IgG H&L（HRP） | Abcam | ab6885 | |
| 驴抗兔 IgG H&L（HRP） | Abcam | ab97064 | |
| 驴抗大鼠 IgG H&L（HRP） | Abcam | ab102182 | |
| Dow SYLGARD 184 硅胶封装剂（透明） | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | 双组分，混合比例 10:1 |
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| LysM-eGFP 小鼠 | www.mmrrc.org | 012039-MU | |
| 显微解剖镊 | Roboz | RS-5135 | 带齿，轻微弯曲，0.8 mm 尖端宽度；4" 长度 |
| 显微解剖镊 | Roboz | RS-5153 | 1×2 齿，轻微弯曲，0.8 mm 尖端 宽度，4" 长度 |
| MTS MiniBionix II 808 | MTS Systems | 伺服液压材料试验机 | |
| 中性粒细胞弹性蛋白酶 680 FAST 探针 | PerkinElmer | NEV11169 | |
| 氮气 | General Welding Supply Corp. | ||
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| Reflex 7 伤口夹 | Roboz Surgical | RS-9255 | |
| 不锈钢网格 | Fotofab | 单个网格直径为 0.200 英寸，共包含 52 个独立网格方格，每个方格尺寸为 0.016 × 0.016 英寸。每个方格之间间距为 0.003 英寸。 | |
| 表面处理无菌组织培养板 | Fisher Scientific | FB012929 | 盖子用作成像窗的固化表面 |
| TriM Scope 多光子显微镜 | LaVision BioTec | 成像使用直立式双光子显微镜（Trimscope，LaVision BioTec），配备两台钛宝石激光器（Mai Tai 和 InSight，Spectra-Physics）和一个光学参量振荡器。使用以下长通二向色镜（Chroma）将信号引导至四个光电倍增管： T560LP T665LPXXR T495lxpr | |
| Vetbond | 3M | 70200742529 | |
| VWR 显微盖玻片 | VWR | 48404-453 |
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