老年人血浆中酚类代谢物的半靶向超高效色谱耦合质谱分析

肌肉减少症是一种进行性骨骼疾病，与老年人群肌肉加速丧失有关。这种情况会增加跌倒的风险，并导致日常生活活动有限。肌肉减少症见于约 5%-10% 的 65 岁以上人群和约 50% 的 80 岁或以上人群¹。尚未批准用于治疗肌肉减少症的特定药物，因此通过身体活动和均衡饮食进行预防非常重要^1，2。使用富含乳蛋白和必需氨基酸的特殊配方食品进行营养干预，在预防肌肉减少症方面显示出积极的结果²。在其他研究中，作者在饮食中加入了维生素和抗氧化剂，如维生素E和异黄酮，增加了腰部和臀部肌肉增加的益处³。

Brosimum alicastrum Sw.（Ramón）是一种生长在墨西哥热带地区的树木;由于其高营养价值，它已被玛雅文化食用⁴。它是蛋白质，纤维，矿物质和酚类抗氧化剂（如绿原酸⁵）的良好来源。由于它可以磨成粉末并用于烘焙产品或饮料中食用，最近的研究已经评估了将Ramón种子粉（RSF）掺入不同的食物中以提高其营养价值。配制了RSF补充的卡布奇诺风味饮料，该饮料富含膳食纤维，每份含有超过6克蛋白质，并被消费者高度接受;因此，它被认为是满足特殊饮食要求的潜在替代方案⁶。在一项后续研究中，RSF还用于配制松饼和富含蛋白质，膳食纤维，微量营养素和酚类抗氧化剂的新饮料。松饼和饮料用于老年人的饮食干预，他们每天食用两次产品，持续30天。在此期间之后，参与者的营养和肌肉减少状况有所改善，血浆的总酚含量增加⁷。然而，血浆中总酚类化合物的测定是通过分光光度法进行的，因此无法鉴定被吸收的实际酚类化合物;此外，这种方法对酚类化合物并不完全特异，因此可能会发生一些高估⁸。

鉴定和定量食用富含这些抗氧化剂的食物后被吸收的酚类化合物是一项艰巨的任务，但对于证明这些植物化学物质的生物活性是必要的。大多数酚类化合物的生物利用度较低;其中不到5%可以在血浆中没有结构转变的情况下被发现。酚类化合物经历几种生物转化，如甲基化、磺化或葡萄糖醛酸化，由肠细胞和肝细胞9^进行。酚类化合物也被微生物群生物转化成细菌分解代谢物，这些分解代谢物在被吸收到血浆中后可能在体内发挥其有益作用¹⁰。例如，苯乙酸是类黄酮和低聚原花青素的细菌转化的产物，其可以抑制蔓越莓食用后尿道中高达40%的细菌（大肠杆菌）粘附¹¹。

天然存在的酚类化合物的结构多样性，加上其代谢物的多样性和低生物利用度，使它们在血浆中的鉴定更具挑战性。使用核磁共振（NMR）和串联质谱（MS / MS）等光谱分析平台进行代谢组学分析可能是实现这一目标的最佳方法;不幸的是，该设备不容易获得，分析协议的开发仍然有限¹²。一些研究报告了MS / MS与分离系统（如液相色谱）相结合，作为降低代谢组学研究中质谱复杂性的策略。与传统的高效液体实验方案相比，最近引入的超高效液相色谱（UPLC）分离方法缩短了分析时间，提高了分辨率和灵敏度，因此UPLC-MS/MS系统已迅速被分析代谢组学界广泛接受¹³。通过这种方式，一些研究调查了酚类代谢物，并检测了蔓越莓摄入后个体血浆中来自咖啡酸、槲皮素和阿魏酸的葡萄糖醛酸衍生物，以及来自注射剂和香草酸的磺化衍生物¹⁴。以前的方案旨在发现生物流体（如血浆）中的酚类化合物和酚类代谢物。这些实验方案基于高效液相色谱（HPLC）耦合到紫外可见分光检测器¹⁵的鉴定和定量。然而，此类方案要求使用真实标准来评估绝对鉴定和准确定量。广泛的研究已经确定了UPLC-MS和UPLC-MS / MS生物流体（磺化，葡萄糖醛酸化和甲基化形式）中最常见的代谢物;然而，由于缺乏包含其完整信息的数据库，很大一部分细菌代谢物尚未被报道¹⁶。代谢物鉴定因代谢物标准品的成本和商业可用性而变得复杂。因此，最佳策略可能是无靶向或半靶向MS / MS代谢物分析，其依赖于使用分子特征信息（m / z，同位素精确质量，同位素分布和片段化模式）来确定化学特性，并将其与免费提供的在线数据库进行比较，这些数据库包含消耗多酚富集后在生物流体中鉴定的多酚代谢物¹².UPLC-MS/MS研究中使用的用于鉴定酚类化合物及其代谢物的最重要数据库是人类代谢组数据库（HMDB），脂质细胞文库，METLIN文库和其他补充数据库，如PubChem，ChemSpider和Phenol ^Explorer17。

