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方法文章

稳健地将人iPSCs分化为纯脂肪细胞群体以研究脂肪细胞相关疾病

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DOI：

10.3791/63311

⸱

2022年2月9日

 ,  , 
1Diabetes Research Center, Qatar Biomedical Research Institute (QBRI), Hamad Bin Khalifa University (HBKU), Qatar Foundation (QF), 2College of Health and Life Sciences, Hamad Bin Khalifa University (HBKU), Qatar Foundation

本文内容

摘要

该方案可从诱导性多能干细胞（iPSCs）中获得纯化的脂肪细胞群体。首先使用视黄酸将iPSCs分化为间充质干细胞（MSCs），再利用这些MSCs生成脂肪细胞。随后，通过尼罗红染色结合分选方法，获得纯化的脂肪细胞。

摘要

诱导性多能干细胞（iPSC）技术的最新进展使得生成包括脂肪细胞在内的多种细胞类型成为可能。然而，目前的分化方法效率较低，且无法产生均一的脂肪细胞群体。在此，我们采用一种基于全反式维甲酸的方法，高效地生成间充质干细胞（MSCs），从而规避了这一问题。通过调控细胞增殖、存活和黏附相关的信号通路，我们的分化策略能够高效地生成胚状体（EBs），并进一步分化为纯度较高的多能性MSCs。该方法产生的大量MSCs为脂肪细胞的生成提供了理想的细胞来源。然而，脂肪细胞分化后仍存在样本异质性的挑战。因此，我们采用基于尼罗红染色的方法，利用流式细胞荧光分选（FACS）对含脂滴的成熟脂肪细胞进行纯化。该分选策略使我们能够建立一种可靠的方法，利用异质性降低、细胞功能增强的脂肪细胞群体来模拟与脂肪细胞相关的代谢性疾病。

引言

间充质干细胞（MSCs）可作为一种有效的过渡性资源，用于生成中胚层来源的细胞，如脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞，这些细胞可进一步用于构建相应遗传性疾病的模型。然而，以往的方法依赖于从成体组织中获取这些间充质干细胞1，这给从供体获取大量细胞带来了挑战，同时也限制了其在非理想条件下保持功能活性的能力 体外 培养条件1,2这些障碍使得建立一种生成间充质干细胞（MSCs）的实验方案的需求日益迫切 体外人类诱导性多能干细胞（iPSCs）可作为间充质干细胞（MSCs）的重要来源，具有MSC的特征3,4,5. 由iPSCs衍生的MSCs可作为多种疾病的治疗选择。此外，iPSCs衍生的MSCs具有生成脂肪细胞的能力，使其成为一种有价值的 体外 用于研究人类脂肪生成、肥胖症及脂肪细胞相关疾病的人体模型。

目前脂肪细胞的分化方案可分为两类：一类是使用化学物质或基于蛋白质的诱导剂组合进行脂肪细胞分化，最终获得30%-60%的分化效率6,7,8,9；另一类是通过基因操作强力诱导调控脂肪细胞发育的关键转录因子，可获得80%-90%的分化效率10,11。然而，基因操作无法真实再现脂肪细胞分化的自然过程，常常掩盖脂肪生成过程中出现的细微调控机制，因此在疾病建模方面效果有限12,13。为此，我们提出一种方法，利用尼罗红对含脂质的脂肪细胞进行荧光标记，从而将化学诱导获得的成熟脂肪细胞与未成熟细胞分离开来。

在此，我们介绍一种涉及将诱导多能干细胞（iPSCs）来源的类胚体（EBs）与全反式视黄酸进行短暂孵育的实验方案。转 视黄酸以产生大量快速增殖的间充质干细胞，这些细胞可进一步用于生成脂肪细胞14我们还介绍了一种通过使用亲脂性染料尼罗红对脂滴进行荧光标记，从而从异质性分化细胞群体中分选化学诱导生成的成熟脂肪细胞的方法。该方法能够获得功能增强的纯化成熟脂肪细胞群体，以更准确地模拟脂肪细胞相关代谢紊乱。

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方案

本研究已获得相应机构研究伦理委员会的批准，并遵循1964年《赫尔辛基宣言》及其后续修订版或类似的伦理标准进行。研究方案已获哈马德医疗中心（HMC）机构审查委员会（IRB）（编号16260/16）和QBRI（编号2016-003）批准。本研究方法亦适用于H1和H9等人胚胎干细胞（hESCs）。血液样本来自健康个体，并已获得其完全知情同意。诱导多能干细胞（iPSCs）由健康个体外周血单个核细胞（PBMCs）生成。

