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使用 Y-27632 分离与培养原代人牙龈上皮细胞

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DOI：

10.3791/62978

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2021年11月6日

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1Department of Tissue Engineering and Regeneration, School and Hospital of Stomatology, Cheeloo College of Medicine, Shandong University & Shandong Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration & Shandong Engineering Laboratory for Dental Materials and Oral Tissue Regeneration, 2Department of Orthodontics, School and Hospital of Stomatology, Cheeloo College of Medicine, Shandong University & Shandong Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration & Shandong Engineering Laboratory for Dental Materials and Oral Tissue Regeneration, 3Department of Stomatology, Shengli Oilfield Central Hospital, 4Department of Pediatric Surgery, Shengli Oilfield Central Hospital, 5Ningbo Stomatology Hospital of Savaid Stomatology School, Hangzhou Medical College

本文内容

摘要

本文介绍了一种改良的人牙龈上皮细胞分离与培养方法，即在传统方法的基础上添加了ROCK抑制剂Y-27632。该方法操作更简便、耗时更短，可增强干细胞特性，并能获得更多具有高增殖潜能的上皮细胞，适用于实验室研究及临床应用。

摘要

牙龈组织是保护牙周组织的第一道结构，在多种口腔功能中发挥着重要作用。牙龈上皮是牙龈组织的重要组成部分，尤其在牙周组织的修复与再生过程中具有关键意义。研究牙龈上皮细胞的功能具有重要的科学价值，例如修复口腔缺损以及检测生物材料的相容性。由于人牙龈上皮细胞是高度分化的角化细胞，其寿命较短，传代困难。迄今为止，仅有两种分离和培养牙龈上皮细胞的方法：直接组织块法和酶消化法。然而，直接组织块法获取上皮细胞所需时间较长，而酶消化法的细胞存活率较低。临床上，牙龈组织的获取受限，因此需要一种稳定、高效且简便的体外分离与培养体系。我们在传统酶消化法的基础上添加了Y-27632（一种Rho相关激酶（ROCK）抑制剂），该物质可选择性促进上皮细胞的生长。我们改进后的酶消化法简化了传统酶消化法的操作步骤，提高了上皮细胞的培养效率，在与直接组织块法及传统酶消化法的比较中具有显著优势。

引言

人体牙龈是保护牙周组织的第一道防御结构，不仅是一种物理和化学屏障1，还能分泌多种参与免疫反应并构成免疫屏障的炎症介质2,3牙龈上皮在牙周组织的修复与再生过程中发挥着重要作用。因此，研究牙龈上皮的防御与免疫功能，对于理解牙周炎的发生、诊断及治疗具有重要意义。从人牙龈组织中分离并培养牙龈上皮细胞是研究牙龈上皮的第一步。该过程需要进行组织工程种子细胞制备等基本操作， 体外 牙周相关疾病的模型，以及用于修复牙周缺损的材料。

原代牙龈上皮细胞在体外培养中表现出较低的分裂速率in vitro4，因此数十年来研究人员一直在寻求最佳的分离与培养方法。迄今为止，实验室中常用两种不同的技术来获取原代牙龈上皮细胞：in vitro4,5即直接组织块法和酶消化法。直接组织块法的优点包括所需组织标本量较少、操作步骤简单，但其缺点是培养周期较长且易受污染5。尽管酶消化法可缩短培养所需时间，但其效率相对较低，且受所用酶种类和培养基的影响较大。Kedjarune 等人6研究表明，与酶消化法相比，直接组织块法在传代前需要更长时间（2周），但在培养牙龈上皮细胞方面更为成功。然而，Klingbeil 等人7在比较这两种方法时发现，酶消化法在口腔上皮细胞的原代培养中效果最佳，且可在最短时间内获得理想的细胞产量（11.9天 vs 14.2天）。

