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一种用于研究肝细胞癌中肿瘤-间质相互作用的三维球状模型

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DOI：

10.3791/62868

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2021年9月30日

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1Department of Biochemistry, Faculty of Pharmacy, Minia University, 2National Institute for Health Research Birmingham Liver Biomedical Research Unit and Centre for Liver and Gastrointestinal Research, Institute of Immunology and Immunotherapy, University of Birmingham, 3Newcastle Fibrosis Research Group, Biosciences Institute, Faculty of Medical Sciences, Newcastle University, 4Newcastle University Translational and Clinical Research Institute, Faculty of Medical Sciences, Newcastle University, 5The Liver Unit, Department of Medicine, Freeman Hospital, Newcastle-upon-Tyne Hospitals NHS Foundation Trust

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

全面的 体外 缺乏能够真实再现相关人类疾病的模型。本研究介绍了三维（3D）肿瘤球体的构建与培养，一种可靠的 体外 研究人肝细胞癌中肿瘤-间质相互作用的工具。

摘要

肝细胞癌（HCC）是肝癌的主要类型，其侵袭性强，且缺乏耐受性良好、疗效广泛的晚期治疗手段，这使其成为癌症相关死亡的第二大常见原因。为了筛选出最具潜力的治疗候选方案以推进临床开发，并助力实现个体化医疗，需要对临床前模型进行优化，以更好地模拟人类疾病的实际情况。三维（3D）细胞球状体模型作为一种新兴的 体外 二维（2D）单层培养的替代方法。在此，我们描述一种三维肿瘤球状体 利用单个细胞在悬滴培养条件下聚集能力的模型，更能代表一种 体内 相较于标准的单层培养，三维球状体能更好地模拟体内微环境。此外，通过组合同型或异型细胞可生成三维球状体，更能反映细胞的异质性特征 体内，有望用于研究可能影响疾病进展和治疗反应的环境相互作用。本研究优化了细胞密度，通过将细胞悬液固定在标准10 cm培养皿盖上，形成三维同型和异型肿瘤类球体。3 培养皿。通过纵向分析生成同型与异型肿瘤/成纤维细胞球体的生长曲线。最后，研究了成纤维细胞（COS7细胞）和肝星状细胞（LX2）对同型肿瘤（Hep3B）球体增殖的影响。以每20 µL培养基中接种3,000个细胞的密度成功获得了Huh7/COS7异型球体，其体积在培养至第8天前持续稳定增加，随后出现生长减缓。该结果在使用LX2（人肝星状细胞系）条件培养基（CM）培养的Hep3B同型球体中得到验证。与对照肿瘤球体相比，LX2条件培养基显著促进了Hep3B球体的增殖。综上所述，本方案表明三维肿瘤球体可作为一种简单、经济且高效的预筛工具 体外 研究肿瘤-间质相互作用的全面工具。

引言

尽管在肝病及大多数其他类型癌症的治疗方面取得了进展，全球肝癌的发病率和死亡率仍持续上升。2018年，肝癌在全球范围内超越结直肠癌和胃癌，成为癌症相关死亡的第二大 常见原因1。2020年，全球新增肝癌病例超过90万例，占全球癌症总病例的4.7%1。这一现状令人尤为失望，因为肝细胞癌（HCC）——最常见的肝癌类型——其主要危险因素已得到充分阐明2。肝硬化是HCC最常见的危险因素，约80%的HCC病例发生在已确诊肝硬化的基础上2。可进展为肝硬化并继而导致HCC的慢性肝病包括乙型肝炎病毒（HBV）感染、丙型肝炎病毒（HCV）感染、酒精性肝病（ARLD）以及非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）——后者与肥胖和2型糖尿病（T2DM）密切相关2,3。目前HCC的管理方案依据疾病分期而定，对于晚期癌症患者治疗选择有限，且预后通常较差4。近年来，激酶抑制剂以及更近期的免疫肿瘤学疗法取得了显著进展，但现实中仅少数晚期肝癌患者能从中获益5。此外，人们担忧的是，在NAFLD患者中发生的HCC——在西方国家，NAFLD是增长最快的病因，占新诊断HCC病例的50%以上——可能对程序性死亡受体1（PD1）检查点抑制剂治疗更具耐药性6。