1. iPSC 的培养与维持

  1. 通过将包被基质以1:80的比例在无血清DMEM培养基中重悬，制备基底膜基质包被的培养板，并于4 °C保存。
  2. 通过向500 mL干细胞基础培养基中加入50 mL 10倍浓缩的干细胞补充培养基以及5 mL 100倍浓缩的青霉素-链霉素（P/S），配制iPSCs培养基；短期使用可储存于4 °C，长期使用则储存于-20 °C。
  3. 用包被基质对培养板进行包被——6孔板每孔1 mL，12孔板每孔500 µL，24孔板每孔250 µL——并在37 °C孵育1–2小时。
  4. 取一份iPSCs培养基，在使用前于室温预热。
  5. 在37 °C水浴中解冻一管iPSCs（ESCs或iPSCs），并转移至含有2–3 mL培养基的15 mL锥形管中。
  6. 在室温（RT，23 °C）下以120 ×g离心4分钟。
  7. 弃去上清液，加入2 mL新鲜培养基（添加10 µM ROCK抑制剂Y-27632），将细胞接种至经基质包被的6孔板中的一个孔内，并将培养板置于37 °C培养。
  8. 24小时后，弃去原培养基，更换为新鲜培养基。
  9. 每天更换培养基，直至细胞融合度达到80%–90%。
  10. 当细胞达到融合状态时，按以下步骤进行传代：
    1. 弃去培养基，用Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤细胞。
    2. 加入iPSCs解离试剂（参见材料表）——6孔板每孔500 µL，24孔板每孔250 µL——在37 °C孵育1分钟。
    3. 移除解离试剂，将细胞在无液体状态下于37 °C继续孵育1分钟。
    4. 用培养基收集细胞——6孔板每孔1 mL，24孔板每孔250 µL——转移至15 mL锥形管中，并以120 ×g离心4分钟。
    5. 将细胞重悬于含10 µM ROCK抑制剂的新鲜培养基中——6孔板每孔2 mL，24孔板每孔500 µL——并以40%融合度接种至新的基质包被培养板中。

2. 将iPSC分化为MSCs

  1. 通过向低糖 DMEM + 丙酮酸盐中添加 15% 胎牛血清 (FBS) 和 1% 青霉素-链霉素 (P/S) 来配制间充质干细胞（MSC）分化培养基，并在 4 °C 下保存。
  2. 当细胞达到 80% 汇合度时，使用诱导多能干细胞（iPSCs）进行拟胚体（EB）形成，具体步骤如下：
    1. 用 DPBS 洗涤细胞，并加入解离培养基/EDTA —— 每孔 6 孔板使用 500 µL，每孔 24 孔板使用 250 µL。
    2. 在 37 °C 下孵育 1 分钟，吸除解离试剂后，将细胞继续在 37 °C 下静置 1 分钟。开始 MSC 分化时，大约需要 10–12 × 106 个细胞。
    3. 使用培养基将细胞收集至 15 mL 圆锥形离心管中。收集过程中务必轻柔操作，避免细胞分散成单细胞，以利于拟胚体形成。以 120 × g 离心 4 分钟。
    4. 用含有 10 µM ROCK 抑制剂的 3 mL MSC 分化培养基重悬细胞。
    5. 混匀后，将 0.5 mL 分装至 24 孔超低吸附培养板的每孔中。
      注：使用超低吸附培养板有助于促进细胞聚集成拟胚体，而非贴附于培养表面。
    6. 将培养板置于 37 °C 培养箱中孵育。
  3. 24 小时后，采用高浓度视黄酸（RA）处理已形成的拟胚体，具体步骤如下：
    1. 向 3 mL MSC 分化培养基中加入 10 µM RA。将拟胚体收集至 15 mL 离心管中，静置沉降 15 分钟。
    2. 去除拟胚体上清液，加入补充了 10 µM RA 的 MSC 分化培养基。
    3. 轻柔重悬后，将 0.5 mL 分装至同一块 24 孔超低吸附培养板的每孔中。
    4. 将培养板置于 37 °C 培养箱中孵育。接下来的 48 小时内不要扰动拟胚体。
    5. 48 小时后，将拟胚体收集至 15 mL 离心管中，静置沉降 15 分钟。
    6. 去除拟胚体上清液，加入补充了 0.1 µM RA 的 MSC 分化培养基。
    7. 轻柔重悬后，将 0.5 mL 分装至同一块 24 孔超低吸附培养板的每孔中。
    8. 将培养板置于 37 °C 培养箱中孵育。接下来的 48 小时内不要扰动拟胚体。
  4. 通过以下步骤去除细胞中添加的视黄酸（RA）：
    1. 在最后一次 RA 处理 48 小时后，收集拟胚体并静置沉降 15 分钟。
    2. 去除上清液，加入不含细胞因子的低糖 DMEM 培养基。
    3. 轻柔重悬后，将 0.5 mL 分装至 24 孔超低吸附培养板的每孔中。将培养板置于 37 °C 培养箱中孵育。
  5. 接种由 iPSCs 衍生的拟胚体，具体步骤如下：
    1. 在上一步（步骤 2.4）48 小时后，将拟胚体收集至 15 mL 离心管中，静置沉降 15 分钟。
    2. 去除上清液，用 2 mL 新鲜的 MSC 分化培养基重悬细胞。
    3. 转移至经基底膜基质包被的 6 孔板中的两个孔。
    4. 每隔一天更换一次培养基，持续 5 天。
    5. 5 天后，去除旧培养基，更换为含有 2.5 ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的新鲜 MSC 分化培养基。
  6. 当接种的拟胚体达到 80%–90% 汇合度时进行传代，具体步骤如下：
    1. 用 DPBS 洗涤细胞，每孔 6 孔板加入 500 µL 胰蛋白酶-EDTA，在 37 °C 下孵育 3 分钟。
    2. 使用 MSC 分化培养基将细胞收集至 15 mL 圆锥形离心管中，以 750 × g 离心 4 分钟。
    3. 用含有 2.5 ng/mL bFGF 的 MSC 分化培养基重悬细胞，并以 1:3 的比例接种至经基底膜基质包被的培养板中。
    4. 当细胞再次达到 70%–80% 汇合度时重复传代。经过 2–3 次传代后，预计可获得 300–600 万个细胞。