因此，建立一种更便捷且高效的口腔上皮细胞分离与培养方法显得尤为重要4。我们此前曾报道，添加Rho相关蛋白激酶（ROCK）抑制剂Y-27632，可简化从成人皮肤组织中分离人原代表皮细胞和角质形成细胞的操作流程8,9,10。我们开发了G-medium，这是一种新型的条件化接种培养基，可自发实现表皮细胞与真皮细胞的分离，并支持原代表皮细胞的生长与产量8,9,10。在本研究中，我们结合G-medium与Y-27632，建立了一种新的无血清牙龈上皮细胞分离与培养技术。本质上，该方法是在传统两步酶解法基础上的简化，因此我们将新方法与直接组织块法进行了比较。这种改良的酶解法显著缩短了从牙龈组织中分离牙龈上皮细胞所需的时间，并提高了牙龈上皮细胞培养的效率。

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方案

本方案中使用的人体组织为下颌阻生牙拔除术后颌面外科部门丢弃的新鲜成人牙龈组织，采集过程遵循本机构人类研究伦理委员会的指导方针（方案编号：GR201711，日期：2017年2月27日）。

1. 准备工作

  1. 采集新鲜的成人牙龈组织，置于含有10 mL添加了3%青霉素/链霉素（P/S）的磷酸盐缓冲液（PBS）的15 mL离心管中，并将组织保存在4 °C条件下。
    注意：组织切除后需在24小时内按以下步骤进行处理。

2. 准备试剂与培养基

  1. 配制洗涤液：3% 青霉素-链霉素溶液（P/S）。将 50 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）与 1.5 mL 青霉素（100 U/mL）和 1.5 mL 链霉素（100 mg/L）混合。
  2. 配制 500 mL 含生长因子的培养基（称为 G 培养基）：DMEM/F12（3:1）培养基，包含 1% 青霉素-链霉素溶液（P/S）、2% B27 添加剂、20 ng/mL 表皮生长因子（EGF）、40 ng/mL 成纤维细胞生长因子 2（FGF2）以及 40 µg/mL 两性霉素 B（fungizone）。
  3. 为新方法配制酶消化液：将 125 mg Dispase 粉末和 125 mg I 型胶原酶（Type I collagenase）粉末溶解于 50 mL DMEM 培养基中。
    注意：所有酶溶液均需通过 0.22 µm 滤器过滤，并于 4 °C 保存。
  4. 配制 500 mL 用于中和酶消化作用的培养基：在 DMEM 培养基中加入 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素-链霉素溶液（P/S）。

3. 直接组织块法

  1. 牙龈组织预处理
    1. 用 5 mL 75% 乙醇冲洗牙龈组织 30 秒。然后用洗涤液（步骤 2.1）各 5 mL 重复冲洗两次，每次 5 分钟。
      注意：所有洗涤操作均应在直径为 50 mm 的细胞培养皿中进行。
  2. 牙龈上皮细胞培养
    1. 将牙龈组织切成 1 mm3 的小块，并分散放置于 100 mm 细胞培养皿中。切割操作时使用精细尖头镊子和眼科剪刀。
    2. 向培养皿中加入 G 培养基（步骤 2.2）。然后将培养皿置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育。使用倒置显微镜（40 倍）每 24 小时观察一次组织情况。
    3. 当上皮细胞从组织块周围向外生长至直径 2–5 mm 时，移除牙龈组织块。每 2–4 天更换一次 G 培养基。

4. 新的改良酶法

  1. 牙龈组织预处理
    1. 此步骤请遵循直接组织块法中步骤 3.1.1 所述的相同操作。
  2. 牙龈组织消化
    1. 用两把灭菌刀片将牙龈组织切成微小碎片，大小约为 <1 mm。使用两把手术刀重复切碎过程。
    2. 向含有牙龈组织碎片的 1.5 mL 离心管中加入 1 mL 浓度为 2.5 mg/mL 的dispase + 胶原酶溶液，然后将离心管置于 37 °C 培养箱中孵育 15–20 分钟。
    3. 当组织变得透明且呈絮状时，加入 1 mL 中和液以终止消化反应。用移液器上下吹打 10–15 次，充分混匀溶液。将溶液通过 100 µm 孔径的滤网过滤。
    4. 以 200 ×g 离心 5 分钟。
    5. 弃去上清液，将管底的细胞沉淀重悬于 10 mL 含生长因子的培养基（步骤 2.2）中。将细胞悬液转移至 100 mm 细胞培养皿中。向培养皿中加入 10 µM Y-27632。
    6. 将细胞置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养。每 2 天更换一次新鲜的 G 培养基。在第 1 天和第 3 天观察细胞状态。