在肝细胞癌（HCC）患者的临床试验方面已进行了大量投入，包括临床试验设计及其终点指标的显著改进7经过十年的失败后，这些投入已开始改变患者的治疗前景。然而现实情况是，总体应答比例仍然较低，临床试验中招募的患者往往不能很好地代表实际临床诊疗中的患者群体。其风险在于，这些进展成本高昂，受益者仅为少数，而非大多数患者。随着越来越多的候选疗法出现，无论是单独使用还是联合应用，拥有更能够预测临床疗效的临床前模型变得至关重要。 体内 反应。这些模型可能整合了导致患者反应差异的额外因素，能够更好地反映人类肝细胞癌的异质性及病理复杂性8. 重建的系统 体内 肝细胞癌（HCC）的病理生理条件有助于理解肿瘤发生、生长和进展的生物学机制。目前慢性肝病和肝细胞癌的实验模型通常分为三大类： 体内 基于动物的模型（综述见9), 体外 培养物10，以及 离体11,12 模型。基于动物的方法被广泛用于研究慢性肝病，包括肝细胞癌（HCC）；然而，物种间的遗传差异、高昂的维护成本以及免疫系统的不同是应用此类模型的主要局限性之一9。尽管一些 离体 模型为研究人类组织提供了出色的工具，相较于其他方法具有显著优势 体外 细胞系模型、组织可及性以及有限的实验时间进程阻碍了它们的大规模应用。

另一方面， 体外 细胞系模型对于资源有限且无需持续获取新鲜人体组织的研究人员而言，仍然是一个理想的选择10这些模型还提供了一种工具，可在进行更复杂的实验之前，作为初步筛选手段，用于辅助药物靶点选择的验证。 体内 模型。将传统的二维单层培养技术改良为三维培养技术，已显著提高了这些 体外 模型13,14.

3D 体外 模型能够重现人体正常和病理条件下观察到的关键特征。在生理条件下，信号转导通过细胞间的相互交流以及与其他结缔组织分子（即细胞外基质（ECM）蛋白）的相互作用而启动，形成三维相互作用网络15,16肿瘤在恶性转化过程中以三维球形结构发展，其非肿瘤/肿瘤交界处氧气和营养物质相对充足，而肿瘤核心区域则以缺氧条件为主。这种营养物质分布的异质性导致了空间上 distinct 的信号通路和代谢途径被激活，进而调控肿瘤发生。传统的二维单层培养模型难以有效模拟上述微环境特征。14，其中细胞在生理上无关紧要的硬质塑料培养表面生长。癌细胞还与其他非实质细胞相互作用，后者是肿瘤微环境内细胞外基质（ECM）、生长和侵袭信号的主要来源。与二维（2D）培养不同，三维（3D） 体外 模型可为研究这种肿瘤-间质相互作用提供更合适的平台17.

3D 模型在肝细胞癌领域被广泛应用，其微组织的形成方式各不相同18,19,20,21,22,23. 大多数这些模型使用了超低吸附培养板18,19,20,21,22 或 trans-well 小室23 在类球体形成过程中。本方案介绍了一种替代性的悬滴法，该方法无需使用塑料耗材，且成本较低。 体外 三维肿瘤球体模型。该模型可能有助于评估成纤维细胞在三维环境中对肿瘤细胞增殖的旁分泌和自分泌作用。

