本实验方案的目的是采用半靶向色谱-质谱联用方法检测血浆中的酚类代谢物。
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摘要
摘要
一组23名老年人接受了专为预防肌肉减少症（与年龄相关的肌肉量流失）而配制的功能性膳食（一种饮料和一个松饼）。在干预开始时及连续食用功能性膳食30天后采集血浆样本。采用超高效液相色谱串联质谱法（UPLC-MS/MS）进行半靶向分析，以鉴定酚类化合物及其代谢物。使用乙醇沉淀血浆蛋白，将样本浓缩后重悬于流动相（1:1乙腈:水）中，随后注入UPLC-MS/MS仪器。色谱分离采用C18反相色谱柱，根据化合物的实测质荷比、同位素分布和碎片图谱进行鉴定。目标化合物与数据库及内部半靶向化合物库中的数据进行比对。初步结果显示，干预后检测到的主要代谢物为苯乙酸、染料木苷、3-羟基苯基戊酸和gomisin M2。
引言
肌少症是一种与老年人群肌肉加速流失相关的进行性骨骼疾病。该病症会增加跌倒风险，并导致日常生活活动能力受限。在65岁以上人群中，肌少症的患病率约为5%-10%，而在80岁及以上人群中，患病率约为50%1。目前尚无批准用于治疗肌少症的特定药物，因此通过体力活动和均衡饮食进行预防尤为重要1,2。采用富含乳清蛋白和必需氨基酸的特殊配方食品进行营养干预，在预防肌少症方面已显示出积极效果2。在其他研究中，作者在饮食中添加了维生素和抗氧化剂（如维生素E和异黄酮），进一步增强了腰部和臀部肌肉增长的益处3。
Brosimum alicastrum Sw.（拉蒙）是一种生长于墨西哥热带地区的一种树木；由于其具有较高的营养价值，玛雅文化人群长期将其作为食物来源4。它富含蛋白质、膳食纤维、矿物质以及酚类抗氧化物质，例如绿原酸5。由于其可被研磨成粉并用于烘焙食品或饮料中，近年来已有研究评估将拉蒙种子粉（RSF）添加至不同食品中以提升其营养价值。研究人员开发出一种添加RSF的卡布奇诺风味饮料，该饮料富含膳食纤维，每份含蛋白质超过6 g，且消费者接受度较高，因此被认为是一种满足特殊膳食需求的潜在替代品6。在后续研究中，RSF还被用于制备一种高蛋白、富含膳食纤维、微量营养素和酚类抗氧化物的松饼及新型饮料。该松饼和饮料被用于一项针对老年人群的膳食干预研究，受试者每日两次摄入这两种产品，持续30天。干预结束后，参与者的营养状况和肌肉减少症状态均得到改善，且血浆中总酚含量显著升高7。然而，血浆中总酚类化合物的测定采用的是分光光度法，因此无法鉴定实际被吸收的酚类化合物种类；此外，该方法对酚类化合物并非完全特异，可能导致一定程度的高估8。
鉴定和定量在摄入富含这些抗氧化剂的食物后被吸收的酚类化合物是一项困难但必要的任务，以证明这些植物化学物质的生物活性。大多数酚类化合物的生物利用度较低；在血浆中未经结构转化而存在的比例不到5%。酚类化合物会经历多种生物转化过程，例如甲基化、硫酸化或葡萄糖醛酸化，这些过程由肠上皮细胞和肝细胞完成9。此外，肠道微生物群也会将酚类化合物转化为细菌代谢产物，这些代谢物在被吸收入血浆后可能在体内发挥有益作用10。例如，苯乙酸是黄酮类化合物和低聚原花青素经细菌转化产生的代谢物，在摄入蔓越莓后可抑制高达40%的大肠杆菌（Escherichia coli）在尿路中的黏附11。