5. 细胞传代

  1. 从培养箱中取出培养皿，吸去旧培养基，用 PBS 洗涤两次。每 100 mm 培养皿加入 2 mL 0.05% 胰蛋白酶溶液。
    注意：轻轻晃动培养皿，确保胰蛋白酶溶液与皿底充分接触。
  2. 将培养皿置于 37 °C 培养箱中孵育约 5 分钟，进行消化处理。
  3. 使用显微镜（40 倍）观察细胞，确认大部分细胞已从皿底脱落。
  4. 加入 2 mL 中和液以终止消化反应，将细胞转移至 15 mL 离心管中。用移液器吹打 10–15 次。在 200 × g 条件下离心 5 分钟。
  5. 缓慢吸去上清液。用 10 mL G 培养基重悬细胞沉淀，并计数细胞数量。
  6. 每 100 mm 培养皿中加入约 1 × 106 个细胞、10 mL G 培养基以及 10 µM Y-27632。
  7. 每 2 天更换一次 G 培养基和 Y-27632。分别在第 1 天和第 5 天观察细胞状态。

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结果

图1展示了直接组织块法和改良酶消化法的示意图。直接组织块法在整个过程中无需使用任何消化酶。相比之下，传统的酶消化法通常需要两组消化酶——dispase和collagenase，以将上皮层从下方的成纤维细胞层中分离，随后使用trypsin将上皮细胞释放至悬浮液中。我们的新方法省略了分离步骤，是一种简化的酶消化法。此外，在G培养基中添加Y-27632可有效促进上皮细胞的生长。直接组织块法通常需要约2周时间，牙龈上皮细胞才能生长至可传代的程度，且容易发生污染。然而，采用新方法获得的牙龈上皮细胞数量显著多于直接组织块法，且平均仅需8天即可达到传代要求。

牙龈上皮细胞培养示意图；比较直接组织块法与酶解离法。
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讨论

牙龈组织是维持牙周完整性和健康的关键结构。牙龈上皮细胞在牙周组织的修复与再生中具有重要作用，可用于口腔生物学、药理学、毒理学以及口腔黏膜缺损等相关领域的科学研究和临床应用18。因此，建立一种稳定且高效的口腔上皮细胞获取方法十分必要19。原代上皮细胞是一类分化完全的细胞，传代次数少且寿命较短。上皮细胞的培养已被证实比成纤维细胞的培养更为复杂5。

目前，已发表的文献表明，存在多种用于上皮细胞分离与培养的实验方案。然而，在这些方案中，最常使用的是组织块直接培养法和酶消化法。1910年，Carrel 和 Burrows 首次描述了一种获取牙龈和颊部上皮细胞的方法，称为组织块直接培养法。20直接组织块法具有对组织标本需求量小、操作步骤简单、变异较少以及操作环节较少等优点，但其缺点是需要较长的培养时间，且极易受到污染。51975年，Rheinwald和Gre...