方案

1. 细胞制备

  1. 在 II 级层流生物安全柜中进行所有实验操作，并确保无菌条件（参见 材料表）。
    1. 打开生物安全柜，待气流稳定后开始操作。
    2. 用 70% 乙醇彻底喷洒安全柜内部表面，以消除前次使用者可能留下的任何污染。
    3. 在 500 mL 玻璃烧杯中配制 5% 的消毒液溶液。将溶液中残留的细胞上清或细胞碎片弃去。
    4. 用 70% 乙醇彻底清洁所有微量移液器和移液器吸头盒。
  2. 通过向高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）中添加 10% 热灭活胎牛血清（FBS）、1% 青霉素/链霉素（青霉素 100 单位/mL，链霉素 100 µg/mL）和 2 mM L-谷氨酰胺，配制新鲜细胞培养基。对于 LX2 肝星状细胞系，将 FBS 添加浓度降低至 2%。
  3. 实验开始前将培养基预热。
  4. 从液氮储存架中取出 Huh7 和 Hep3B 肝癌肿瘤细胞系以及 COS7 和 LX2 成纤维细胞系，迅速解冻冻存的细胞。
  5. 用 2 mL 新鲜培养基稀释解冻后的细胞，在室温下以 200 × g 离心 4 分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 1 mL 新鲜预热的培养基中。
  6. 将细胞接种至 T75 细胞培养瓶中，在 37 °C、5% CO2 及 95% 湿度的细胞培养孵箱中培养，直至细胞融合度达到 60%–70%。

2. 细胞收集

  1. 吸弃培养基，并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞三次。
  2. 加入 2 mL 预热的 1x 胰蛋白酶，使贴壁细胞从 T75 培养瓶底部脱落。在 37 °C 培养箱中孵育 4 分钟。
  3. 加入 4 mL 完全培养基以终止胰蛋白酶消化作用。收集细胞悬液，于室温下以 200 × g 离心 4 分钟。弃去上清液，将细胞重悬于 4 mL 新鲜培养基中。

3. 细胞计数

  1. 轻轻涡旋细胞悬液，以确保离心管中细胞分布均匀。
  2. 使用 10 µL 移液器，将 10 µL 细胞悬液与 10 µL 台盼蓝混合。轻轻吹打混合液上下四次，以确保细胞外表面被染料完全染色。
  3. 使用血细胞计数板进行细胞计数。
    1. 首先，在加载染色后的细胞悬液前，将盖玻片覆盖在血细胞计数板的计数区域上。
    2. 将含有细胞悬液的移液器枪头插入血细胞计数板的 V 形槽中，轻轻排出枪头内的液体至计数板表面。
    3. 让悬液静置数分钟，待细胞沉降后，再将计数板固定于显微镜载物台上进行细胞计数。
      注意：为避免重复计数，仅计数大方格两侧的细胞。
    4. 计数时包括与上方或右侧界线重叠的细胞，排除与下方或左侧界线重叠的细胞。
  4. 计算细胞总数。
    注意：每毫升细胞数 = 细胞计数公式计算；显示样品稀释和浓度分析的方程。

4. 成纤维细胞条件培养基（CM）的收集

  1. 吸去培养基，并用 PBS 洗涤 LX2 细胞三次。
  2. 加入 2 mL 预热的 1x 胰蛋白酶，使贴壁细胞从 T75 培养瓶底部脱落。将培养瓶置于 37 °C 培养箱中孵育 4 分钟。
  3. 加入 4 mL 完全培养基以终止胰蛋白酶消化作用。收集细胞悬液，于室温下以 200 × g 离心 4 分钟。按步骤 3 的方法进行细胞计数。
  4. 在 10 cm3 培养皿中接种 1 × 106 个 LX2 细胞，于 37 °C 培养 48 小时。
  5. 48 小时后收集成纤维细胞条件培养基（CM）。于室温下以 200 × g 离心 4 分钟，沉淀可能存在的悬浮细胞。使用固定在 20 mL 注射器底部的 0.22 µm 滤器对 CM 进行无菌过滤。
  6. 收集上清液形式的条件培养基（CM）。将 CM 分装至 2 mL 离心管中，于 -80 °C 保存以备后续使用。
    ​注意：该溶液在 -80 °C 可保存 6 个月。

