培养骨细胞和分离骨骨干中氨基酸消耗的评估

摘要

本方案介绍了一种放射性标记氨基酸摄取检测方法，可用于评估原代细胞或分离骨骼中的氨基酸消耗情况。

摘要

骨发育与稳态依赖于成骨细胞的分化和活性。成骨细胞的分化过程依次表现为增殖、蛋白质合成，最终为骨基质分泌。增殖和蛋白质合成需要持续的氨基酸供应。尽管如此，目前对成骨细胞中氨基酸消耗的了解仍十分有限。本文介绍一种高灵敏度的实验方案，利用放射性标记的氨基酸来测定氨基酸消耗。该方法经过优化，可用于定量分析与成骨细胞增殖或分化、药物或生长因子处理，以及各种基因操作相关的氨基酸摄取变化。重要的是，该方法可通用，适用于培养的细胞系或原代细胞中氨基酸消耗的定量分析。 体外 或在分离的骨干中 离体最后，我们的方法可轻松调整，用于测量任何氨基酸以及葡萄糖和其他放射性标记营养物质的转运。

引言

氨基酸是一类含有氨基（-NH₂）和羧基（-COOH）官能团的有机化合物，其侧链可变，且每种氨基酸具有特定的侧链。通常，氨基酸作为蛋白质的基本组成单位而广为人知。近年来，氨基酸的新用途和功能也逐渐被阐明。例如，单个氨基酸可被代谢生成中间代谢物，这些代谢物可参与生物能量代谢、作为酶的辅因子、调节活性氧水平，或用于合成其他氨基酸^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10}。大量研究表明，在多种生理背景下，氨基酸代谢对细胞的多能性、增殖和分化至关重要^{3,6,11,12,13,14,15,16,17}。

成骨细胞是一类分泌性细胞，能够合成并分泌富含I型胶原的细胞外骨基质。在骨形成过程中，为了维持高水平的蛋白质合成，成骨细胞需要持续供应氨基酸。为满足这一需求，成骨细胞必须主动摄取氨基酸。与此一致，近期研究表明氨基酸的摄取与代谢在成骨细胞活性及骨形成过程中具有重要作用^{15,16,17,18,19,20}。

成骨细胞获取细胞内氨基酸的三个主要来源：细胞外环境、细胞内蛋白质降解以及 从头合成 氨基酸生物合成。本方案将重点评估细胞从胞外环境摄取氨基酸的能力。测量氨基酸摄取的最常用方法依赖于放射性同位素标记（例如， ³H 或 ¹⁴C）或重同位素标记（例如， ¹³C）氨基酸。重同位素异构体检测可更全面、安全地分析氨基酸的摄取与代谢，但耗时较长，需数天完成；其中样本制备与衍生化需一天，质谱分析则根据样本数量不同，需耗时数天。^21,22相比之下，放射性标记氨基酸摄取实验无法提供有关下游代谢的信息，但成本较低且相对快速，从实验开始可在2-3小时内完成。^23,24在此，我们介绍一种可轻松修改的基础实验方案，旨在评估放射性标记氨基酸在培养的原代细胞或细胞系中的摄取情况。 体外 或单个骨干 离体这两种方案的应用可拓展至其他放射性标记的氨基酸以及其他与骨骼相关的细胞类型和组织。

