本文介绍了一种利用微型X射线计算机断层扫描技术对小鼠后肢血管进行可视化和定量分析的方法。
本文内容
摘要
摘要
血管是具有树状结构的复杂网络，血管网络对于维持血液循环和器官功能至关重要。因此，阐明血管形成机制对于解析发育过程和病理机制极为有益。小鼠后肢血管常被用作生理性与病理性血管生成的研究模型。目前主要通过组织切片的二维方法进行评估，然而针对三维（3D）血管形态的评估方法尤为有限。本文介绍了一种利用计算机断层扫描（CT）对小鼠后肢进行成像的方法。通过降主动脉注射具有放射不透性的树脂，使整个血管系统被染料填充。通过调节染料注射时间，还可实现动脉特异性填充，且样品可在任意微焦点X射线CT设备上进行扫描。该造影方法为小鼠下肢血管的三维评估提供了基础技术。此外，该方法还可用于可视化膈肌以下全部血管，并评估腹腔器官中的血管结构。
引言
血管是具有树状结构的复杂网络。血管生成和新血管形成在维持器官稳态中发挥关键作用1。血管生成的调控被用于缺血性和恶性疾病的治疗2。因此，理解血管生成的潜在机制至关重要。小鼠后肢血管常被用作血管研究的有用模型3；同侧髂动脉或股动脉结扎是一种已知的后肢缺血模型，用于评估生理性和病理性血管生成过程中的血管生成和血管重塑4。然而，对血管生成的评估主要通过切片染色进行，而用于评估三维血管形态的方法则尤为有限。
与切片染色相比，CT能够实现三维可视化。最近，Weyers等人报道了一种适用于CT成像的复杂方案，可实现小鼠成年冠状循环系统的可视化5。我们对其方法进行了改进，建立了一种适用于小鼠下肢血管CT成像的样本制备方法6。该方法通过降主动脉注射一种射线不透过性树脂，使下肢血管被染料填充。通过调节染料注射时间，还可实现动脉特异性填充，且样本可在任意微型X射线计算机断层扫描设备上获取。该对比方法为小鼠膈肌以下区域、腹腔器官及下肢血管的三维评估提供了基础技术。
方案
所有操作均按照熊本大学动物护理指南（批准编号：M30-040/A2020-105）进行，该指南符合美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》（出版号：85-23，2011年修订版）。
1. 准备
- 准备灌注装置和血管扩张缓冲液（4 mg/L 盐酸罂粟碱，4 g/L 腺苷，1 g/L 肝素，1 U/mL 磷酸盐缓冲液 (PBS)）。
注意：回流装置和血管扩张试剂与 Weyers 等人5报道的相同。 - 连接 22 G 导管、2 mL 延长管和三通阀（图 1A）。
注意：根据动物大小调整导管规格。对于成年 C57BL/6 小鼠，22 G 最为合适。 - 用血管扩张缓冲液填充压力灌注装置（图 1A）。
注意：避免产生气泡，以防止影响造影剂的填充。
2. 灌注
- 在手术前30分钟，向腹腔内注射1 U/g肝素的PBS溶液。
- 用异氟烷完全麻醉小鼠，并通过颈椎脱位法实施安乐死。
- 断头后，在胸骨正中做切口，并用针固定打开的胸腔。
注意：为避免造影剂泄漏，操作时应避免损伤膈肌。 - 剪断升主动脉并取出心脏。
- 取出肺组织，暴露降主动脉。
注意：切勿损伤降主动脉。 - 斜向剪断降主动脉以暴露其横截面（图1B）。
注意：不要剥离主动脉；斜切面更利于导管插入。 - 在灌注扩血管缓冲液的同时，将22 G导管插入降主动脉。
注意：在扩血管缓冲液流动状态下插入导管可避免空气污染。 - 固定导管根部（图1C）。
- 打结以防止因反流导致的泄漏。
- 在13至15 kPa的恒定压力下，灌注预热的扩血管溶液（盐酸罂粟碱，4 g/L；腺苷，1 g/L；肝素，1 U/mL），持续3分钟。
- 在相同压力下灌注4%多聚甲醛的PBS溶液3分钟。
注意：可通过观察足部运动来确认固定是否成功（图1D）。 - 在灌注前即刻配制造影剂。
注意：根据样本调整稀释比例；对于成年小鼠，染料与稀释液按1:1比例混合。 - 停止灌注，并用2 mL稀释后的造影剂充满延长管（图1E）。
注意：应缓慢注射造影剂，以避免损伤血管。 - 在13至15 kPa的恒定压力下灌注造影剂。
- 如需显示动脉，可通过观察脚趾甲确认造影剂是否已到达动脉（图1F）。
- 如需显示所有血管，应检查膈肌处的下腔静脉，以确认造影剂已完成全身循环。
注意：初始阶段的造影剂中仍含有扩血管溶液，因此其充分循环至关重要。
- 关闭三通阀并移除导管（图1G）。
注意：若未关闭三通阀，造影剂将发生反流。 - 将样本在4 °C条件下孵育过夜。