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披露

所有作者均声明无利益冲突。

致谢

本工作由山东省自然科学基金重点项目（ZR2019ZD36）和山东省重点研发计划项目（2019GSF108107）资助予X.W.；山东省重点研发计划项目（2018GSF118240）资助予J.G.；山东省医药卫生科技发展计划项目（2018WS163）资助予Z.X.，以及山东省医药卫生科技发展计划项目（2019WS045）资助予J.S.。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
名称缩写 &和评论
Countess 自动细胞计数仪上海瑞昱生物科学&Technology有限公司BBA0218AC自动细胞计数
CO2 培养箱赛默飞世尔科技51026333用于细胞孵育
Sorvall ST 16R 离心机赛默飞世尔科技75004380细胞离心机
细胞培养皿Eppendorf30702115用于细胞培养
50 ml 离心管KIRGEN171003用于细胞离心
1.5 ml 微量离心管KIRGEN190691J用于细胞消化
细胞筛康宁公司431792细胞过滤
磷酸盐缓冲液Solarbio Life ScienceP1020-500洗涤液
DMEM赛默飞世尔科技C11995500中和培养基组分
定义的K-SFMLife Technologies10785-012牙龈上皮  细胞培养基
青霉素-链霉素赛默飞世尔科技15140-122抗生素
胎牛血清生物工业公司04-001-1AC5中和培养基组分
0.05% 胰蛋白酶Life Technologies25300-062用于HGGEPCs的解离
稀释液Life Technologies50-9701用于包被基质
DispaseGibco17105-041用于HGGEPCs的分离
I型胶原酶Life Technologies17100-017用于HGGEPCs的分离
F12 营养混合物，HamsLife Technologies31765035G培养基组分
B27 补充剂Life Technologies17504044G-培养基中的生长因子
FGF-2 Millipore默克生物科学341595G-培养基中的生长因子
Y-27632基因操作IAD1011ROCK抑制剂
两性霉素BGibco15290026G培养基的配制
EGF 重组人蛋白GibcoPHG0311G-培养基中的生长因子
Cell Counting Kit-8Dojindo Molecular TechnologiesCK04细胞增殖实验
兔抗人CK18Abcamab82254用于检测HGGEPCs分化标志物的免疫荧光染色
兔抗人角蛋白10Abcamab76318用于检测HGGEPCs分化标志物的免疫荧光染色
小鼠抗人波形蛋白Cell Signaling Technology3390牙龈成纤维细胞的免疫荧光染色
兔抗人广谱角蛋白BD550951用于检测HGGEPCs分化标志物的免疫荧光染色
兔抗 Ki67Abcam15580用于检测HGGEPCs分化标志物的免疫荧光染色
兔抗p63Biolegend619002用于检测HGGEPCs分化标志物的免疫荧光染色
兔抗p75NGFRAbcamab52987用于检测HGGEPCs分化标志物的免疫荧光染色