5. 验证完美类球体的细胞密度

  1. 吸弃培养基，并用 PBS 洗涤肝癌细胞系三次。
  2. 加入 2 mL 预热的 1× 胰蛋白酶溶液，使贴壁细胞从 T75 培养瓶底部脱落。在 37 °C 培养箱中孵育 4 分钟。
  3. 加入 4 mL 完全培养基以终止胰蛋白酶消化作用。收集细胞悬液，并在室温下以 200 × g 离心 4 分钟。
  4. 按照步骤 3 的方法进行细胞计数。
  5. 用 20 µL 培养基将不同密度的肿瘤细胞悬液（12000、6000、3000、1500、1000、750、500、250 和 125 个细胞）移取至培养皿 10 cm3 盖子的内表面。
  6. 向培养皿底部加入 10 mL 无菌 PBS，为类球体形成过程提供湿润环境。
  7. 将 10 cm3 培养皿的盖子倒置，使含有细胞悬液的液滴悬挂在湿润环境上方。静置悬挂液滴 3 天。
  8. 在悬挂初始液滴后第 3 天，使用倒置显微镜以 50 倍放大倍数拍摄类球体图像。

6. 异质性肿瘤/间质类球体

  1. 将1500个Huh7肝癌细胞与1500个COS7哺乳动物成纤维细胞（1:1比例）悬浮于悬滴中以形成球状体。在培养皿底部加入10 mL无菌PBS，为球状体提供湿润环境。
  2. 将10 cm3培养皿的盖子倒置，使含有细胞悬液的培养基悬于湿润环境中。将悬滴培养3天。
  3. 从培养第3天至第10天，使用倒置显微镜对球状体进行成像。
    1. 将10 cm3培养皿放置于显微镜载物台上。将显微镜放大倍数统一调整为50倍，用于所有球状体的观察。
    2. 在连接的计算机上打开显微镜软件，调节焦距以获得每个球状体的清晰图像。使用显微镜软件中的Capture Tool功能保存所获取的图像。

7. LX2 条件培养基中 Hep3B 同型球状体

  1. 将3000个Hep3B肝癌细胞悬浮于悬滴中以形成球状体。在培养皿底部加入10 mL无菌PBS，为类球体提供湿润环境。
  2. 将10 cm3培养皿的盖子倒置，使含有细胞悬液的培养基悬于湿润环境中。将悬滴静置3天。
  3. 将Hep3B类球体转移至含有20 µL LX2细胞新鲜条件培养基的悬滴中。
    注意：在转移类球体过程中，使用经灭菌且未过滤的200 µL枪头，以避免对已形成的类球体造成任何破坏或损伤。此举还可清除未与主类球体结合的残留细胞。
    1. 使用经灭菌的20 µL移液枪进行转移操作。将移液枪体积调节至2 µL，并安装移液枪头。
    2. 将形成类球体的10 cm3培养皿盖子倒置，并固定在光学显微镜载物台上。调节显微镜细焦，使每个类球体清晰可见。
    3. 轻轻按压移液枪按钮，将微量移液枪内的空气排空。将枪头插入含有待转移类球体的液滴中，接近类球体但不要接触。
    4. 缓慢释放移液枪按钮压力，使类球体在2 µL培养基中被吸入移液枪头内。
    5. 将类球体转移至新的10 cm3培养皿盖子上悬挂的新液滴中，新液滴含有新的培养基/条件培养基/处理溶液。
      注意：使用光学显微镜确认所有类球体均已成功转移至新的10 cm3培养皿中。
  4. 从转移当天（第3天）开始，直至在LX2条件培养基中培养至第7天，使用倒置显微镜在50倍放大下拍摄类球体图像。