在本研究中，开发了一种半靶向UPLC-MS / MS方法来分析参与含RSF松饼和饮料消费研究的老年人组的血浆样本⁷。收集来自不同免费在线血浆代谢物数据库的数据并将其整合到一个专门的数据库中。该数据库可通过设备软件自动访问，以识别30天营养干预前后的五种血浆样品中的多酚代谢物。这样做是为了鉴定从专门配制的用于预防肌肉减少症的功能性食品中吸收的主要酚类化合物或其代谢物。

该协议中使用的血浆样品是在遵循所有伦理准则的先前研究中收集的，并得到了华雷斯自治大学的机构伦理和生物伦理委员会（CIEB-2018-1-37）的批准。通过UPLC-MS / MS提取和鉴定血浆中酚类化合物和代谢物的完整方案如图 1所示。

图1:通过半靶向UPLC-MS / MS方法提取和鉴定血浆中酚类化合物和代谢物的示意图。 请点击此处查看此图的放大版本。

1. 样品制备

1. 将血浆样品储存在-80°C直至分析。
2. 在室温下解冻血浆样品15分钟。
   注意:样品可以放置在37°C的水浴中以加速该过程（5分钟）。
3. 将200μL血浆样品置于2mL微管中，并与1，000μL纯乙醇混合。涡旋等离子体样品30秒。
   注意:处理血浆样品时，请始终使用手套。
4. 将样品以6，580× g 离心5分钟。离心后，用微量移液管或巴斯德移液器收集上清液，并将其置于新的微管中。将上清液储存在4°C。
5. 将上一步中的沉淀与1，000μL100%乙醇混合，涡旋30秒，然后以6，580× g 离心5分钟。
   注意:沉淀是强力包装的，需要重悬良好，以确保样品与纯乙醇之间的接触。建议使用微量移液器用乙醇冲洗沉淀。
6. 离心后，收集上清液并与先前从步骤1.4获得的上清液混合。在2 mL微管中。
7. 使用纯氮（99.997%）在135 psi下从样品中除去乙醇。保持针头远离微管顶部1厘米，以防止样品丢失并冲洗直至样品干燥。无需加热即可蒸发乙醇。
   注意:氮气流量必须很低，以防止样品损失。一旦乙醇干燥，保持氮气流量至少5分钟，以确保样品干燥。此时可以暂停协议;样品必须储存在-20°C。 避免将样品储存超过12小时。
8. 将干样品重悬于100μL乙腈混合物中:水的比例为50:50（v:v）。
9. 通过0.45μm尼龙注射器膜将样品直接过滤到HPLC小瓶微插入物中。
   注意:样品瓶中的样品可以在分析前储存在-20°C。将样品储存不超过8小时。建议在过滤后立即将样品注入UPLC系统。