方案

本文所述所有小鼠操作均经达拉斯德克萨斯大学西南医学中心动物研究委员会批准。辐射操作方案亦经达拉斯德克萨斯大学西南医学中心辐射安全咨询委员会批准。

1. 细胞中氨基酸的摄取（方案 I）

1. 在12孔组织培养板的每个孔中接种5 × 10⁴个ST2细胞。使用含10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素和0.1 µg/mL链霉素（Pen/Strep）的α-MEM培养基进行接种。额外接种若干孔细胞，用于在步骤1.12中对各实验条件下的细胞数量进行定量归一化。将细胞置于37 °C、5% CO₂的加湿细胞培养箱中孵育。
2. 培养细胞2–3天，直至细胞融合。
3. 实验当天，配制以下溶液：1×磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 7.4；以及Krebs Ringers HEPES（KRH）缓冲液，pH 8.0（含120 mM NaCl、5 mM KCl、2 mM CaCl₂、1 mM MgCl₂、NaHCO₃、5 mM HEPES、1 mM D-葡萄糖）。将溶液预热至37 °C。
4. 吸除培养基，并用1 mL 1× PBS（pH 7.4）洗涤细胞两次。
   注意：本方案也适用于快速增殖的非融合细胞。在此情况下，必须将放射性活度归一化为绝对细胞数或DNA含量。此外，可考虑增大培养板或培养瓶的规格以提高总细胞数和每分钟计数（cpm）值。此参数需根据具体情况通过实验单独确定。
5. 吸除1× PBS，再用1 mL KRH缓冲液洗涤细胞一次。
6. 通过将4 µL的[1 µCi µL^-1] L-[3,4-³H]-谷氨酰胺原液加入1 mL KRH缓冲液中，配制成终浓度为4 µCi/mL的L-[3,4-³H]-谷氨酰胺工作液。
   注意：在使用放射性物质前，请联系所在机构的辐射安全办公室以获取使用许可。所有涉及放射性的操作必须在有机玻璃屏蔽后进行。
7. 加入0.5 mL含4 µCi/mL L-[3,4-³H]-谷氨酰胺工作液的KRH缓冲液，孵育细胞5分钟。
8. 收集放射性培养基并转移至液体放射性废物容器中。用冰浴的KRH缓冲液快速洗涤细胞三次以终止反应。将所有洗涤液收集并弃入液体放射性废物容器中。
9. 每孔加入1 mL 1% SDS溶液，吹打10次以裂解并均质化细胞。将细胞裂解液转移至1.5 mL离心管中。将细胞培养板、移液管和枪头弃入固体放射性废物容器中。
10. 在>10,000 × g条件下离心10分钟。将上清液转移至含有8 mL闪烁液的闪烁瓶中。剧烈振荡闪烁瓶以混匀。将离心管和枪头弃入固体放射性废物容器中。
11. 使用液体闪烁计数仪测定每分钟计数（cpm）。将闪烁瓶弃入闪烁瓶专用废物容器中。
12. 对剩余未接触放射性的细胞培养板（见步骤1.1）中的细胞进行胰酶消化、重悬并计数，以估算被裂解的放射性培养样本中的细胞数量。使用血细胞计数板，统计每种实验条件下非放射性孔中的细胞数量。将步骤1.11测得的cpm值归一化至非放射性培养板估算的细胞数量。
13. 实验结束后，使用放射性去污喷雾对细胞培养超净台、实验台面及所有仪器进行去污染处理。最后进行擦拭测试，确保工作区域无放射性残留。

2. 新鲜分离骨组织中的氨基酸摄取（方案 II）

1. 将 KRH 预热至 37 °C。
2. 处死一只出生3天的小鼠，并去除前肢皮肤。使用剪刀将肱骨从肩部脱臼，分离出两侧肱骨。用手术刀和镊子去除所有多余组织。去除骨两端的骨骺。
   注意：除了肱骨外，本方案还可适用于新生小鼠的股骨、胫骨和颅骨，以及2月龄和4月龄小鼠的肱骨、股骨和胫骨（未发表数据）。
3. 冲洗出骨髓，并称量骨干重量，用于在步骤2.14中进行归一化处理。
4. 将一根肱骨在1 mL 1×PBS中于100 °C煮沸10分钟，以实现去细胞化。煮沸后的去细胞化骨用作阴性对照。
   注意：作为质量控制，可将煮沸与未煮沸的骨骼进行石蜡包埋，进行组织学染色，以直观确认煮沸是否有效实现去细胞化。
5. 将两根肱骨置于1 mL KRH中，在37 °C细胞培养孵箱中平衡30分钟。
6. 通过将4 µL浓度为1 µCi/µL的L-[2,3,4-³H]-Arginine原液加入1 mL KRH中，配制终浓度为4 µCi/mL的L-[2,3,4-³H]-Arginine工作液。
   注意：本方案适用于评估任意选择的放射性标记营养物质的摄取情况。已测试过L-[2,3,4-³H]-谷氨酰胺、L-[¹⁴C_U]-丙氨酸和L-[2,3-³H]-脯氨酸，结果相似。本文展示精氨酸数据以突出本方案的实用性。
   警告：所有涉及放射性操作的步骤必须在有机玻璃屏蔽后进行，并佩戴适当的个人防护装备（PPE）。
7. 将实验组骨和煮沸对照骨分别置于含4 µCi/mL L-[2,3,4-³H]-Arginine的KRH中，在37 °C孵育最多90分钟。
   注意：重要的是需通过时间进程实验，根据小鼠年龄、不同骨骼部位及放射性标记氨基酸类型等条件，经验性地确定最佳孵育时间。摄取饱和通常发生在约3–4小时后。应在摄取线性阶段的时间点进行摄取量评估。
8. 移除放射性培养基，并将其弃入液体放射性废物容器中。用1 mL冰冻KRH洗涤肱骨三次以终止反应。所有洗涤液均弃入液体放射性废物容器中。
9. 将每根骨骼转移至1.5 mL离心管中。加入500 µL RIPA裂解缓冲液[150 mM NaCl；5 mM EDTA；50 mM Tris（pH 8.0）；0.5% NP40（v/v）；0.5% DOX（w/v）；0.1% SDS（w/v）]。将培养板、移液管和枪头弃入固体放射性废物容器中。
10. 在RIPA缓冲液中用剪刀剪切肱骨100次，进行匀浆处理。
11. 对所得匀浆物进行超声处理（振幅：35%，脉冲1秒），持续10秒。
    注意：超声处理可能产生气溶胶，建议在生物安全柜中进行。为减少气溶胶生成，切勿过度填充离心管。小体积样品超声可能导致不完全破碎或因起泡造成样品损失。若出现起泡，可将样品离心5分钟以沉淀。
12. 在室温下以>10,000 × g离心10分钟，澄清裂解液。取200 µL上清液转移至含8 mL闪烁液的闪烁瓶中。剧烈振荡闪烁瓶以混匀。 将所有固体放射性废物（如使用过的离心管、枪头、培养板等）弃入固体放射性废物容器中。
13. 使用液体闪烁计数器测定放射性（cpm）。使用后的闪烁瓶应弃入专用于闪烁瓶的放射性废物容器中。
14. 从实验骨的cpm值中减去煮沸骨的cpm值（基础值），并利用步骤2.3中测得的骨重量对放射性进行归一化处理。
15. 使用放射性去污剂喷洒细胞培养操作台、仪器和实验台面。进行擦拭测试，确认工作区域无放射性污染。