8. 类球体体积的计算

  1. 为每个球状体分配一个唯一的数字编号，以便能够每日采集匹配球状体的图像。
  2. 使用图像分析软件包分析生长中球状体的图像。
    1. 在软件中打开每个球状体图像。使用自由绘制选择工具勾勒每个球状体的轮廓。从分析下拉按钮中选择设置测量，然后选择面积。点击确定。
    2. 手动在每个球状体周围绘制一个圆形。完成圆形绘制后，按下Ctrl + M，使程序计算球状体的像素面积。将球状体的面积转换为体积。
      注：球状体体积mm3 = 0.09403 × 球状体面积公式示意图；用于计算生物学的 (球状体面积_像素 × 0.28)/1000^1.5。
    3. 计算球状体体积相对于首次图像采集当天体积的变化量。
      注：此步骤旨在将球状体体积归一化至初始体积，以提高准确性，因为初始尺寸存在自然差异。

结果

与传统的二维培养相比，以多层三维形式培养的细胞更能准确反映肿瘤微环境的复杂性24,25。以往许多研究通过在类球体培养基中添加不同的有丝分裂原和生长因子26来启动类球体的形成。然而，在本研究中，添加成纤维细胞或其条件培养基（CM）可提供必要的有丝分裂原和生长因子，从而加速类球体的生长。

图1展示了来自一项预实验的数据，其中Huh7人肝细胞癌细胞以从12,000到125个细胞的递减密度接种于20 µL新鲜培养基中，培养3天。接种12,000个细胞时形成的类球体呈不对称形状，即使将接种细胞密度减半也未能改善。然而，由3000个细胞形成的类球体更趋近圆形（图1，上排）。进一步降低细胞浓度既未能形成单一球体（125、250、500细胞密度的类球体），也未能获得规则的类球形结构（1000和1500细胞密度的类球体）。值得注意的是，在500个肿瘤细胞密度下形成了多个小球体，但在50倍放大下仅捕获到一个小型类球体（图1，上排）。相同的优化方案也应用于COS7灵长类动物肾成纤维细胞系（图1，中排）。将125、250和500个COS7成纤维细胞悬浮于20 µL悬滴中，形成一个圆形类球体并伴随多个较小的类球体，而较高细胞密度（1000、1500和3000个细胞）则形成单一的半圆形类球体。与Huh7肿瘤类球体类似，更高细胞浓度（6,000和12,000个细胞/类球体）导致不规则细胞聚集体的形成，因此被排除（图1，中排）。Huh7/COS7异质细胞悬液在低密度（125、250和500个细胞/类球体）下生成一个主类球体，并伴有多个漂浮或半附着的小类球体（图1，下排）。1000和1500个细胞的异质类球体呈半圆形，而接种密度为3000个细胞（每种细胞各1500个）时可形成圆形的三维类球体。如前所述，更高细胞密度会导致聚集体形成，而非形态清晰的类球体（图1，下排）。综上所述，3000个细胞密度形成的类球体呈圆形，与人肝细胞癌肿瘤相似，适用于后续实验。将细胞悬液以悬滴法培养3天足以促进类球体的形成。

在优化当前实验条件下成球的最佳细胞浓度和时间点后，纵向评估了肿瘤细胞系与成纤维细胞系共培养对增殖的影响。图2和图3展示了Huh7/COS7异质性类球体（每个类球体总细胞数为3000）从第3天至第10天的监测结果。同质性Huh7和COS7类球体（每种1500个细胞）作为对照。从第4天开始，异质性类球体相较于同质性类球体呈现出更理想的圆形结构（图2）。异质性类球体的初始体积大于每种同质性类球体的初始体积。为避免类球体体积的正常变异（第3天，图3），其生长情况通过相对于成球当天初始体积的变化来计算。异质性类球体从第4天到第7天初期表现出快速生长期，随后在第8天进入较缓慢的生长阶段（图2，上排，以及图3）。在第9天和第10天，类球体体积减小，可能反映了营养耗竭、缺氧核心形成或细胞死亡。

