培养骨细胞和分离骨骨干中氨基酸消耗的评估

摘要

本方案介绍了一种放射性标记氨基酸摄取检测方法，可用于评估原代细胞或分离骨骼中的氨基酸消耗情况。

摘要

骨发育与稳态依赖于成骨细胞的分化和活性。成骨细胞的分化过程依次表现为增殖、蛋白质合成，最终为骨基质分泌。增殖和蛋白质合成需要持续的氨基酸供应。尽管如此，目前对成骨细胞中氨基酸消耗的了解仍十分有限。本文介绍一种高灵敏度的实验方案，利用放射性标记的氨基酸来测定氨基酸消耗。该方法经过优化，可用于定量分析与成骨细胞增殖或分化、药物或生长因子处理，以及各种基因操作相关的氨基酸摄取变化。重要的是，该方法可通用，适用于培养的细胞系或原代细胞中氨基酸消耗的定量分析。 体外 或在分离的骨干中 离体最后，我们的方法可轻松调整，用于测量任何氨基酸以及葡萄糖和其他放射性标记营养物质的转运。

引言

氨基酸是一类含有氨基（-NH₂）和羧基（-COOH）官能团的有机化合物，其侧链可变，且每种氨基酸具有特定的侧链。通常，氨基酸作为蛋白质的基本组成单位而广为人知。近年来，氨基酸的新用途和功能也逐渐被阐明。例如，单个氨基酸可被代谢生成中间代谢物，这些代谢物可参与生物能量代谢、作为酶的辅因子、调节活性氧水平，或用于合成其他氨基酸^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10}。大量研究表明，在多种生理背景下，氨基酸代谢对细胞的多能性、增殖和分化至关重要^3,6,11....

方案

本文所述所有小鼠操作均经达拉斯德克萨斯大学西南医学中心动物研究委员会批准。辐射操作方案亦经达拉斯德克萨斯大学西南医学中心辐射安全咨询委员会批准。

1. 细胞中氨基酸的摄取（方案 I）

1. 在12孔组织培养板的每个孔中接种5 × 10⁴个ST2细胞。使用含10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素和0.1 µg/mL链霉素（Pen/Strep）的α-MEM培养基进行接种。额外接种若干孔细胞，用于在步骤1.12中对各实验条件下的细胞数量进行定量归一化。将细胞置于37 °C、5% CO₂的加湿细胞培养箱中孵育。
2. 培养细胞2–3天，直至细胞融合。
3. 实验当天，配制以下溶液：1×磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 7.4；以及Krebs Ringers HEPES（KRH）缓冲液，pH 8.0（含120 mM NaCl、5 mM KCl、2 mM CaCl₂、1 mM MgCl₂、NaHCO₃、5 mM HEPES、1 mM D-葡萄糖）。将溶液预热至37 °C。
4. 吸除培养基，并用1 mL 1× PBS（pH 7.4）洗涤细胞两次。
   注意：本方案也适用于快速增殖的非融合细胞。在此情况下，必须将放射性活度归一化为绝对细胞数或DNA含量。此外，可考虑增大培....

结果

氨基酸的转运由多种膜结合型氨基酸转运蛋白调控，这些转运蛋白根据底物特异性、动力学特征以及对离子和pH的依赖性等多种特性被划分为不同的转运系统²⁵。例如，谷氨酰胺的摄取可由Na⁺依赖性的A系统、ASC系统、γ+L系统和N系统，或Na⁺非依赖性的L系统介导。Na⁺依赖性系统可通过能否以Li⁺替代Na⁺（N系统）或对氨基酸类似物2-(甲氨基)异丁酸（MeAIB）的敏感性（A系统）加以区分。本实验旨在明确各转运系统在谷氨酰胺消耗中所占的比例。在融合生长的ST2细胞中，分别测定正常KRH缓冲液（含120 mM NaCl）、无Na⁺ KRH缓冲液（含120 mM 氯化胆碱）、含5 mM MeAIB的正常KRH缓冲液或无Na⁺ KRH缓冲液（含120 mM LiCl）中L-[3,4-³H]谷氨酰胺的摄取量。总放射性（每分钟计数）经细胞数量标准化。去除Na⁺导致谷氨酰胺摄取减少90%。这表明在ST2细胞中，L系.......

讨论

本文所述方案提供了一种快速且灵敏的方法，用于评估在不同实验条件下氨基酸的摄取情况 体外 或 离体与市售试剂盒（如谷氨酰胺和谷氨酸检测试剂盒）相比，该方法灵敏度更高、速度更快，且劳动强度更低。^16,17,25在本实验方案中，我们采用Krebs Ringers HEPES缓冲液评估摄取情况。选用该培养基的原因在于其基础配方便于快速、简便地进行多种条件修改，从而用于表征氨基酸摄取的多种实验条件。例如，为检测转运系统是否依赖钠离子，可对该缓冲液进行相应调整。⁺ 依赖型实验中，我们只需用氯化胆碱替代氯化钠即可制备不含钠的溶液⁺ 无KRH缓冲液。这种灵活性有利于研究介导单个氨基酸摄取的各种转运系统。基础培养基如α-MEM也适用于本实验。在此情况下，我们通常购买缺少待研究氨基酸的α-MEM，并在实验中用放射性标记的氨基酸替代。例如，在原代骨髓基质细胞中评估谷氨酰胺摄取时，我们使用无谷氨酰.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 胰蛋白酶	Gibco	25200
12 孔板	Corning	3513
1 mL 注射器	BD precision	309628
30G 针头	BD precision	305106
盐酸精氨酸 L-[2,3,4-³H]-，1 mCi	PerkinElmer	NET1123001MC
Beckman LS6500 液闪仪
氯化钙	Sigma	C1016
氯化胆碱	Sigma	C7077
D-(+)-葡萄糖溶液	Sigma	G8769
解剖工具			镊子、剪刀、手术刀
DPBS	Gibco	14190
乙二胺四乙酸	Sigma	E9884
HEPES(1 M)	Gibco	15630
L-[3,4-³H(N)]-谷氨酰胺	PerkinElmer	NET551250UC
液体闪烁计数小瓶	Sigma	Z190535
8 M 氯化锂溶液	Sigma	L7026
氯化镁	Sigma	M8266
MEMα	Gibco	12561
微量离心管，15 mL	Biotix	89511-256
NP-40	Sigma	492016
氯化钾	Sigma	P3911
碳酸氢钠	Sigma	S6014
氯化钠	Sigma	S9888
脱氧胆酸钠	Sigma	D6750
十二烷基硫酸钠	Sigma	436143
超声破碎仪	Sonic&Materials	VCX130
Tris 碱	Sigma	648311
Ultima Gold（闪烁液）	PerkinElmer	6013329
α-(甲氨基)异丁酸	Sigma	M2383