- 去除皮肤，并将其固定于10%甲醛溶液中。
3. 可视化
注意：可视化方案因CT扫描仪的不同而有所差异。本方案中使用的是微焦点X射线CT扫描仪。必须根据每台CT扫描仪的具体情况优化成像方法。
- 将样本固定在含有 PBS 的 50 mL 离心管中。
- 将样本管放置在桌面上。
- 以 50 kV 电压和 600 µA 电流对样本进行扫描，确保焦点到中心的距离为 75.2 mm。
注意：在此设置下，1 个体素的尺寸为 28.7 µm × 28.7 µm × 28.7 µm。 - 使用 Fiji（一个用于生物图像分析的开源平台）加载获取的图像数据。
- 利用腓肠肌确定肌肉体素值。
- 使用矩形工具选中腓肠肌区域。
- 从直方图中检查平均值和标准差（SD）（分析 | 直方图）。
- 将肌肉体素密度定义为腓肠肌平均值加 2 倍标准差（mean + 2SD）。
- 将肌肉体素密度设为阈值的下限水平（图像 | 调整 | 阈值 | 设置 | 下限阈值）。
注意：设定阈值后，血管区域和骨组织区域仍保留在二值化数据中。
结果
如果正确执行该方案，可以观察到下肢的所有血管（图2A）。在后肢缺血模型中，未结扎的股动脉与股静脉平行走行（图2B），通过对比剂的中断可确认已结扎的股动脉（图2C）。结果显示了侧支血管的形成（图2D）。侧支循环在结扎动脉近端的动脉与小腿区域的动脉之间形成，并分布于股动脉的腹侧和背侧。臀下动脉起始于骨盆背侧，沿大腿外侧行走，在缺血侧显著扩张。
充盈造影剂的血管会被造影剂完全填充（图2E）；若造影剂出现中断，提示有非造影剂物质（如血液、扩血管缓冲液或气泡）混入，或造影剂灌注不足（图2F）。如果血管发生收缩，血管扩张和固定效果将不佳。尽管CT成像仅能显示造影剂，但通过肉眼观察或体视显微镜观察，仍可看到体表的动脉（图2G）。因此，使用造影剂更便于评估血管缺陷（图2H）。
图 1：实验流程示意图。（A）压力灌注装置，通过2 mL延长管和三通旋塞连接的22 G导管。（B）斜切升主动脉以暴露其横截面（黄色箭头）。（C）使用两枚针固定导管（黄色箭头）。（D）固定后下肢自然伸展（黄色箭头）。（E）通过三通旋塞注入造影剂，注射方向由黄色箭头指示。（F）后肢指甲部位充满造影剂（黄色箭头）。（G）关闭旋塞并从灌注装置上取下。请点击此处查看该图的放大版本。
图2血管图像。 (A后肢骨骼与血管的整体图像。B) 股动脉（红色箭头）和股静脉（蓝色箭头）。C结扎的股动脉（黄色箭头）。其周围因阻塞物而中断（黄色虚线）。D结扎侧的侧支血管（黄色箭头）。黄色虚线表示被切断的股动脉。E) 隐动脉（红箭头）和隐静脉（蓝箭头）显影良好的样本。F灌注不足导致隐静脉血管中断（黄色虚线）。G) 代表性样本的体视显微镜观察。右侧股动脉（黄色箭头）已充盈造影剂。H) 体视显微镜下观察失败样本。右侧股动脉（黄色箭头）未见造影剂。比例尺 = 1 mmB-F），2 mm（G，H），10 mm（A). 请点击此处以查看此图的放大版本。
讨论
本报告介绍了一种用于可视化下半身血管的复杂方法。该过程包含若干关键步骤：首先是注射造影剂前的预灌注。如果未能充分清除血液，造影剂将无法完全填充血管系统。此外，气泡的存在会干扰造影剂的填充，因此必须彻底排除管路中的空气。再者，由于造影剂在注射后不会立即凝固，因此不应过度移动样本。
该方法可用于评估血管和血液循环的增加情况，例如侧支循环的形成。然而，作为一种局限性，难以评估狭窄的血管，因为很难区分狭窄与造影剂人为减少的情况。此外，由于难以将血管与骨骼区分开来，对骨骼内血管的评估也较为困难。
另一种用于三维可视化的替代方法是免疫染色。结合组织透明化技术，已有多种方法可用于三维成像7。免疫染色的优势在于可利用抗体对特定蛋白质进行标记。最近有研究报告了基于免疫染色的全身体成像技术8；然而，基于CT的成像方法则无需任何组织透明化预处理。
该方法可实现对膈肌以下所有血管的可视化，包括腹部器官。腹部器官中的血管生成对维持内环境稳态及疾病发展具有重要影响9,10。由于本方案已针对下肢血管的评估进行了优化，因此通过针对特定器官的预处理，可实现对与任何因素（如炎症或肿瘤）相关的血管生成过程的可视化。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢 Yasuyo Kimura、Megumi Nagahiro 和 Saeko Tokunaga 在动物实验中提供的出色技术支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 mL 注射器 | TERUMO | SS-01T | |