相比之下，同型Huh7和COS7类球体的生长速度要慢得多（图2，中间和底行；图3）。同型类球体在培养至第五天（类球体形成后两天）之前表现出相对稳定的生长曲线。从第6天开始，同型类球体的生长曲线开始出现缓慢增长，但其增长速率显著低于异型类球体（图3）。综上所述，肿瘤细胞/成纤维细胞异型类球体的生长速率高于同型类球体，表明肿瘤细胞与成纤维细胞的直接接触可促进肿瘤类球体体积的增大。

最后，为了验证上述发现并研究间充质细胞在肝脏相关背景下对肝细胞癌（HCC）类球体增殖的旁分泌影响，将培养3天的同型Hep3B HCC类球体在常规新鲜培养基或LX2肝星状细胞的条件培养基（CM）中继续培养4天（图4 和 图5）。初步观察显示，3000个Hep3B细胞在培养3天后形成了形态完整的类球体（图4）。在新鲜培养基中，Hep3B类球体从第3天至第7天持续增殖（图4，上排）。当Hep3B类球体在LX2细胞条件培养基（CM）中培养时，其生长速率进一步提高（图4，下排）。这种依赖培养基的Hep3B类球体生长变化从第4天起直至实验结束均具有统计学意义（图5），提示成纤维细胞可驱动肿瘤类球体的增殖。

综上所述，本研究成功改进了现有的三维球状体培养方法，以利用肝细胞癌（HCC）肿瘤细胞与不同成纤维细胞系之间的相互作用，并探究这种直接与间接细胞互作对增殖的重要意义（图6）。还需对所形成的球状体进行进一步表征，以优化肿瘤细胞与周围微环境之间的相互作用方式。

Huh7、Cos7 和 Huh7/Cos7 类球体的细胞密度变化显微图像。
图 1：类球体形成最佳细胞密度的优化。 各列代表不同的细胞接种密度，各行代表由 Huh7 细胞（第一行）、COS7 细胞（第二行）和 Huh7/COS7 异质细胞（第三行）形成的类球体。图像显示了在 20 µL 培养基中分别悬浮 125、250、500、1000、1500、3000、6000 和 12000 个细胞（从左至右）培养 3 天后形成的类球体。预实验中每种条件包含两个类球体，图像拍摄放大倍数为 50 倍，比例尺 = 200 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

Huh7/COS7 类球体在10天内的生长情况，显微镜图像，类球体发育比较。
图2：异质性与同质性类球体的生长对比。 各列代表类球体图像拍摄的时间点，各行显示由 Huh7 细胞（第一行）、COS7 细胞（第二行）以及 Huh7/COS7 细胞（第三行）形成的类球体的代表性图像。图像从左至右依次展示不同时间点悬浮培养的3000个细胞所形成的类球体（同质性 Huh7、同质性 COS7 或异质性 Huh7/COS7 类球体）。每种条件均包含10个类球体，图像拍摄放大倍数为50倍，比例尺 = 200 µm。请点击此处查看该图的高清版本。

类球体体积变化图；Huh7、Cos7 类球体，异质性；10天研究，统计学显著性。
图3：异质性与同质性类球体生长的纵向分析。该图显示了异质性Huh7/COS7类球体与同质性Huh7和COS7类球体的生长曲线。数据以均值±标准误表示；n = 10个独立类球体。** p < 0.01；**** p < 0.001。请点击此处查看此图的放大版本。

