$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
所有动物程序均由密歇根大学机构动物护理和使用委员会批准。
1. 选择碳纤维阵列
- 从 图1所示的三种设计之一中选择印刷电路板（PCB）。
注意:对于此协议，Flex 阵列将是重点。
- 请参阅 Chestek Lab 网站 （https://chestekresearch.engin.umich.edu） 上的 PCB 设计，免费，可随时寄往 PCB 印刷厂订购印刷。
- 有关每个板的连接器及其规格的摘要，请参阅 表 1 ，以帮助选择适用于特定实验设置的连接器。
2. 将连接器焊接到电路板上
- 将烙铁设置为 315 °C （600 °F）。
- 将助焊剂涂在PCB上的所有焊盘上。
注意:管内的助焊剂可以挤过垫子，而锅中的助焊剂可以通过在所有垫子上自由涂抹助焊剂来用棉头涂药器的木制端施加。
- 在 Flex 阵列的背板上形成小堆焊料（图 2A）。
- 将底部一排连接器引脚焊接到焊盘的后排（图2B）。
注:Chestek实验室提供的所有电路板设计都经过精心设计，使连接器能够与指定的电路板精确配对。
- 为此，请将连接器两侧的引脚焊接在易于接近焊料堆的地方。固定后，轻轻推动前引脚之间的烙铁头，以焊接背面的其余连接。
注:一旦后排引脚固定，连接器的其余部分将与其指定的焊盘上方的每个引脚对齐。
- 通过在每个引脚上施加少量焊料，将前排引脚焊接到电路板上。如果焊接不迅速，请再涂上一层助焊剂。
- 用100%异丙醇（IPA）和短刷毛刷清洁多余的助焊剂。
- 使用23 G针头和1 mL注射器将焊接连接封装在延迟设置的环氧树脂中（图2 C，D），注射器将斜面朝下放置在引脚上。缓慢地将环氧树脂推入注射器，使其流入并沿着连接。
- 将电路板放置过夜，以便延迟的环氧树脂可以固化。
注意:虽然延迟设置环氧树脂的产品插入物表明它可以在30分钟内固化，但过夜可以形成更稳定的连接。
- 通过在电路板背面铺设一小排延迟设置的环氧树脂并将其拉到连接器的边缘，将电路板的背面固定到连接器的侧面。
- 让板子再次在一夜之间治愈。
注意:此时，请存储数组或继续生成。如果在构建中暂停，请将阵列存放在室温下干净干燥的盒子中。
3. 纤维种群
- 切割拉动的玻璃毛细管，使其尖端适合阵列的痕迹（图3A）。
- 使用玻璃拉拔器和细丝，使用以下设置制作毛细管:热量 = 900，拉力 = 70，速度 = 35，时间 = 200，压力 = 900。
注:编号为无单位，特定于此设备（请参阅 材料表）。
- 使用两个棉头涂抹器的木制末端（每份银环氧树脂一个）在塑料盘中舀取一小块约1:1比例的银环氧树脂，并使用用于舀的相同棍子混合。混合后丢弃涂抹器。
- 使用剃须刀片将碳纤维束的末端切割2-4毫米到一张打印机纸上。为了轻松分离束中难以梳理的纤维，请在束的顶部轻轻拉一张层压纸。
注:层压纸片将静电转移到纤维中，纤维会自行分离。
- 用玻璃毛细管在电路板一侧的每隔一对迹线之间涂上银环氧树脂（图3B）。
- 取一小滴环氧树脂到拉动的毛细管的末端。轻轻地涂抹在电路板末端的每隔一条迹线之间，以填充间隙。
注意:间隙应填充到两条迹线的顶部，而不会溢出以接触相邻迹线。每个跟踪都连接到一个通道。这种环氧树脂聚集方法意味着每根光纤将有两个通道连接到它。这是因为两条走线允许更好的光纤对准，并且通道中的冗余有助于确保电气连接。
- 使用特氟龙涂层的镊子在每个环氧树脂痕迹中放置一根碳纤维（图3C）。
- 使用干净的拉毛细管来调整碳纤维，使它们垂直于Flex Array板的末端并埋在环氧树脂下方（图3D）。
- 将阵列放在木块上，纤维末端悬在块的边缘。
注意:后端的权重将使阵列保持在块上。
