评估培养骨细胞和分离骨干中的氨基酸消耗

氨基酸是含有氨基（-NH₂）和羧基（-COOH）官能团的有机化合物，具有特定于每个氨基酸的可变侧链。一般来说，氨基酸是众所周知的蛋白质的基本成分。最近，氨基酸的新用途和功能已被阐明。例如，单个氨基酸可以被代谢以产生中间代谢物，这些代谢物有助于生物能量学，作为酶促辅因子，调节活性氧或用于合成其他氨基酸1，²，³，⁴，⁵，⁶，7，⁸，^9，10.许多研究表明，氨基酸代谢对于各种情况下的细胞多能性、增殖和分化至关重要³，6，^11，12，¹³，¹⁴，¹⁵，^16，17。

成骨细胞是产生和分泌富含1型胶原蛋白的细胞外骨基质的分泌细胞。为了在骨形成过程中维持高速率的蛋白质合成，成骨细胞需要持续的氨基酸供应。为了满足这一需求，成骨细胞必须积极获取氨基酸。与此一致，最近的研究揭示了氨基酸摄取和代谢在成骨细胞活性和骨形成中的重要性¹⁵，16，¹⁷，¹⁸，^19，20。

成骨细胞从三个主要来源获取细胞氨基酸:细胞外环境、细胞内蛋白质降解和新生氨基酸生物合成。该协议将侧重于评估来自细胞外环境的氨基酸摄取。测量氨基酸摄取的最常见方法依赖于放射性标记（例如，³H或¹⁴C）或重同位素标记（例如，¹³C）氨基酸。重同位素体测定可以更彻底、更安全地分析氨基酸的摄取和代谢，但更耗时，需要数天才能完成，因为制备和衍生化样品需要一天的时间，在质谱仪上分析需要多天，具体取决于样品^{的数量 21，22}。相比之下，放射性标记的氨基酸摄取测定不能提供有关下游代谢的信息，但价格便宜且相对较快，能够在实验开始后2-3小时内完成^23，24。在这里，我们描述了一种易于修改的基本方案，旨在评估体外培养的原代细胞或细胞系或体外单个骨干中的放射性标记氨基酸摄取。这两种方案的应用可以扩展到其他放射性标记的氨基酸和其他骨相关细胞类型和组织。

本文描述的所有小鼠程序均已获得达拉斯德克萨斯大学西南医学中心的动物研究委员会的批准。辐射协议得到了达拉斯德克萨斯大学西南医学中心的辐射安全咨询委员会的批准。

1. 细胞中氨基酸摄取（方案 I）

1. 在12孔组织培养板的每个孔中板5 x 10⁴ 个ST2细胞。在含有 10% FBS、100 U/mL 青霉素和 0.1 μg/mL 链霉素（笔/链球菌）的 α-MEM 中平板细胞。板额外的细胞孔以量化步骤1.12中归一化的每个条件的细胞数。在37°C的加湿细胞培养箱中用5%CO₂孵育细胞。
2. 培养细胞2-3天直至汇合。
3. 在实验当天，准备以下溶液:1x磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 7.4和克雷布斯林格斯HEPES（KRH）缓冲液，pH 8.0:（120mM NaCl，5mM KCl，2mM CaCl 2，1mM MgCl₂，NaHCO ₃，5mM HEPES，1mM D-葡萄糖）。预热至37°C。
4. 吸出培养基并用 1 mL 1x PBS（pH 7.4）洗涤细胞两次。
   注意:此协议也适用于快速分裂非融合细胞。在这种情况下，重要的是将放射性标准化为绝对细胞数或DNA含量。此外，考虑增加培养板或烧瓶的尺寸，以增加总细胞数和cpm值。这对于根据个人经验确定这一点很重要。
5. 吸出 1x PBS 并用 1 mL KRH 洗涤细胞一次。
6. 每 1 mL KRH 稀释 4 μL [1 μCi μL-1] L-[3，4-3 H]-谷氨酰胺原液，制成 4 μCi/mL L^-[3，^4-3H]-谷氨酰胺工作培养基。
   注意:在使用放射性材料之前，请联系您所在机构的辐射安全办公室以获得批准。所有与辐射有关的程序都必须在有机玻璃屏蔽后面进行。
7. 将细胞与含有 4 μCi/mL L-[3，^4-3H]-谷氨酰胺工作培养基的 0.5 mL KRH 孵育 5 分钟。
8. 收集放射性介质并分配到液体废物容器中。用冰冷的KRH短暂洗涤细胞三次以终止反应。收集并丢弃放射性液体废物容器中的所有洗涤液。
9. 向每个孔中加入 1 mL 的 1% SDS，并研磨 10 倍以裂解和匀浆细胞。将细胞裂解物转移到 1.5 mL 管中。将细胞培养板、血清移液器和移液器吸头丢弃在固体放射性废物容器中。
10. 以 >10，000 x g 离心 10 分钟。将上清液转移到含有8mL闪烁溶液的闪烁瓶中。通过剧烈摇动闪烁瓶进行混合。将试管和移液器吸头丢弃在固体放射性废物容器中。
11. 使用闪烁计数器读取每分钟计数 （cpm） 的放射性。将闪烁小瓶丢弃在闪烁小瓶废物容器中。
12. 胰蛋白酶消化，重悬和计数剩余非放射性细胞板中的细胞（参见步骤1.1），以估计裂解的放射性培养物中的细胞数量。使用血细胞计数器，计算每个实验条件下每个非放射性孔的细胞数。将步骤 1.11 中的 cpm 归一化为非放射性板的估计细胞数。
13. 实验完成后，用放射性去污喷雾剂对细胞培养罩、工作台和所有仪器进行净化。最后，进行擦拭测试以确保工作区域无辐射。