天然存在的酚类化合物结构多样性，加上其代谢物的多样性以及较低的生物利用度，使得在血浆中鉴定这些化合物更具挑战性。代谢组学分析利用核磁共振（NMR）和串联质谱（MS/MS）等光谱分析平台，可能是实现这一目标的最佳方法；然而，相关设备不易获取，且分析方法的开发仍受到限制12。已有若干研究报道，将串联质谱（MS/MS）与分离系统（如液相色谱）联用，作为降低代谢组学研究中质谱复杂性的策略。近年来，超高效液相色谱（UPLC）分离技术的引入，相较于传统的高效液相色谱方法，显著缩短了分析时间，并提高了分辨率和灵敏度，因此UPLC-MS/MS系统已迅速被分析代谢组学领域广泛接受13。通过该方法，一些研究已检测到个体摄入蔓越莓后血浆中的酚类代谢物，包括咖啡酸、槲皮素和阿魏酸的葡萄糖醛酸化衍生物，以及丁香酸和香草酸的磺酸化衍生物14。以往的方法旨在生物流体（如血浆）中检测酚类化合物及其代谢物，主要依赖高效液相色谱（HPLC）与紫外-可见光检测器联用进行鉴定和定量15。然而，此类方法需要使用真实标准品以实现绝对鉴定和准确定量。大量研究已通过UPLC-MS和UPLC-MS/MS鉴定了生物流体中最常见的代谢物形式（如磺酸化、葡萄糖醛酸化和甲基化形式）；但由于缺乏包含其完整信息的数据库，许多细菌来源的代谢物尚未被报道16。代谢物标准品的成本高昂且商业可及性有限，进一步增加了代谢物鉴定的难度。因此，最有效的策略可能是采用非靶向或半靶向的MS/MS代谢物分析方法，该方法依赖于分子特征信息（质荷比m/z、单一同位素精确质量、同位素分布及碎片化模式）来确定化学结构，并将其与公开可用的在线数据库中的多酚代谢物信息进行比对，这些数据库收录了摄入富含多酚食物后在生物流体中鉴定出的多酚代谢物12。在UPLC-MS/MS研究中用于鉴定酚类化合物及其代谢物的最重要数据库包括人类代谢组数据库（HMDB）、LipidBlast数据库、METLIN数据库，以及其他辅助数据库，如PubChem、ChemSpider和Phenol Explorer17。
本研究建立了一种半靶向的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）方法，用于分析摄入含RSF松饼和饮料的老年受试者群体的血浆样本7。收集并整合了多个血浆代谢物的免费在线数据库中的数据，构建了一个专用数据库。该数据库可由仪器软件自动访问，用于鉴定5份血浆样本在为期30天的营养干预前后存在的多酚类代谢物。该分析旨在鉴定从特制的功能性食品中吸收的主要酚类化合物或其代谢产物，这些食品旨在用于预防肌肉减少症。
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方案
本方案中使用的血浆样本来自先前的一项研究，采集过程遵循所有伦理准则，并已获得华雷斯自治大学机构伦理与生物伦理委员会（CIEB-2018-1-37）的批准。通过超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）提取并鉴定血浆中酚类化合物和代谢物的完整方案见图1。
图1：采用半靶向超高效液相色谱-串联质谱法对血浆中酚类化合物及代谢物进行提取与鉴定的示意图。请点击此处查看该图的放大版本。
1. 样品制备
- 将血浆样本储存于 -80 °C，直至进行分析。
- 在室温下解冻血浆样本 15 分钟。
注意：可将样本置于 37 °C 水浴中以加速解冻过程（5 分钟）。 - 取 200 µL 血浆样本加入 2 mL 微量离心管中，加入 1,000 µL 纯乙醇，涡旋混匀 30 秒。
注意：处理血浆样本时务必佩戴手套。 - 以 6,580 x g 离心 5 分钟。离心后，使用移液器或巴斯德吸管收集上清液，并转移至新的微量离心管中。将上清液储存在 4 °C。
- 将上一步所得沉淀与 1,000 µL 100% 乙醇混合，涡旋 30 秒，然后以 6,580 x g 离心 5 分钟。
注意：沉淀较为紧密，需充分重悬以确保样本与纯乙醇充分接触。建议使用移液器反复吹打沉淀以促进重悬。 - 离心后，收集上清液，并与步骤 1.4 中先前获得的上清液混合于一个 2 mL 微量离心管中。