| 10% 福尔马林溶液 | Fujifilm-Wako | 068-03841 | |
| 10x 磷酸盐缓冲液（无）(PBS) | Fujifilm-Wako | 163-25265 | 配制 1x PBS |
| 22 G 导管（22 G S5 x 1" V(F)） | MEDIKIT | HP2140 | 仅使用导管部分 |
| 23 G 针头 | TERUMO | NN-2325R | 用作固定针 |
| 含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液 | Fujifilm-Wako | 163-20145 | |
| 5 mL 注射器 | |||
| 5-0 缝合线带针 | Alfresa Pharma Corporation | ER1205SB45 | |
| 腺苷 | Sigma-aldrich | A9251-5G | 用于血管扩张溶液 |
| Dumont #55 镊子 | FST | No.11255-20 | |
| 延长管 | TOP | X2-FL50 | |
| Falcon 50 mL 离心管 | CORNING | 352098 | |
| Graefe 镊子 | FST | No.11051-10 | |
| 肝素钠 5,000 单位/5 mL | Mochida Co. Ltd. | 224122458 | |
| 异氟烷 | Fujifilm-Wako | 099-06571 | |
| Microfil 灌注造影剂 | Flow Tech Inc. | MV-117 | 将液体 MV-Compound（染料）与 MV-Diluent 按 1:1 混合 |
| 盐酸罂粟碱 | Fujifilm | 164-18002 | 用于血管扩张溶液 |
| 小型动物麻醉机 | Muromachi Kikai Co. Ltd. | MK-A100ecoW-ST | |
| 弹簧剪—侧向弯曲 | FST | No.15006-09 | |
| 手术剪—锐头钝尾 | FST | No.14001-12 | |
| 三通阀 | TERUMO | TS-TR1K | |
| 移液吸头 | SAMCO SCIENTIFIC | SM262-1S | 用于混合造影剂 |
| X 射线 CT 扫描仪 | Toshiba IT & Control Systems Corporation | TOSHIBA TOSCANNER 32300 FPD |
参考文献
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- Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).
- Kochi, T., et al. Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: functional role in the design and understanding of ischemia models. PLoS One. 8 (12), 84047(2013).
- Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737-1746 (2009).
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- Fernandez, M., et al. Angiogenesis in liver disease. Journal of Hepatology. 50 (3), 604-620 (2009).
- Li, S., et al. Angiogenesis in pancreatic cancer: current research status and clinical implications. Angiogenesis. 22 (1), 15-36 (2019).
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