2. 新鲜分离的骨组织中氨基酸摄取（方案 II）

1. 将KRH预热至37°C。
2. 对 3 天大的老鼠实施安乐死并去除手臂上的皮肤。用剪刀从肩膀上解开肱骨，解剖出两个肱骨。使用手术刀和镊子取出所有临时组织。从骨头上去除骨骺。
   注意:除肱骨外，该协议还可以适用于从2个月和4个月大的小鼠中分离的新生儿股骨，胫骨和颅骨以及肱骨，股骨和胫骨（未发表的数据）。
3. 从骨头中冲洗出骨髓，并在步骤2.14中称量骨干以使其正常化。
4. 在100°C的1x PBS中煮一个肱骨10分钟以使骨骼脱细胞。脱细胞煮沸的骨用作阴性对照。
   注意:作为质量控制，石蜡将煮沸的和非煮沸的骨头嵌入组织学染色，以目视确认煮沸对骨头脱细胞有效。
5. 在37°C的细胞培养箱中平衡1mL KRH中的两个肱骨30分钟。
6. 每 1 mL KRH 稀释 4 μL 1μCi/μL L-[2，3，^4-3H]-精氨酸原液，制成 4 μCi/mL L-[2，3，^4-3H]-精氨酸在 KRH 中的工作溶液。
   注意:该协议适用于评估选择的任何放射性标记营养素的摄取。L-[2，3，^4-3H]-谷氨酰胺、L-^[14C_U]-丙氨酸和 L-[2，^3-3H]-脯氨酸已经过类似的测试结果。显示精氨酸数据以突出该协议的效用。
   注意:所有使用辐射的程序必须在有机玻璃防护罩后面进行，同时使用适当的个人防护设备（PPE）。
7. 将实验骨和煮沸的对照骨分别在含有4μCi / mL L-[2，3，4-3H]-精氨酸的KRH中在³⁷°C下孵育长达90分钟。
   注意:重要的是通过执行时间过程从经验上确定不同条件下的孵育时间，包括小鼠的年龄，不同的骨骼元素和放射性标记氨基酸的类型。饱和主要发生在大约3-4小时后。应在摄取的线性愤怒的时间点评估摄取。
8. 取出放射性介质并丢弃在液体放射性废物容器中。使用冰冷的 1 mL KRH 洗涤肱骨 3 次以终止反应。将所有洗涤液丢弃在液体放射性废物容器中。
9. 将每块骨转移到 1.5 mL 管中。加入 500 μL RIPA 缓冲液 [150 mM NaCl;5 mM EDTA;50 mM Tris （pH 8.0;0.5% NP40 （v/v）; 0.5% DOX （w/v）; 0.1% SDS （w/v）]。将培养板、血清移液器和移液器吸头丢弃在放射性固体废物容器中。
10. 通过在RIPA缓冲液中用剪刀切碎100次来均质化肱骨。
11. 超声处理（振幅:35%，脉冲1秒）所得均质骨10秒。
    注意:超声处理也已知会产生气溶胶。超声处理步骤可以在生物安全柜中进行。为了减少气溶胶的形成，重要的是不要过度填充管子。小体积样品的超声处理会导致超声处理不完全或因起泡而导致样品损失。如果发生起泡，将样品离心5分钟以沉降。
12. 通过在室温下以>10，000× g 离心10分钟来澄清裂解物。将 200 μL 上清液转移到含有 8 mL 闪烁溶液的闪烁瓶中。通过剧烈摇动闪烁瓶进行混合。将所有固体放射性废物（例如，用过的试管、移液器吸头、板等）丢弃在固体放射性废物容器中。
13. 使用闪烁计数器读取放射性 （cpm）。将用过的闪烁瓶丢弃在指定用于闪烁瓶的放射性废物容器中。
14. 从实验骨的 cpm 中减去煮骨的 cpm（基础值）。用步骤2.3中的骨重使放射性标准化。
15. 在细胞培养罩、仪器和工作台上喷洒放射性净化剂。进行擦拭测试以确认工作区域无辐射。