- 使用纯氮气（99.997%）在 135 psi 条件下去除样本中的乙醇。将针头保持在微量离心管管口上方 1 cm 处，以防止样本损失，并持续吹扫至样本完全干燥。无需加热即可蒸发乙醇。
注意：氮气流速必须较低，以防止样本损失。乙醇完全干燥后，应继续通入氮气至少 5 分钟以确保样本彻底干燥。此步骤可作为暂停点；样本必须储存于 -20 °C，且储存时间不得超过 12 小时。 - 将干燥的样本用 100 µL 乙腈:水（50:50, v:v）混合液重悬。
- 通过 0.45 µm 尼龙注射器滤膜将样本直接过滤至高效液相色谱（HPLC）小瓶内插管中。
注意：过滤后的样本在分析前可储存于 -20 °C，但储存时间不得超过 8 小时。建议在过滤后立即进样至超高效液相色谱（UPLC）系统中。
2. 超高效液相色谱-串联质谱分析
- 取 3 µL 样品注入配备 C18 反相色谱柱（50 mm x 2.1 mm；1.8 µm）的超高效液相色谱仪中。自动进样器温度设为 20 °C，柱温箱温度设为 25 °C。每个样品进样三次。
- 以含 0.1%（v:v）甲酸的水溶液作为流动相 A，100% 乙腈作为流动相 B。流速设为 0.4 mL/min，梯度程序如下：0–1 min，10% B；1–4 min，30% B；4–6 min，38% B；6–8 min，60% B；8–8.5 min，60% B；8.5–9 min，10% B（表 1）。
- 将质谱仪设为负离子模式电离。干燥气使用氮气，温度为 340 °C，流速为 13 L/min。雾化器压力设为 60 psi。毛细管电压设为 4,000 V，碎裂电压设为 175 V，锥形电压设为 65 V。碰撞能量设为 20 V（表 2）。
- 全扫描范围设为质荷比（m/z）100–1100，MS/MS 扫描范围设为 m/z 50–1000（表 2）。数据采集模式设为自动 MS/MS 模式。使用以下参考质量：119.036 和 966.0007。
| 时间（分钟） | 流动相 A（HPLC 级水含 0.1% 甲酸） | 流动相 B（100% 乙腈） |
| 0 至 1 | 90 | 10 |
| 1 至 4 | 70 | 30 |
| 4 至 6 | 62 | 38 |
| 6 至 8 | 40 | 60 |
| 8 至 8.5 | 40 | 60 |
| 8.5 至 9 | 90 | 10 |
表1：采用UPLC分离酚类化合物所用的流动相梯度。
| 电离模式 | 负离子模式 |
| 干燥气 | 氮气，340 °C，流速 13 L/min |
| 雾化器压力 | 60 psi |
| 毛细管电压 | 175 V |
| 质谱扫描质量范围 | 100-1100 m/z |
| 串联质谱扫描质量范围 | 50-1000 m/z |
表2：MS/MS分析的电离参数。
3. 数据库构建
- 在科学文献中检索酚类化合物、酚类代谢物或其他感兴趣的化合物。
- 打开UPLC系统中包含的数据库管理软件。选择 文件 | 新建个人数据库化合物库 (PCDL) | 创建新的PCDL。选择PCDL类型：LC/MS代谢组学。为PCDL设置名称，然后选择 创建。
- 在工具栏中，选择 PCDL ，然后选择 允许编辑 选项。接着点击 查找化合物 按钮。
注意：由于这是一个新PCDL，表格结果将为空。当新化合物被添加到PCDL中后，此情况将发生变化。- 通过从仪器的通用库中复制条目，将化合物添加至专用个人数据库化合物库中。打开数据库管理软件中包含的仪器现有数据库。点击 查找化合物 按钮。在 单次搜索 选项中，输入目标化合物的搜索条件以查找所需化合物。
注意：可通过名称、分子式、精确质量及保留时间查找化合物。 - 在化合物结果表格中，选择感兴趣的化合物。若需选择多个化合物，请先点击第一个化合物，按住 CTRL 键，再依次点击其他目标化合物。然后右键单击所有高亮显示的化合物，并选择 追加至PCDL。