Hep3B 类球体在培养基与 LX2 条件培养基中生长情况比较，为期 7 天；显微镜图像分析。
图 4：Hep3B 同型类球体在 LX2 条件培养基（LX2 CM）中的生长情况。 列表示获取类球体图像的时间点（天数），行表示在新鲜 DMEM 培养基（上排）或 LX2 CM（下排）中培养的 Hep3B 类球体的代表性图像。每种条件（新鲜培养基或 LX2 CM）包含七个类球体，图像以 50 倍放大倍数拍摄，比例尺 = 200 µm。请点击此处查看该图的高清版本。

类球体生长情况对比折线图；新鲜培养基与LX2条件培养基在3-7天内的体积变化。
图5：同源性Hep3B类球体生长的纵向分析。该图显示了Hep3B类球体在新鲜DMEM培养基或LX2条件培养基（LX2 CM）中的生长曲线。数据以均值±标准误表示；n = 7个独立类球体。****p < 0.001。请点击此处查看该图的放大版本。

肿瘤类球体形成、显微镜设置、细胞分析、类球体体积随时间变化的图表。
图6：类球体形成过程的示意图。 将细胞悬液滴加至10 cm3 培养皿的内盖上，然后将盖子翻转并放置3天，以促进同型或异型类球体的形成。类球体图像以50倍放大倍数拍摄。该图使用基于网络的科学绘图工具绘制（见材料表）。请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

实验细胞系生长的环境会影响其基因表达谱、通路分析结果及功能特征。例如，在乳腺癌细胞中，只有当癌细胞以三维构型培养时，不同致癌通路之间的协调性才能得以维持27三维黑色素瘤和乳腺癌球体中差异表达的基因，而在单层细胞中则无此现象，这些基因与肿瘤的生物学行为更为相关 体内 人类肿瘤28,29例如，乳腺上皮细胞及其肿瘤对应细胞中β1整合素水平低于在二维培养条件下的水平29此外，与在塑料表面培养的成纤维细胞相比，三维结构中的成纤维细胞在形态和迁移速度方面往往表现出不同的迁移特征。30此外，生长基质的机械刚度会激活特定通路，促进正常上皮细胞的恶性转化 通过 上皮细胞中细胞外信号调节激酶（ERK）/Rho的失调31这些因素推动了从传统的二维培养向三维球状模型的转变，因为三维培养更符合人类疾病的实际情况。

本研究使用常规的实验室工具和耗材构建了三维肿瘤球模型。所形成的肿瘤球对成纤维细胞释放的增殖信号产生响应，表现为显著增强的生长。该模型属于多细胞肿瘤球（multicellular tumor spheroids）类别。此外还有三种其他类型的三维肿瘤球模型，包括肿瘤球体（tumorospheres）32、组织来源的肿瘤球（tissue-derived tumor spheres）33,34 和类器官型多细胞球（organotypic multicellular spheroids）35。在多细胞肿瘤球模型中，肿瘤细胞被置于低黏附条件下，使其能够聚集形成球体，且不接触培养容器底部36。已有多种方法用于实现这种非贴壁依赖性培养技术，包括旋转系统、液体覆盖法以及未包被的超低黏附U型板37。在肝细胞癌（HCC）研究中，大多数体外（in vitro）肿瘤球培养采用超低黏附的24孔或96孔板来形成圆形球体18,19,20,21,22。然而，该方法成本较高，且无法完全排除细胞与塑料表面意外接触的可能性。其他系统则使用Transwell小室23或肝组织切片12来生成肝微组织。在转化医学研究中使用人源组织是金标准，但许多研究团队往往难以获得或无法获取此类资源。本研究的方法基于悬滴培养原理，通过添加细胞悬液，使肿瘤球在可及的液-气界面处形成单一的圆形球体38。该技术的优势在于完全避免了细胞与塑料表面的接触，同时便于研究肿瘤细胞与成纤维细胞之间的自分泌和旁分泌相互作用。该模型已在另一项研究中得到进一步验证，该研究揭示了非实质细胞表达的TREM2在保护肝脏免于肝细胞癌发生中的重要作用39。研究结果表明，在Wnt依赖的方式下，Hep3B和PLC/PRF5肿瘤球在对照组LX2条件培养基（CM）中的体积均显著大于TREM2过表达的LX2条件培养基中的体积39。