3. 诱导多能干细胞来源的间充质干细胞的流式细胞术分析

注意：经过 2-3 次传代后，应检测细胞的间充质干细胞（MSC）分化效率。若细胞表达间充质干细胞分化标志物 CD44、CD73、CD90 和 CD105 的效率超过 90%，且不高水平表达造血细胞标志物 CD14、CD19、CD34 和 CD45，则认为分化成功。可通过以下步骤检测这些标志物的表达效率。

  1. 使用上述步骤（步骤 2.6）传代细胞，并在 V 型底 96 孔板的一个孔中获得 1 × 105 个细胞。
  2. 在 4 °C 条件下，以 375 x g 离心 4 分钟。
  3. 将 1 × 105 个细胞重悬于 100 µL 冷 DPBS 中，加入 1 µL 偶联抗体（Ab）（参见材料表），在 4 °C 避光孵育 30–40 分钟。
  4. 将另一份 1 × 105 个细胞重悬于 100 µL 冷 DPBS 中，加入相应偶联抗体的同型对照（浓度为 1:100），在 4 °C 避光孵育 30–40 分钟。
  5. 孵育结束后，在 4 °C 条件下以 375 x g 离心 4 分钟，将平板在水槽上方轻摇以弃去上清液。
  6. 将细胞重悬于 100 µL 冷 DPBS 中。
  7. 在 4 °C 条件下以 375 x g 离心 4 分钟，弃去上清液。
  8. 将细胞重悬于 200 µL 冷 DPBS 中，转移至避光、预冷的 1.5 mL 微量离心管中，置于冰上保存，直至进行荧光激活细胞分选（FACS）分析。
  9. 进行 FACS 分析时，利用侧向散射光（SSC-A）对前向散射光（FSC-A）进行细胞分布，以排除碎片。进一步利用前向散射光高度（FSC-H）对前向散射光面积（FSC-A）进行门控细胞分布，以区分活细胞群体中的单细胞与双联体。
    注意：每个标记物的门控均以同型对照的偏移为参照，每个染色样本至少分析 10,000 个门控事件。