- 在新窗口中，搜索并选择专用个人数据库文件。勾选 如存在则包含化合物的谱图信息 和 如存在则包含化合物的离子迁移率信息 选项。点击 追加 按钮。在弹出的对话框中，选择 是 以确认已添加的新化合物，或选择 否 以继续搜索其他感兴趣的化合物。
- 通过从仪器的通用库中复制条目，将化合物添加至专用个人数据库化合物库中。打开数据库管理软件中包含的仪器现有数据库。点击 查找化合物 按钮。在 单次搜索 选项中，输入目标化合物的搜索条件以查找所需化合物。
- 如果目标化合物在仪器的通用库中不可用，则需手动添加新化合物。
- 打开专用个人数据库。打开后，执行步骤3.3。选择 编辑化合物 选项，点击 添加新化合物 按钮。
- 在窗口的上部区域，填写新化合物的信息，包括分子式、名称、IUPAC名称、CAS编号、Chemspider ID及其他标识符。
- 利用免费在线数据库（如Chemspider、PubChem和Phenol Explorer）中的信息填写新化合物的详细资料。完成后，点击 保存为新化合物 按钮，将新化合物信息保存至专用个人数据库中。
注意：从免费数据库添加信息时，应确保所包含的化合物信息不含氯离子或碘离子，否则可能改变目标化合物的精确质量和分子式。
- 对所有感兴趣的化合物重复上述过程，以完成专用个人数据库的构建。
4. 数据分析
- 使用仪器的定性管理软件鉴定样品中存在的酚类化合物及酚类代谢物。
- 打开样品文件。在“色谱图”面板中，选择定义色谱图，提取总离子流色谱图（TIC）、质谱提取离子色谱图（EIC）以及二级质谱提取离子色谱图（EIC）。选择积分色谱图选项。
- 在查找化合物面板中，选择按分子式查找-选项。在新窗口中，选择分子式来源，然后选择数据库/库选项。找到先前创建的个人数据库，点击打开。
- 选择分子式匹配选项，并设置质量匹配容差为5 ppm（百万分之一）。
注意：可根据所使用的质谱仪将质量匹配容差设为10 ppm；不同仪器可接受的容差可能不同。 - 选择负离子选项，并仅勾选-H对话框。在结果选项中，勾选提取EIC、提取去噪谱图、提取原始谱图以及包含结构对话框。
- 选择结果筛选选项。勾选当匹配得分低于，并将匹配得分设为80.00%。勾选若匹配得分低于则不匹配，并将得分设为75.00%。
注意：如有需要，可将匹配/不匹配得分设为更低值，但会降低鉴定的准确性。 - 点击按分子式查找化合物，以鉴定样品中目标化合物。
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结果
通过超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）在负离子模式下对血浆样本进行半靶向分析，以鉴定酚类代谢物的逐步流程如图2所示。首先，使用仪器的定性分析软件获得血浆酚类提取物（通过全血浆样本蛋白沉淀后获得）的总离子流色谱图（TIC）。随后，提取各色谱峰的离子流图，并将每个信号（或分子特征）的精确质量数及其碎裂模式（MS/MS分析）与仪器软件中构建的特定个人数据库中的数据进行比对。当信号的质量数匹配误差小于5 ppm时，从数据库中为其分配相应的分子式。最后，将每个信号的同位素分布模式与所分配分子式的理论同位素分布进行比较，以实现最终的初步鉴定。若化合物满足以下任一条件：a）仅在一个重复样本中被检出，或b）峰面积低于10,000，则视为假阳性鉴定结果。通过该分析，在血浆样本中共鉴定出25种酚类化合物及其代谢物（表3）。该列表中既包括酚类化合物本身，也包括其代谢产物，例如3-羟基苯戊酸和3-(3,4-二羟基苯基)-2-羟基丙酸异丙酯。由于负离子化模式适用于除花青素以外的所有酚类化合物，因此本方法无法检测花...