- 在140°C下烘烤木块和阵列20分钟，以固化银环氧树脂并将纤维锁定到位。
- 对主板的另一侧重复步骤 3.4-3.8。
注意:数组可以在任何烘焙步骤后存储;但是，如果在填充电路板时应用的银环氧树脂太少，则存储盒中的静电可能会导致纤维从电路板上拉开。
- 在盒子内创建一个凸起的粘合剂平台，以便可以将大部分电路板粘在粘合剂上，从而使电路板的纤维末端悬挂在盒子内以防止纤维断裂。在室温下储存。
注:如果纤维在储存过程中从电路板上拉开，请用干净的拉动的玻璃毛细管将环氧树脂从痕迹中刮出，然后重复步骤3.1-3.8以更换纤维。从这一点开始，阵列必须与以这种方式悬挂的光纤一起存储，以防止光纤断裂。
4. 应用紫外线（UV）环氧树脂对碳纤维进行绝缘
- 使用干净的毛细管，并在电路板一侧暴露的走线上涂抹一个小液滴（直径约0.5毫米的UV环氧树脂（图4A）。继续添加UV环氧树脂液滴，直到痕量完全覆盖。
注意:不要让紫外线环氧树脂通过PCB末端进入碳纤维，以确保以后顺利插入。
- 在UV笔光下固化UV环氧树脂2分钟（图4B）。
- 对主板的另一侧重复步骤 4.1-4.2。
- 使用立体镜标线和手术剪刀将纤维切割至1毫米。
注意:此时可以存储数组，直到准备好继续执行后续步骤。它们应该储存在一个盒子里，这个盒子会把碳纤维从盒子本身抬高。阵列可以在室温下无限期地存储。
5. 使用 1 kHz 阻抗扫描检查电气连接（图 5）
- 将 1 mm 的碳纤维浸入 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中。
- 要完成电路，请使用氯化银-银 （Ag|AgCl）参比电极和不锈钢棒（对电极）。
- 使用烧杯夹，悬挂Ag|AgCl 电极位于 1x PBS 中，并将其连接到所用阻抗系统的基准电压源。
- 使用烧杯夹，将不锈钢杆悬挂在1x PBS中，并连接到所用阻抗系统的反电极输入。
- 使用在单个正弦波形中设置为 0.01 Vrms 的 1 kHz 扫描频率的恒电位仪，对每根光纤运行 1 kHz 阻抗扫描。在每次扫描开始时将恒电位仪设置为0 V，持续5秒，以稳定记录的信号。通过恒电位仪相关软件记录测量结果。
注意:测量可以在构建中的任何一点进行;但是，它们仅在绝缘前和尖端准备期间才需要。 表 2 列出了每个构建步骤后的典型阻抗范围，频率为 1 kHz，供用户参考。
- 将纤维浸入小烧杯中三次，然后在去离子（DI）水中冲洗纤维，并在室温下晾干。
注意:阵列可以保留在存储中，直到用户可以继续执行下一步。
6. 聚对二甲苯C绝缘
注:聚对二甲苯C被选为碳纤维的绝缘材料，因为它可以在室温下沉积在成批的阵列上，并提供高度保形的涂层。
- 使用配接连接器屏蔽 Flex Array 连接器。
- 将一批8-12个阵列放入带有凸起粘合剂平台的存储盒中，以便它们可以在一次运行中绝缘。放置阵列，使阵列的连接器端位于胶粘性平台上，阵列的光纤端悬垂（图6），以防止光纤粘附在胶粘剂上并拉出，并确保纤维上有均匀的Parylene涂层。
- 在洁净室中，将Parylene C沉积系统中的阵列涂覆至800nm的厚度，并佩戴所使用的单个洁净室定义的适当的个人防护设备（PPE）。
注意:在这里，PPE被定义为洁净室的鞋子，西装，头套，护目镜，口罩和乳胶手套。应该注意的是，这是进入洁净室的标准PPE。此步骤可以外包给Parylene涂层公司，但需要付费;但是，商业服务可能能够一次涂覆更多阵列。每个Parylene C沉积系统可能具有不同的安全预防措施。使用前请与技术人员联系，以确保用户安全。
- 从 Flex 阵列中卸下用作掩模的配接连接器。
- 将阵列放入新盒子中进行存储，直到准备就绪。
7. 笔尖制备方法