在本研究中，成纤维细胞在类球体形成前与肿瘤细胞混合，以探究这种共培养对增殖的影响。其他研究则在肿瘤类球体形成后，将成纤维细胞、内皮细胞和免疫细胞加入肿瘤细胞悬液中，以研究间质细胞向肿瘤内部的迁移。40,41. 当前的异质性球体模型表现出与先前报道的模型及原始模型相似的生长模式 体内 肿瘤；类球体呈现指数级增长，随后进入延迟生长期，这很可能是因为营养物质耗尽以及坏死核心扩大所致42与添加生长因子和有丝分裂原以促进球体形成的方法不同，本研究采用了一种更具生理学意义的方法，即通过与成纤维细胞直接接触或通过成纤维细胞条件培养基（fibroblastic CM）中的分泌组来提供这些生长因子。需要特别指出的是，LX2细胞可通过TGFβ1或PDGF处理进一步激活。43LX2细胞经10 ng/mL TGFβ1处理48小时后，弃去培养基以用于不同的实验设置。LX2细胞用PBS洗涤三次（以排除TGFβ1的直接作用），随后加入新鲜培养基继续培养24小时，然后收集条件培养基（CM）。由TGFβ1刺激的LX2细胞收集的CM比对照组LX2细胞的CM更显著地促进Hep3B类球体的生长（数据未显示）。该灵活系统可用于不同癌细胞与成纤维细胞共培养（含或不含成纤维细胞），以及患者来源细胞系的培养。此外，该系统还可作为中通量药物筛选平台，快速应用于转化药物发现流程，以指导药物剂量的确定 体内 研究。

本研究的一个局限性在于使用永生化细胞系进行类球体形成，而非使用 freshly isolated HCC 肿瘤细胞和癌症相关成纤维细胞。另一个局限性在于，比较了 LX2 来源的条件培养基与新鲜培养基中同型 Hep3B 类球体的生长情况，而未与其他非成纤维细胞系来源的条件培养基进行比较。后一局限性可通过在成纤维细胞中对目标基因进行遗传修饰来解决，随后将野生型与基因工程改造的成纤维细胞所分泌的条件培养基分别应用于同型类球体。

披露

FO 是 Fibrofind 有限公司的董事兼股东。

致谢

MYWZ 获得了英国商业、能源和产业战略部以及2020年牛顿奖的支持，该资助是英国政府官方发展援助 "ODA" 和牛顿基金的一部分。SS 由英国癌症研究基金会高级临床科学家奖学金 C53575/A29959 资助。SS、FO 和 HR 的研究经费来自 HUNTER 项目，该项目由英国癌症研究基金会、AIRC 基金会和西班牙抗癌协会科学基金会共同合作资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1x 胰蛋白酶Sigma Aldrich59429C
2 mL 离心管Eppendorf
BioRenderBioRender.com在线
II级层流生物安全柜BioMAT2Medair Technologies
杜尔贝科’s 改良伊格尔’DMEM培养基BioseraM-D1107
Excel 软件Microsoft Office 365
GraphPad Prism 软件GraphPad 软件
热灭活胎牛血清（FBS）life tech105000064
Image J 软件Fiji
L-谷氨酰胺Sigma AldrichG7513-100ml
青霉素/链霉素（100 单位/毫升青霉素和 100 μg/ml 链霉素Sigma AldrichP0781-100ml
90 mm 三重通气培养皿格雷纳633175
台盼蓝Sigma AldrichT8154
Virkon™ 广谱消毒剂，5公斤桶装Rely+On™SCI-129999
Ziess 倒置显微镜齐斯

参考文献

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一种用于研究肝细胞癌中肿瘤-间质相互作用的三维球状模型
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