结果

氨基酸的转运由多种膜结合型氨基酸转运蛋白调控，这些转运蛋白根据底物特异性、动力学特征以及对离子和pH的依赖性等多种特性被划分为不同的转运系统²⁵。例如，谷氨酰胺的摄取可由Na⁺依赖性的A系统、ASC系统、γ+L系统和N系统，或Na⁺非依赖性的L系统介导。Na⁺依赖性系统可通过能否以Li⁺替代Na⁺（N系统）或对氨基酸类似物2-(甲氨基)异丁酸（MeAIB）的敏感性（A系统）加以区分。本实验旨在明确各转运系统在谷氨酰胺消耗中所占的比例。在融合生长的ST2细胞中，分别测定正常KRH缓冲液（含120 mM NaCl）、无Na⁺ KRH缓冲液（含120 mM 氯化胆碱）、含5 mM MeAIB的正常KRH缓冲液或无Na⁺ KRH缓冲液（含120 mM LiCl）中L-[3,4-³H]谷氨酰胺的摄取量。总放射性（每分钟计数）经细胞数量标准化。去除Na⁺导致谷氨酰胺摄取减少90%。这表明在ST2细胞中，L系...

讨论

本文所述方案提供了一种快速且灵敏的方法，用于评估在不同实验条件下氨基酸的摄取情况 体外 或 离体与市售试剂盒（如谷氨酰胺和谷氨酸检测试剂盒）相比，该方法灵敏度更高、速度更快，且劳动强度更低。^16,17,25在本实验方案中，我们采用Krebs Ringers HEPES缓冲液评估摄取情况。选用该培养基的原因在于其基础配方便于快速、简便地进行多种条件修改，从而用于表征氨基酸摄取的多种实验条件。例如，为检测转运系统是否依赖钠离子，可对该缓冲液进行相应调整。⁺ 依赖型实验中，我们只需用氯化胆碱替代氯化钠即可制备不含钠的溶液⁺ 无KRH缓冲液。这种灵活性有利于研究介导单个氨基酸摄取的各种转运系统。基础培养基如α-MEM也适用于本实验。在此情况下，我们通常购买缺少待研究氨基酸的α-MEM，并在实验中用放射性标记的氨基酸替代。例如，在原代骨髓基质细胞中评估谷氨酰胺摄取时，我们使用无谷氨酰...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 胰蛋白酶	Gibco	25200
12 孔板	Corning	3513
1 mL 注射器	BD precision	309628
30G 针头	BD precision	305106
盐酸精氨酸 L-[2,3,4-³H]-，1 mCi	PerkinElmer	NET1123001MC
Beckman LS6500 液闪仪
氯化钙	Sigma	C1016
氯化胆碱	Sigma	C7077
D-(+)-葡萄糖溶液	Sigma	G8769
解剖工具			镊子、剪刀、手术刀
DPBS	Gibco	14190
乙二胺四乙酸	Sigma	E9884
HEPES(1 M)	Gibco	15630
L-[3,4-³H(N)]-谷氨酰胺	PerkinElmer	NET551250UC
液体闪烁计数小瓶	Sigma	Z190535
8 M 氯化锂溶液	Sigma	L7026
氯化镁	Sigma	M8266
MEMα	Gibco	12561
微量离心管，15 mL	Biotix	89511-256
NP-40	Sigma	492016
氯化钾	Sigma	P3911
碳酸氢钠	Sigma	S6014
氯化钠	Sigma	S9888
脱氧胆酸钠	Sigma	D6750
十二烷基硫酸钠	Sigma	436143
超声破碎仪	Sonic&Materials	VCX130
Tris 碱	Sigma	648311
Ultima Gold（闪烁液）	PerkinElmer	6013329
α-(甲氨基)异丁酸	Sigma	M2383