4. 间充质干细胞向脂肪细胞的分化

  1. 在最低必需培养基（MEM）-alpha 中加入 10% 去除血清替代物（KOSR）、1% 谷氨酰胺、1% 青霉素/链霉素（P/S）和 4.5 ng/µL 葡萄糖，配制脂肪细胞分化基础培养基，并于 4 °C 保存。
  2. 使间充质干细胞（MSCs）生长至融合度超过 90%，继续培养 48 小时，使其进入生长期停滞阶段。
  3. 在基础培养基中添加 100 µg/mL 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）、1 µM 地塞米松、0.2 U/mL 胰岛素、100 µM 吲哚美辛和 10 µM 罗格列酮，配制完全脂肪细胞分化培养基。
  4. 移除 MSC 分化培养基，用 DPBS 洗涤细胞。
  5. 向 6 孔板每孔加入 2 mL 完全脂肪细胞分化培养基，12 孔板每孔加入 1 mL，于 37 °C 培养。每两天更换一次完全分化培养基，持续 14 天。

5. 脂肪细胞分化效率的评估

  1. 在分化第14天，通过检测脂肪细胞成熟标志物FABP4和脂联素的染色情况，评估分化效率。
  2. 移除培养基，并用DPBS洗涤细胞。
  3. 使用4%多聚甲醛（PFA）固定细胞（每孔24孔板加入200 µL），室温孵育15分钟。
  4. 弃去PFA，用含0.5% Tween的Tris缓冲盐水（TBST）洗涤，并在室温下置于摇床上振荡15分钟。重复该步骤两次。
  5. 用含0.5% Triton X-100的磷酸盐缓冲盐水（PBST）对固定后的细胞进行通透处理，室温下置于摇床上振荡15–20分钟。
  6. 弃去PBST，加入封闭液（含5%–6%牛血清白蛋白（BSA）的PBST），每孔6孔板加500 µL，每孔12孔板加250 µL，室温摇床孵育40–60分钟。
  7. 将抗FABP4和抗脂联素的一抗用含2%–3% BSA的溶液按1:500稀释（见材料表）。若一抗来自不同动物，则可混合后共同加入，并将培养板置于4 °C摇床过夜孵育。
  8. 移除一抗，用TBST洗涤细胞三次，每次15分钟，室温下置于摇床上振荡。
  9. 将Alexa Fluor二抗用PBST按1:500稀释。根据一抗的宿主物种选择相应的二抗组合，室温孵育60分钟，并用铝箔包裹培养板以避光。
  10. 弃去二抗，用TBST洗涤三次，每次置于摇床上振荡。
  11. 进行细胞核染色时，将Hoechst 33342用PBS稀释至1 µg/mL（每孔24孔板加入200 µL），室温孵育5分钟。
  12. 弃去Hoechst溶液，向每孔24孔板中加入500 µL PBS，避光保存，直至使用倒置荧光显微镜观察。

使用尼罗红对脂肪细胞进行分选

  1. 通过将1 mg/mL的尼罗红DMSO储备液配制为工作液，并于-20 °C保存。使用前将其解冻，并用DPBS重悬，配制成300 nM的工作液浓度。
  2. 在脂肪细胞分化第14天或之后，弃去细胞培养基，并用DPBS洗涤细胞。
  3. 加入尼罗红工作液（每6孔板孔中加入1 mL），于37 °C孵育15分钟。
  4. 移除尼罗红溶液，加入胰蛋白酶-EDTA溶液（每6孔板孔中加入500 µL），于37 °C孵育4分钟。
  5. 使用含5% FBS的DMEM收集细胞至15 mL锥形管中。以750 ×g离心4分钟。
  6. 弃去上清液，将细胞重悬于DPBS中（每1 × 106个细胞加入1 mL）。以750 ×g离心4分钟。
  7. 弃去上清液，将细胞重悬于DPBS中（每1 × 106个细胞加入1 mL）。使用FACS分选仪通过FL1通道分离尼罗红阳性细胞。
  8. 将分选后的细胞重新培养于脂肪细胞分化培养基中，或收集用于RNA和蛋白质提取。
  9. 从分选后的细胞中提取RNA，并对脂肪细胞分化标志物（包括FABP4, PPARG和C/EBPA）进行相对定量分析。与未分选细胞相比，尼罗红阳性细胞中至少有两个基因的表达水平显著上调两倍以上。

