使用 Y-27632 分离与培养原代人牙龈上皮细胞

摘要

本文介绍了一种改良的人牙龈上皮细胞分离与培养方法，即在传统方法的基础上添加了ROCK抑制剂Y-27632。该方法操作更简便、耗时更短，可增强干细胞特性，并能获得更多具有高增殖潜能的上皮细胞，适用于实验室研究及临床应用。

摘要

牙龈组织是保护牙周组织的第一道结构，在多种口腔功能中发挥着重要作用。牙龈上皮是牙龈组织的重要组成部分，尤其在牙周组织的修复与再生过程中具有关键意义。研究牙龈上皮细胞的功能具有重要的科学价值，例如修复口腔缺损以及检测生物材料的相容性。由于人牙龈上皮细胞是高度分化的角化细胞，其寿命较短，传代困难。迄今为止，仅有两种分离和培养牙龈上皮细胞的方法：直接组织块法和酶消化法。然而，直接组织块法获取上皮细胞所需时间较长，而酶消化法的细胞存活率较低。临床上，牙龈组织的获取受限，因此需要一种稳定、高效且简便的体外分离与培养体系。我们在传统酶消化法的基础上添加了Y-27632（一种Rho相关激酶（ROCK）抑制剂），该物质可选择性促进上皮细胞的生长。我们改进后的酶消化法简化了传统酶消化法的操作步骤，提高了上皮细胞的培养效率，在与直接组织块法及传统酶消化法的比较中具有显著优势。

引言

人体牙龈是保护牙周组织的第一道防御结构，不仅是一种物理和化学屏障¹，还能分泌多种参与免疫反应并构成免疫屏障的炎症介质^2,3牙龈上皮在牙周组织的修复与再生过程中发挥着重要作用。因此，研究牙龈上皮的防御与免疫功能，对于理解牙周炎的发生、诊断及治疗具有重要意义。从人牙龈组织中分离并培养牙龈上皮细胞是研究牙龈上皮的第一步。该过程需要进行组织工程种子细胞制备等基本操作， 体外 牙周相关疾病的模型，以及用于修复牙周缺损的材料。

原代牙龈上皮细胞在体外培养中表现出较低的分裂速率in vitro⁴，因此数十年来研究人员一直在寻求最佳的分离与培养方法。迄今为止，实验室中常用两种不同的技术来获取原代牙龈上皮细胞：in vitro^4,5即直接组织块法和酶消化法。直接组织块法的优点包括所需组织标本量较少、操作步骤简单，但其缺点是培养周期较长且易受污染⁵。尽管酶消化法可缩短培养所需时间，但其效率相对较低，且受所用酶种类和培养基的影响较大。Kedjarune 等人

方案

本方案中使用的人体组织为下颌阻生牙拔除术后颌面外科部门丢弃的新鲜成人牙龈组织，采集过程遵循本机构人类研究伦理委员会的指导方针（方案编号：GR201711，日期：2017年2月27日）。

1. 准备工作

1. 采集新鲜的成人牙龈组织，置于含有10 mL添加了3%青霉素/链霉素（P/S）的磷酸盐缓冲液（PBS）的15 mL离心管中，并将组织保存在4 °C条件下。
   注意：组织切除后需在24小时内按以下步骤进行处理。

2. 准备试剂与培养基

1. 配制洗涤液：3% 青霉素-链霉素溶液（P/S）。将 50 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）与 1.5 mL 青霉素（100 U/mL）和 1.5 mL 链霉素（100 mg/L）混合。
2. 配制 500 mL 含生长因子的培养基（称为 G 培养基）：DMEM/F12（3:1）培养基，包含 1% 青霉素-链霉素溶液（P/S）、2% B27 添加剂、20 ng/mL 表皮生长因子（EGF）、40 ng/mL 成纤维细胞生长因子 2（FGF2）以及 40 µg/mL 两性霉素 B（fungizone）。
3. 为新方法配制酶消化液：将 125 mg Dispase 粉末和 125 mg I 型胶原酶（Type I collagenase....