注:本节中的两个尖端准备工作使用激光切割光纤。使用激光时，应始终佩戴合适的个人防护用品，例如耐所用波长的护目镜，激光附近的其他实验室用户也应穿着PPE。虽然这些步骤中列出的光纤长度是推荐的长度，但用户可以尝试适合其需求的任何长度。用户必须选择以下尖端准备方法之一，因为仅靠剪刀切割不足以重新暴露电极25。
- 钕掺杂钇铝柘榴石（Nd:YAG）激光切割
- 用手术剪刀将纤维切成550μm。
- 使用532nm Nd:YAG脉冲激光器（5 mJ /脉冲，5 ns持续时间，900 mW）从纤维尖端切除50μm，以重新暴露Parylene C下方的碳（通常需要2-3个脉冲）。
- 使用此激光系统随附的内置立体镜对齐光纤尖端。
注:该系统允许用户对齐一个窗口（此处为50 μm x 20 μm（高度x宽度））以包含光纤的末端。
- 将立体镜聚焦在光纤末端，放大倍率为500倍，以实现准确和精确的切割。
注意:聚对二甲苯C将从尖端略微消融（<10μm），留下钝的圆柱形尖端。
- 喷灯磨刀25，26，27
- 用手术剪刀将纤维切成300μm。
- 将阵列浸入去离子水皿中，连接器面朝下，并用少量腻子固定在盘子的底部。
- 使用笔式相机将纤维与水面对齐，使纤维几乎接触水面。
- 将丁烷喷灯火焰调节到3-5毫米，然后以来回运动将其放在纤维顶部以锐化纤维。
注意:当火焰经过纤维尖端时，它们会发出橙色的光芒。
- 从腻子上取下阵列，然后在立体镜下检查其在50倍放大倍率下是否有尖尖的尖端。
注意:如果观察到尖头，则无需进一步喷灯。如果吸头变钝，请重复步骤 7.2.2-7.2.5。
- 紫外激光切割28
注:由于紫外激光器的大焦点大于柔性阵列碳纤维的间距，目前紫外激光只能用于零插入力（ZIF）和宽板设计。
- 用手术剪刀将碳纤维切成1毫米。
- 将紫外激光器固定在三个正交配置的电动载物台上。
注:紫外激光器是一种多模氮化铟镓（InGaN）半导体，输出功率为1.5 W，波长为405 nm。
- 确保激光具有连续光束，以便快速有效地对准和切割。
- 将阵列固定到位，以保持电极的静止水平平面，以便激光通过。确保阵列与激光器保持适当的距离，以便光纤与激光的焦点一起发光。为此，请为激光器提供较低的功率，并调整距离以最佳方式聚焦在光纤上28。
- 以25μm/s的速度将紫外激光焦点移动到光纤平面上，将光纤切割到所需的长度（在这里，所有光纤都被切割成500μm）。
注意:光纤在切割前会发出明亮的光。处理后储存纤维，直到它们准备好涂覆导电聚合物。
8. 聚（3，4-乙烯二氧噻吩）:p甲苯磺酸盐（PEDOT:pTS）导电涂层，用于降低阻抗
- 将0.01 M 3，4-乙烯二氧基噻吩和0.1M对甲苯磺酸钠在50mL去离子水中混合溶液，并在搅拌板上搅拌过夜（〜450rpm）或直到溶液中未观察到颗粒。
注意:将溶液存放在耐光容器中。混合后冷藏溶液，使溶液最多可使用30天。
- 在 1 个 PBS 中使用与之前相同的参数（步骤 5.2-5.3）运行 1 kHz 阻抗扫描。请注意哪些光纤具有良好的连接（<1 MΩ，通常是 16 根光纤中的 14-16 根）。
- 使用PEDOT:pTS电镀以降低电极的阻抗。
- 将光纤尖端浸没在PEDOT:pTS溶液中。
- 按照步骤 5.2 中列出的步骤操作，将 1 个 PBS 解决方案切换出 PEDOT:pTS，并缩短电路板与所应用电流通道的所有连接。
- 使用恒电位仪对每根优质纤维应用600 pA，持续600秒。
- 关闭单元格，并在运行结束时让它休息5秒。
- 从溶液中取出纤维，并在去离子水中冲洗。
- 重新测量 1 kHz 阻抗以检查光纤是否已成功涂覆（使用步骤 5.2-5.3 中列出的相同参数）。
注:良好的光纤被指定为阻抗小于 110 kΩ 的任何光纤。
9. 连接接地线和参考线
- 使用镊子从地面上轻轻刮掉Parylene C和板上的参考通孔。在此电路板设计中，接地和参考通孔成对地短路。