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结果

间充质分化过程中细胞的示意图与形态学特征：诱导性多能干细胞（iPSCs）向间充质干细胞（MSCs）的分化过程包含多个发育阶段，涵盖拟胚体（EB）形成、MSC分化以及MSC扩增（图1）。在这些发育阶段中，由于受到不同诱导化学物质的作用，细胞呈现出多种形态。在启动分化时，细胞以悬浮方式接种，此时细胞应呈圆形，边界清晰，直径为小至中等大小（图2）。在分化的初始阶段选择悬浮培养，可使其更接近自然胚胎发育过程，因此该阶段对成功分化至关重要。在完成拟胚体形成和视黄酸（RA）处理阶段后，将拟胚体接种于基底膜基质包被的培养板上。通过观察拟胚体接种后快速增殖并产生更多MSC的能力，可评估其存活状态（图2）。MSC所表现出的这种快速增殖特性在传代至新的基质包被培养板后仍得以保持，同时维持其特有的细长形态（图2）。

间充质干细胞表面标志物的定量评估：通过定量检测间充质...

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讨论

该方案之所以极为重要，是因为它能够以高产量和高效率获得间充质干细胞（MSCs）。这种大规模生产MSCs的方法得以实现，关键在于将诱导多能干细胞（iPSCs）来源的拟胚体（EBs）短暂地与10 µM的视黄酸（RA）共孵育14,15。使用10 µM RA进行短暂处理，可使MSC的产量提高11.2至1542倍14,15，且该方案适用于iPSCs和人多能干细胞（hPSCs）。在此剂量和处理时长下，RA通过直接或间接调控多个参与细胞增殖、凋亡以及细胞间和细胞外基质（ECM）-细胞黏附相关基因的表达，从而增强EB形成细胞的增殖能力和存活能力，而这些过程对iPSCs的存活与增殖至关重要14,16。这些基因包括但不限于转录因子（如EGFR4、SOX4）、生长因子及生长因子受体（如IGF2、FGFR4）以及...

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披露

作者声明不存在任何竞争利益。

致谢

本工作由卡塔尔国家研究基金（QNRF）资助（项目编号：NPRP10-1221-160041）。Maryam Aghadi 获得了卡塔尔国家研究基金（QNRF）GSRA 奖学金的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
脂联素Abcamab22554脂肪细胞成熟标志物
抗 CD105BD Pharmingen560839间充质干细胞分化标志物
抗 CD14BD Pharmingen561712间充质干细胞分化标志物
抗 CD19BD Pharmingen555415间充质干细胞分化标志物
抗 CD34BD Pharmingen555824间充质干细胞分化标志物
抗 CD44abcamab93758间充质干细胞分化标志物
抗 CD45BD Pharmingen
560975		间充质干细胞分化标志物
抗 CD73BD Pharmingen550256间充质干细胞分化标志物
抗 CD90BD Pharmingen555596间充质干细胞分化标志物
bFGFR&D233-FP间充质干细胞培养基补充剂
C/EBPAAbcamab40761脂肪细胞成熟标志物
地塞米松Torics1126脂肪细胞分化培养基补充剂
FABP4Abcamab93945脂肪细胞成熟标志物
胎牛血清ThermoFisher10082147间充质干细胞培养基补充剂
GlutamaxThermoFisher35050-061间充质干细胞培养基补充剂
IBMXSigma AldrichI5879脂肪细胞分化培养基补充剂
吲哚美辛Sigma AldrichI7378脂肪细胞分化培养基补充剂
胰岛素Sigma Aldrich91077C脂肪细胞分化培养基补充剂
Knockout DMEMThermoFisher12660012Matrigel 制备用基础培养基
低糖 DMEMThermoFisher11885084间充质干细胞培养基
MatrigelCorning354230包被基质
MEM-alphaThermoFisher12561056脂肪细胞分化培养基
尼罗红Sigma Aldrich19123脂肪细胞分选标志物
青霉素ThermoFisher15140122间充质干细胞/脂肪细胞培养基补充剂
磷酸盐缓冲液ThermoFisher14190144洗涤缓冲液
Pierce™ 20X TBS 缓冲液Thermo Fisher28358洗涤缓冲液
PPARGCell Signaling Technology2443脂肪细胞成熟标志物
ReLeSRStem Cell Technologies5872解离试剂
视黄酸Sigma AldrichR2625间充质干细胞分化培养基补充剂
ROCK 抑制剂Tocris1254/10人多能干细胞培养基补充剂
罗格列酮Sigma AldrichR2408脂肪细胞分化培养基补充剂
StemFlexThermoFisherA334901人多能干细胞培养基
TritonThermo Fisher28314通透化试剂
胰蛋白酶ThermoFisher25200072解离试剂
Tween 20Sigma AldrichP7942洗涤缓冲液

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