氨基酸转运由许多膜结合氨基酸转运蛋白调节，这些转运蛋白根据许多特性（包括底物特异性、动力学以及离子和 pH 依赖性25）被分类为不同的转运系统。例如，谷氨酰胺摄取可由Na+依赖性转运系统A，ASC，γ+L和N或Na+非依赖性系统L介导。Na+依赖性系统的特点是能够用Li+替代Na+（系统N）或对氨基酸类似物2-（甲基氨基）异丁酸（MeAIB）（系统A）的敏感性。该实验的目的是确定可归因于每个运输系统的谷氨酰胺消耗量。在含有 120 mM NaCl、含有 120 mM 氯化胆碱的 Na+ 游离 KRH、含有 5 mM MeAIB 的正常 KRH 或含有 120 mM LiCl 的 Na+ 游离 KRH 中的汇合 ST2 细胞中测量 L-[3，4-3H] 谷氨酰胺摄取。总放射性（每分钟计数）归一化为细胞数。Na+去除导致谷氨酰胺摄取减少90%。这表明系统L占谷氨酰胺摄取的10%，而90%的谷氨酰胺摄取在ST2细胞中依赖于Na+（图2）。与无Na +条件相比，Li+的存在仅使谷氨酰胺摄取增加了2%，而5 mM MEAIB不影响谷氨酰胺的摄取。这些数据表明，大部分谷氨酰胺摄取是由系统ASC和γ + L介导的，而系统N和系统A分别负责大约2%和0%的Na +依赖性谷氨酰胺摄取。

我们修改了方案I以表征离 体骨干中的氨基酸摄取。在这个实验中，我们遵循方案II来表征3天龄（p3）小鼠分离的长骨中的精氨酸摄取动力学。为此，我们首先从p3小鼠中解剖了两个肱骨。切除骨骺，旋转骨髓，称量每个肱骨以使其正常化。对侧肱骨被指定为阴性对照，并被煮沸以杀死细胞活动。然后将实验和煮沸的肱骨与放射性标记的4μCi / mL L-[2，3，4-3H]-精氨酸一起孵育长达2小时。精氨酸摄取在该实验过程中以线性方式增加（图3A）。相比之下，煮沸的肱骨在该实验中没有表现出精氨酸摄取的动态增加，而是具有基础放射性，这归因于探针在骨基质中的吸附。标准化和校正的精氨酸摄取如图 3B所示。

图1:放射性标记氨基酸摄取测定的工作流程。 体 外 （方案I）和骨离 体 （方案II）氨基酸摄取测定的示意图概述。 请点击此处查看此图的大图。

图 2:L-[3，4-3H]-谷氨酰胺在体外 ST2 中摄取的动力学特性。 （A） L-[3，4-3H]-谷氨酰胺摄取测定在 ST2 细胞中存在 （+） 或不存在 （-） 钠 （Na+）、MeAIB 或锂 （Li+） 的情况下进行。（B）系统A，N，L或ASC和γ+L对谷氨酰胺吸收的估计贡献的百分比。请点击此处查看此图的大图。

图3:新生儿肱骨离体L-[2，3，4-3 H]-精氨酸摄取。 （A） L-[2，3，4-3 H]-精氨酸摄取 在从 3 天大的 C57BL/6 小鼠分离的活肱骨和煮沸的肱骨中在 2 小时的时间过程中进行。（B）标准化的L-[2，3，4-3H]-精氨酸吸收与煮沸的肱骨。请点击此处查看此图的大图。

作者没有披露。