2. UPLC-MS/MS 分析

1. 将3μL样品注入装有_C18 反相柱（50 mm x 2.1 mm; 1.8μm）的UPLC中。将自动进样器温度设置为20°C，柱式恒温器设置为25°C。 将每个样品一式三份注入。
2. 在水中使用0.1%（v:v）甲酸作为溶剂A，100%乙腈作为溶剂B.将流速设置为0.4 mL / min，梯度程序如下:0-1分钟10%B，1-4分钟30%B，4-6分钟38%B，6-8分钟60%B，8-8.5分钟60%B，8.5-9分钟10%B（表1）。
3. 将质谱仪设置为负模式电离。在340°C和13 L / min的流速下使用氮气作为干燥气体。将雾化器压力设置为 60 psi。将毛细管电压设置为 4，000 V，将碎片器电压设置为 175 V，将撇油器电压设置为 65 V。在 20 V 时使用碰撞能量（表 2）。
4. 扫描质量在100-1100质量电荷比（m/z）之间，对于MS/MS，扫描质量在50-1000 m/z 之间（表2）。将数据采集设置为自动 MS/MS 模式。使用以下参考质量:119.036 和 966.0007。

表1:用于通过UPLC分离酚类化合物的流动相梯度。

表2:MS/MS分析的电离参数。

3. 数据库建设

1. 在科学文献中搜索酚类化合物、酚类代谢物或其他感兴趣的化合物。
2. 打开UPLC系统中包含的数据库管理软件。选择 文件|新的个人数据库复合库 （PCDL） |创建新的 PCDL。选择PCDL的类型: LC / MS代谢组学。设置 PCDL 的名称。然后选择" 创建"。
3. 在工具栏中，选择" PCDL "，然后选择 "允许编辑 "选项。然后单击" 查找化合物 "按钮。
   注意:由于它是新的 PCDL，因此表结果将为空。一旦新的化合物被添加到PCDL中，这种情况就会改变。
   1. 通过从仪器的通用库中复制化合物，将化合物添加到专门的个人数据库化合物库中。打开数据库管理软件中包含的仪器现有数据库。单击" 查找化合物"按钮。在 "单次搜索 "选项中，输入化合物搜索条件以查找感兴趣的化合物。
      注意:化合物可以通过名称，分子式，确切质量和保留时间找到。
   2. 在化合物结果表中，选择感兴趣的化合物。若要选择多个化合物，请单击第一个化合物，按住 Ctrl 键，然后单击每个感兴趣的化合物。然后，右键单击所有突出显示的化合物，然后选择" 追加到 PCDL"。
   3. 在新窗口中，搜索并选择专用的个人数据库文件。标记" 包括化合物的光谱（如果存在 ）"和 "包括化合物的离子淌度信息（如果存在）"框。单击 追加 按钮。在新对话框中，选择" 是 "以检查添加的新化合物。选择" 否 "以继续搜索更多感兴趣的化合物。
4. 如果仪器的通用库中没有感兴趣的化合物，请手动添加新化合物。
   1. 打开专用个人数据库。打开后，请按照步骤 3.3 操作。选择 "编辑化合物 "选项。单击 添加新 按钮。
   2. 在窗口的上半部分，填写新化合物的信息。填写公式，名称，IUPAC名称，CAS编号，化学蜘蛛ID和其他标识符。
   3. 使用免费在线库（Chemspider，PubChem和Phenol Explorer）中提供的信息来填写新感兴趣化合物的信息。完成后，单击" 另存为新 "按钮，将新的化合物信息保存在专门的个人数据库中。
      注意:添加来自自由库的信息时，请确保包含不存在氯化物或碘离子的化合物信息。这可能会改变目标化合物的确切质量和分子式。
5. 对所有感兴趣的化合物重复该过程，以完成专门的个人数据库。