结果

图1展示了直接组织块法和改良酶消化法的示意图。直接组织块法在整个过程中无需使用任何消化酶。相比之下，传统的酶消化法通常需要两组消化酶——dispase和collagenase，以将上皮层从下方的成纤维细胞层中分离，随后使用trypsin将上皮细胞释放至悬浮液中。我们的新方法省略了分离步骤，是一种简化的酶消化法。此外，在G培养基中添加Y-27632可有效促进上皮细胞的生长。直接组织块法通常需要约2周时间，牙龈上皮细胞才能生长至可传代的程度，且容易发生污染。然而，采用新方法获得的牙龈上皮细胞数量显著多于直接组织块法，且平均仅需8天即可达到传代要求。

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讨论

牙龈组织是维持牙周完整性和健康的关键结构。牙龈上皮细胞在牙周组织的修复与再生中具有重要作用，可用于口腔生物学、药理学、毒理学以及口腔黏膜缺损等相关领域的科学研究和临床应用¹⁸。因此，建立一种稳定且高效的口腔上皮细胞获取方法十分必要¹⁹。原代上皮细胞是一类分化完全的细胞，传代次数少且寿命较短。上皮细胞的培养已被证实比成纤维细胞的培养更为复杂⁵。

目前，已发表的文献表明，存在多种用于上皮细胞分离与培养的实验方案。然而，在这些方案中，最常使用的是组织块直接培养法和酶消化法。1910年，Carrel 和 Burrows 首次描述了一种获取牙龈和颊部上皮细胞的方法，称为组织块直接培养法。²⁰直接组织块法具有对组织标本需求量小、操作步骤简单、变异较少以及操作环节较少等优点，但其缺点是需要较长的培养时间，且极易受到污染。⁵1975年，Rheinwald和Gre.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
名称			缩写 &和评论
Countess 自动细胞计数仪	上海瑞昱生物科学&Technology有限公司	BBA0218AC	自动细胞计数
CO2 培养箱	赛默飞世尔科技	51026333	用于细胞孵育
Sorvall ST 16R 离心机	赛默飞世尔科技	75004380	细胞离心机
细胞培养皿	Eppendorf	30702115	用于细胞培养
50 ml 离心管	KIRGEN	171003	用于细胞离心
1.5 ml 微量离心管	KIRGEN	190691J	用于细胞消化
细胞筛	康宁公司	431792	细胞过滤
磷酸盐缓冲液	Solarbio Life Science	P1020-500	洗涤液
DMEM	赛默飞世尔科技	C11995500	中和培养基组分
定义的K-SFM	Life Technologies	10785-012	牙龈上皮  细胞培养基
青霉素-链霉素	赛默飞世尔科技	15140-122	抗生素
胎牛血清	生物工业公司	04-001-1AC5	中和培养基组分
0.05% 胰蛋白酶	Life Technologies	25300-062	用于HGGEPCs的解离
稀释液	Life Technologies	50-9701	用于包被基质
Dispase	Gibco	17105-041	用于HGGEPCs的分离
I型胶原酶	Life Technologies	17100-017	用于HGGEPCs的分离
F12 营养混合物，Hams	Life Technologies	31765035	G培养基组分
B27 补充剂	Life Technologies	17504044	G-培养基中的生长因子
FGF-2 Millipore	默克生物科学	341595	G-培养基中的生长因子
Y-27632	基因操作	IAD1011	ROCK抑制剂
两性霉素B	Gibco	15290026	G培养基的配制
EGF 重组人蛋白	Gibco	PHG0311	G-培养基中的生长因子
Cell Counting Kit-8	Dojindo Molecular Technologies	CK04	细胞增殖实验
兔抗人CK18	Abcam	ab82254	用于检测HGGEPCs分化标志物的免疫荧光染色
兔抗人角蛋白10	Abcam	ab76318	用于检测HGGEPCs分化标志物的免疫荧光染色
小鼠抗人波形蛋白	Cell Signaling Technology	3390	牙龈成纤维细胞的免疫荧光染色
兔抗人广谱角蛋白	BD	550951	用于检测HGGEPCs分化标志物的免疫荧光染色
兔抗 Ki67	Abcam	15580	用于检测HGGEPCs分化标志物的免疫荧光染色
兔抗p63	Biolegend	619002	用于检测HGGEPCs分化标志物的免疫荧光染色
兔抗p75NGFR	Abcam	ab52987	用于检测HGGEPCs分化标志物的免疫荧光染色