注:接地和参考通孔位于 Flex 阵列连接器附近，是连接器附近的四个小金圆。用户只需从最靠近碳纤维的通孔中取出Parylene C即可进行测量。
- 用剃须刀片切下两根5厘米长的绝缘银线。将电线的两端从一端断开绝缘2-3 mm以连接到Flex Array，从另一端断开约10 mm，以便在手术过程中更容易接地和参考。
- 将烙铁加热回 600 °F。 在通孔上涂抹少量助焊剂。
- 将一根导线（2-3 mm 外露端）插入电路板上的每个 ePhys 通孔。将焊料涂在过孔的顶部（图7A）。让探头冷却，然后将其翻转以在通孔的背面施加少量焊料（图7A）。
- 使用手术剪刀剪掉从背面焊料堆中伸出的任何裸露电线，因为这有助于减少记录中看到的噪音（图7B）。
- 将阵列放回储物盒中，使电线向后弯曲并远离光纤。将电线固定在胶带上，以防止潜在的光纤-电线相互作用（图7C）。
10. 外科手术
注意:大鼠皮层用于测试紫外激光制备的纤维的功效，如前所述7，20。这些探头将在神经中工作，因为它们的几何形状和阻抗水平与喷灯制备的纤维相似。该手术非常谨慎地进行，以验证紫外激光不会改变电极的响应。
- 使用氯胺酮（90mg / kg）和木拉嗪（10mg / kg）的组合麻醉成年雄性Long Evans大鼠。通过脚趾捏测试确认麻醉。在眼睛上涂抹软膏，以防止大鼠的眼睛在手术过程中变干。
- 在右半球的运动皮层上方创建一个2 mm x 2 mm的开颅手术。通过测量胸前 1 mm 和中线外侧 1 mm 来识别开颅术的左下角。
- 将阵列安装到立体定位仪器中，通过轻轻降低纤维直到它们接触到硬脑膜表面，将立体定位器器在硬脑膜处归零。将阵列抬离手术部位，然后将其移动到一侧，直到它准备好插入。
- 通过轻轻拉动针头，在组织表面用倒刺的末端切除硬脑膜。一旦硬脑膜的一部分向大脑开放，使用一对细镊子进一步帮助拉开硬脑膜。
- 使用立体定位器将纤维插入开颅术，将1.2毫米插入大脑，用手缓慢下降。
- 使用特定于 ePhys 的头台和前置放大器记录 ePhys 数据 10 分钟。
- 设置前置放大器高通滤波器，以处理2.2 Hz的信号，7.5 kHz的抗混叠，并在25 kHz时进行采样。
注意:对于这些测量，仅记录自发活动。不应用任何刺激。
- 安乐死
- 将大鼠置于异氟醚下，在1升/分钟的氧气下以5%的速度放置，直到生命迹象停止（20-30分钟）。用斩首确认安乐死。
11. 尖峰排序
- 使用尖峰排序软件，使用以前报告的方法对数据进行排序和分析8。
- 在所有通道（250 Hz角，4阶 巴特沃斯）上使用高通滤波器，并将波形检测电平设置为-3.5×RMS阈值。
- 使用高斯模型对具有相似特征的峰值进行聚类和峰值。组合并平均至少 10 个波形的簇，以纳入进一步分析。
- 消除或删除数据集中所有不是尖峰的波形。
- 对所有通道进行排序后导出数据，并使用分析软件绘制并进一步分析波形。
12. 扫描电子显微镜成像
注意:此步骤将使数组不可用，应仅用于检查尖端处理结果，以检查数组是否得到正确处理。无需执行此步骤即可生成成功的阵列。下面总结了SEM过程的一般概述;但是，以前未使用过SEM的用户应从经过培训的用户那里获得帮助。
- 剪下PCB的光纤端，并将其安装在碳带屏蔽的SEM短截线上。将阵列放在堆叠碳带（4-5层）的小平台上，以防止碳纤维粘在SEM短截线上。
- 按照溅射镀膜机制造商概述的程序，用金（100-300 Å）溅射镀膜阵列。
- 要检查烙铁头处理效果，请在SEM中以15 mm的工作距离和20 kV光束强度对阵列进行成像。
注:阵列可以在低真空下进行无溅射镀膜成像，如图 8D 所示，用于紫外激光切割光纤。对于此设置，建议工作距离为11-12 mm，光束强度为4 kV。