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讨论
在摄入某种食物或食品补充剂后，鉴定并定量其中被吸收的生物活性植物化学物质，对于阐明和理解这些化合物及其来源食物的健康益处至关重要。本研究建立了一种超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）方法，专门用于鉴定在为期30天的营养干预后，血浆中浓度升高的主要酚类化合物及其代谢物。我们假设，若某种化合物仅在干预后出现或其血浆浓度升高，则该化合物已被吸收和/或由干预所用食物中的前体经生物转化而来。
超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）是代谢组学研究中常用的技术之一，可用于在复杂样品中同时分析多种低分子量化合物，以评估某种处理或环境变化的影响13。该技术可通过靶向或非靶向（即全局性）方法实现。靶向分析聚焦于已知的少量目标代谢物，是定量分析具有可用标准品的化合物的最佳选择，具有最高的特异性和灵敏度；然而，这些方法必须针对所选代谢物进行充分优化，且无法检测样品中未预期的化合物12。在其他研究中，曾采用高效液相色谱（HPLC）耦合紫外-可见光检测器来鉴定血浆中的酚酸及其代谢物，但此类研...
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披露
所有作者均声明无利益冲突。
致谢
作者感谢墨西哥国家科学技术委员会（CONACYT）（项目编号：CB-2016-01-286449）以及华雷斯城自治大学（UACJ）-PIVA（项目编号：313-17-16 和 335-18-13）提供的经费支持。OAMB 感谢 CONACYT 提供的博士奖学金。谨此感谢 UACJ 多媒体制作办公室提供的技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙腈 | Tedia | Al1129-001 | 液相色谱-质谱联用 |
| 自动进样器 | Agilent Technologies | G4226A | 1290 Infinity 系列 |
| C18 反相色谱柱 | Agilent Technologies | 959757-902 | Zorbax Eclipse plus C18 2.1x50 mm，1.8 μm；快速分离 HD |
| 离心机 | Eppendorf | 5452000018 | Mini Spin；转子 F-45-12-11 |
| 带恒温控制的色谱柱温箱 | Agilent Technologies | G1316C | 1290 Infinity 系列 |
| 二极管阵列检测器（紫外-可见光） | Agilent Technologies | G4212B | 1260 Infinity 系列 |
| 电喷雾离子源 | Agilent Technologies | G3251B | 双喷雾电喷雾离子源 |
| 甲酸 | J.T. Baker | 0128-02 | Baker 试剂，符合 ACS 标准 |
| Mass Hunter 数据采集软件 | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter 个人化合物数据库与谱库管理软件 | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter 定性分析软件 | Agilent Technologies | G3338AA | |
| 微量离心管 | Brand | BR780546 | 2 mL 带盖微量离心管 |
| 纯乙醇 | Sigma-Aldrich | E7023-1L | 200 证明，分子生物学级 |
| Q-TOF 液相色谱/质谱仪 | Agilent Technologies | G6530B | 6530 高精度质量分析仪 |
| 四元泵 | Agilent Technologies | G4204A | 1290 Infinity 系列 |
| 注射器滤器 | Thermo Scientific | 44514-NN | 17 mm，0.45 μm，尼龙膜 |
| 恒温器 | Agilent Technologies | G1330B | 1290 Infinity 系列 |
| 样品瓶 | Agilent Technologies | 8010-0199 | 棕色，带聚四氟乙烯（PFTE）红色硅胶垫和蓝色盖的 2 mL 螺口瓶 |
| 样品瓶内插管 | Agilent Technologies | 5183-2089 | 200 μL 锥形内插管，适用于 2 mL 标准开口瓶 |
| 水 | Tedia | WL2212-001 | 液相色谱-质谱联用级 |
参考文献
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