参考文献

  1. Takahashi, N., et al. Gingival barrier: regulation by beneficial and harmful microbes. Tissue Barriers. 7, 1651158(2019).
  2. Michea, P., et al. Epithelial control of the human pDC response to extracellular bacteria. European Journal of Immunology. 43, 1264-1273 (2013).
  3. Bedran, T. B., Mayer, M. P., Spolidorio, D. P., Grenier, D. Synergistic anti-inflammatory activity of the antimicrobial peptides human beta-defensin-3 (hBD-3) and cathelicidin (LL-37) in a three-dimensional co-culture model of gingival epithelial cells and fibroblasts. PloS one. 9, 106766(2014).
  4. Sciezynska, A., et al. Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review. Experimental Dermatology. 28, 107-112 (2019).
  5. Bryja, A., et al. Overview of the different methods used in the primary culture of oral mucosa cells. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 33, 397-401 (2019).
  6. Kedjarune, U., Pongprerachok, S., Arpornmaeklong, P., Ungkusonmongkhon, K. Culturing primary human gingival epithelial cells: comparison of two isolation techniques. Journal of Cranio-Maxillo-Facial Surgery: Official Publication of the European Association for Cranio-Maxillo-Facial Surgery. 29, 224-231 (2001).
  7. Klingbeil, M. F., et al. Comparison of two cellular harvesting methods for primary human oral culture of keratinocytes. Cell and Tissue Banking. 10, 197-204 (2009).
  8. Qian, H., et al. One-step simple isolation method to obtain both epidermal and dermal stem cells from human skin specimen. Methods in Molecular Biology. 1879, 139-148 (2019).
  9. Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12, 1251-1255 (2018).
  10. Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2018).
  11. Lauer, G., Wiedmann-Al-Ahmad, M., Otten, J. E., Hubner, U. Immunohistochemical study during healing of free palatal mucosa grafts on plastic-embedded samples. Journal of Oral Pathology & Medicine: Official Publication of the International Association of Oral Pathologists and the American Academy of Oral Pathology. 30, 104-112 (2001).
  12. Locke, M., Hyland, P. L., Irwin, C. R., Mackenzie, I. C. Modulation of gingival epithelial phenotypes by interactions with regionally defined populations of fibroblasts. Journal of Periodontal Research. 43, 279-289 (2008).
  13. Shabana, A. H., Ouhayoun, J. P., Sawaf, M. H., Forest, N. Cytokeratin patterns of human oral mucosae in histiotypic culture. Archives of Oral Biology. 36, 747-758 (1991).
  14. Kasai, Y., et al. biopsy of human oral mucosal epithelial cells as a quality control of the cell source for fabrication of transplantable epithelial cell sheets for regenerative medicine. Regenerative Therapy. 4, 71-77 (2016).
  15. Oda, D., Dale, B. A., Bourekis, G. Human oral epithelial cell culture. II. Keratin expression in fetal and adult gingival cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 596-603 (1990).
  16. Guarino, M., Tosoni, A., Nebuloni, M. Direct contribution of epithelium to organ fibrosis: epithelial-mesenchymal transition. Human Pathology. 40, 1365-1376 (2009).
  17. Hatakeyama, S., Yaegashi, T., Takeda, Y., Kunimatsu, K. Localization of bromodeoxyuridine-incorporating, p63- and p75(NGFR)- expressing cells in the human gingival epithelium. Journal of Oral Science. 49, 287-291 (2007).
  18. Bayar, G. R., Aydintug, Y. S., Gunhan, O., Ozturk, K., Gulses, A. Ex vivo produced oral mucosa equivalent by using the direct explant cell culture technique. Balkan Medical Journal. 29, 295-300 (2012).
  19. Daniels, J. T., Kearney, J. N., Ingham, E. Human keratinocyte isolation and cell culture: a survey of current practices in the UK. Burns: Journal of the International Society for Burn Injuries. 22, 35-39 (1996).
  20. Carrel, A., Burrows, M. Cultivation of adult tissues and organs outside the body. Journal of the American Medical Association. 55, 1379-1381 (1910).
  21. Rheinwald, J. G., Green, H. Formation of a keratinizing epithelium in culture by a cloned cell line derived from a teratoma. Cell. 6, 317-330 (1975).
  22. Oda, D., Watson, E. Human oral epithelial cell culture I. Improved conditions for reproducible culture in serum-free medium. In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 589-595 (1990).
  23. Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. The Journal of Investigative Dermatology. 81, 33-40 (1983).
  24. Guo, A., Jahoda, C. A. An improved method of human keratinocyte culture from skin explants: cell expansion is linked to markers of activated progenitor cells. Experimental Dermatology. 18, 720-726 (2009).
  25. Smola, H., Krieg, T. The keratinocyte handbook. Irene, M., Leigh, E., Lane, B., Watt, F. M. 375, Cambridge University Press. FEBS Letters 311(1994).
  26. Shwetha, H. R., et al. Ex vivo culture of oral keratinocytes using direct explant cell culture technique. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology: JOMFP. 23, 243-247 (2019).
  27. Yin, J., Yu, F. S. Rho kinases regulate corneal epithelial wound healing. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 295, 378-387 (2008).
  28. Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. The Journal of Clinical Investigation. 120, 2619-2626 (2010).
  29. Strudwick, X. L., Lang, D. L., Smith, L. E., Cowin, A. J. Combination of low calcium with Y-27632 rock inhibitor increases the proliferative capacity, expansion potential and lifespan of primary human keratinocytes while retaining their capacity to differentiate into stratified epidermis in a 3D skin model. PloS One. 10, 0123651(2015).
  30. Orazizadeh, M., Hashemitabar, M., Bahramzadeh, S., Dehbashi, F. N., Saremy, S. Comparison of the enzymatic and explant methods for the culture of keratinocytes isolated from human foreskin. Biomedical Reports. 3, 304-308 (2015).
  31. Rosin, F. C. P., et al. Keratin expression in gingival tissue and primary cultured gingival keratinocytes: Are there differences. Archives of Oral Biology. 117, 104780(2020).
  32. Wang, T., Kang, W., Du, L., Ge, S. Rho-kinase inhibitor Y-27632 facilitates the proliferation, migration and pluripotency of human periodontal ligament stem cells. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21, 3100-3112 (2017).

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ROCK

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