4. 数据分析

1. 使用仪器的定性管理器软件来鉴定样品中存在的酚类化合物和酚类代谢物。
2. 打开示例文件。在"色谱图"面板中，选择"定义色谱 图 "并提取总离子色谱图 （TIC）、提取的 MS 离子色谱图 （EIC） 和 MS/MS 的 EIC。选择"集成色谱图"选项。
3. 在 "查找化合物"面板中 ，选择" 按公式查找-选项"。在新窗口中，选择" 公式源 "，然后选择" 数据库/库" 选项。找到以前创建的个人数据库，然后单击" 打开"。
4. 选择 "公式匹配 "选项，并将质量匹配公差设置为百万分之 5 （ppm）。
   注意:不同的质量匹配公差可以设置为10 ppm;这种差异取决于所使用的质谱仪。
5. 选择" 负离子 "选项，然后仅选择" -H "对话框。在 "结果 "选项中，标记 "提取 EIC"、"提取清理的频谱"、"提取原始频谱"以及" 包括结构 "对话框。
6. 选择" 结果筛选器" 选项。 如果分数为， 则标记警告，并将分数匹配设置为 80.00%。 如果分数为， 则标记为不匹配，并将分数设置为 75.00%。
   注意:如果需要，匹配/不匹配的分数可以更改为较低的值。这将降低识别的准确性。
7. 单击" 按配方查找化合物" 以识别样品中感兴趣的化合物。

图2描述了通过半靶向UPLC-MS / MS分析在阴性模式下鉴定酚类代谢物的分步过程。首先，通过仪器的定性软件获得来自血浆酚醛提取物的总离子色谱图（TIC）（在总血浆样品的蛋白质沉淀后获得）。然后，使用提取的离子色谱图，并将每个信号（或分子特征）的确切质量和碎片模式（MS / MS分析）与仪器软件中创建的特定个人数据库的质量和片段模式进行比较。质量匹配小于5 ppm的信号从数据库中分配一个分子式。最后，将每个信号的同位素分布与指定分子式的同位素分布进行比较，以实现最终的初步鉴定。a）仅在一个复制品中鉴定出或b）呈现面积小于10，000的化合物被视为虚假鉴定。从该分析中，在血浆样品中共鉴定出25种酚类化合物和代谢物（表3）。在该列表中，发现了酚类化合物及其代谢物，例如3-希德氧基苯戊酸和3-（3，4-二羟基苯基）-2-羟基丙酸异丙酯。由于负电离模式最适合除花青素以外的所有类别的酚类化合物，因此用本方法无法检测到这些化合物。如果花青素是食物基质的重要组成部分，也应使用阳性模式。

表3:通过半靶向UPLC-MS / MS方法试探性鉴定血浆样品中的酚类化合物和代谢物。

为了评估设计用于鉴定从含RSF的松饼和饮料中吸收的主要酚类化合物或其代谢物的方法的有效性，分析了在30天干预之前和之后获得的研究参与者的五个aleatory样品。通过将治疗后的曲线下面积（AUC）除以治疗前的AUC来计算每种化合物的相对丰度。从该分析中可以观察到，一些化合物仅出现在处理前获得的样品中，其他化合物保持不变，而其中一些化合物在食用功能性食品后增加。 表4 显示了12种酚类化合物的列表，这些化合物在食用含RSF的食物30天后血浆增加。苯乙酸是处理后唯一一种浓度较高的代谢物。甘氨酸、糖基化异黄酮和3-羟基苯基戊酸（酚类代谢物）在五个样品中的三个样品中增加，但在另外两个样品中减少。Gomisin M2，一种木酚素，仅在营养干预后才在五个样本中的三个中检测到。其他酚类化合物（如橙皮苷、二酚根石苋醇和香兰素）和代谢物（如2-羟基希普酸）仅在一个样品中发现，并且仅在处理后发现。

表4:老年人食用含无RSF食品30天后血浆中增加的酚类化合物列表。 数据是处理后每种化合物的丰度（AUC）与处理前丰度（AUC）的比率。T表示该化合物仅在处理后在样品中鉴定出来。Nd:未检测到。

图2:通过半靶向UPLC-MS / MS鉴定酚类化合物代谢物的方案。

所有作者均声明无利益冲突。