稳健地将人iPSCs分化为纯脂肪细胞群体以研究脂肪细胞相关疾病

摘要

该方案可从诱导性多能干细胞（iPSCs）中获得纯化的脂肪细胞群体。首先使用视黄酸将iPSCs分化为间充质干细胞（MSCs），再利用这些MSCs生成脂肪细胞。随后，通过尼罗红染色结合分选方法，获得纯化的脂肪细胞。

摘要

诱导性多能干细胞（iPSC）技术的最新进展使得生成包括脂肪细胞在内的多种细胞类型成为可能。然而，目前的分化方法效率较低，且无法产生均一的脂肪细胞群体。在此，我们采用一种基于全反式维甲酸的方法，高效地生成间充质干细胞（MSCs），从而规避了这一问题。通过调控细胞增殖、存活和黏附相关的信号通路，我们的分化策略能够高效地生成胚状体（EBs），并进一步分化为纯度较高的多能性MSCs。该方法产生的大量MSCs为脂肪细胞的生成提供了理想的细胞来源。然而，脂肪细胞分化后仍存在样本异质性的挑战。因此，我们采用基于尼罗红染色的方法，利用流式细胞荧光分选（FACS）对含脂滴的成熟脂肪细胞进行纯化。该分选策略使我们能够建立一种可靠的方法，利用异质性降低、细胞功能增强的脂肪细胞群体来模拟与脂肪细胞相关的代谢性疾病。

引言

间充质干细胞（MSCs）可作为一种有效的过渡性资源，用于生成中胚层来源的细胞，如脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞，这些细胞可进一步用于构建相应遗传性疾病的模型。然而，以往的方法依赖于从成体组织中获取这些间充质干细胞¹，这给从供体获取大量细胞带来了挑战，同时也限制了其在非理想条件下保持功能活性的能力 体外 培养条件^1,2这些障碍使得建立一种生成间充质干细胞（MSCs）的实验方案的需求日益迫切 体外人类诱导性多能干细胞（iPSCs）可作为间充质干细胞（MSCs）的重要来源，具有MSC的特征^3,4,5. 由iPSCs衍生的MSCs可作为多种疾病的治疗选择。此外，iPSCs衍生的MSCs具有生成脂肪细胞的能力，使其成为一种有价值的 体外 用于研究人类脂肪生成、肥胖症及脂肪细胞相关疾病的人体模型。

目前脂肪细胞的分化方案可分为两类：一类是使用化学物质或基于蛋白质的诱导剂组合进行脂肪细胞分化，最终获得30%-60%的分化效率^6,

方案

本研究已获得相应机构研究伦理委员会的批准，并遵循1964年《赫尔辛基宣言》及其后续修订版或类似的伦理标准进行。研究方案已获哈马德医疗中心（HMC）机构审查委员会（IRB）（编号16260/16）和QBRI（编号2016-003）批准。本研究方法亦适用于H1和H9等人胚胎干细胞（hESCs）。血液样本来自健康个体，并已获得其完全知情同意。诱导多能干细胞（iPSCs）由健康个体外周血单个核细胞（PBMCs）生成。

1. iPSC 的培养与维持

1. 通过将包被基质以1:80的比例在无血清DMEM培养基中重悬，制备基底膜基质包被的培养板，并于4 °C保存。
2. 通过向500 mL干细胞基础培养基中加入50 mL 10倍浓缩的干细胞补充培养基以及5 mL 100倍浓缩的青霉素-链霉素（P/S），配制iPSCs培养基；短期使用可储存于4 °C，长期使用则储存于-20 °C。
3. 用包被基质对培养板进行包被——6孔板每孔1 mL，12孔板每孔500 µL，24孔板每孔250 µL——并在37 °C孵育1–2小时。
4. 取一份iPSCs培养基，在使用前于室温预热。
5. 在37 °C水浴中解冻一管iPSCs（ESCs或iPSCs），并转移至含有2–3 mL培养基的15 mL锥形管中。
6. 在室温（RT，23 °C）下以120 ×g离心4分钟。<....

结果

间充质分化过程中细胞的示意图与形态学特征：诱导性多能干细胞（iPSCs）向间充质干细胞（MSCs）的分化过程包含多个发育阶段，涵盖拟胚体（EB）形成、MSC分化以及MSC扩增（图1）。在这些发育阶段中，由于受到不同诱导化学物质的作用，细胞呈现出多种形态。在启动分化时，细胞以悬浮方式接种，此时细胞应呈圆形，边界清晰，直径为小至中等大小（图2）。在分化的初始阶段选择悬浮培养，可使其更接近自然胚胎发育过程，因此该阶段对成功分化至关重要。在完成拟胚体形成和视黄酸（RA）处理阶段后，将拟胚体接种于基底膜基质包被的培养板上。通过观察拟胚体接种后快速增殖并产生更多MSC的能力，可评估其存活状态（图2）。MSC所表现出的这种快速增殖特性在传代至新的基质包被培养板后仍得以保持，同时维持其特有的细长形态（图2）。

间充质干细胞表面标志物的定量评估：通过定量检测间充质.......

讨论

该方案之所以极为重要，是因为它能够以高产量和高效率获得间充质干细胞（MSCs）。这种大规模生产MSCs的方法得以实现，关键在于将诱导多能干细胞（iPSCs）来源的拟胚体（EBs）短暂地与10 µM的视黄酸（RA）共孵育^14,15。使用10 µM RA进行短暂处理，可使MSC的产量提高11.2至1542倍^14,15，且该方案适用于iPSCs和人多能干细胞（hPSCs）。在此剂量和处理时长下，RA通过直接或间接调控多个参与细胞增殖、凋亡以及细胞间和细胞外基质（ECM）-细胞黏附相关基因的表达，从而增强EB形成细胞的增殖能力和存活能力，而这些过程对iPSCs的存活与增殖至关重要^14,16。这些基因包括但不限于转录因子（如EGFR4、SOX4）、生长因子及生长因子受体（如IGF2、FGFR4）以及.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
脂联素	Abcam	ab22554	脂肪细胞成熟标志物
抗 CD105	BD Pharmingen	560839	间充质干细胞分化标志物
抗 CD14	BD Pharmingen	561712	间充质干细胞分化标志物
抗 CD19	BD Pharmingen	555415	间充质干细胞分化标志物
抗 CD34	BD Pharmingen	555824	间充质干细胞分化标志物
抗 CD44	abcam	ab93758	间充质干细胞分化标志物
抗 CD45	BD Pharmingen	560975	间充质干细胞分化标志物
抗 CD73	BD Pharmingen	550256	间充质干细胞分化标志物
抗 CD90	BD Pharmingen	555596	间充质干细胞分化标志物
bFGF	R&D	233-FP	间充质干细胞培养基补充剂
C/EBPA	Abcam	ab40761	脂肪细胞成熟标志物
地塞米松	Torics	1126	脂肪细胞分化培养基补充剂
FABP4	Abcam	ab93945	脂肪细胞成熟标志物
胎牛血清	ThermoFisher	10082147	间充质干细胞培养基补充剂
Glutamax	ThermoFisher	35050-061	间充质干细胞培养基补充剂
IBMX	Sigma Aldrich	I5879	脂肪细胞分化培养基补充剂
吲哚美辛	Sigma Aldrich	I7378	脂肪细胞分化培养基补充剂
胰岛素	Sigma Aldrich	91077C	脂肪细胞分化培养基补充剂
Knockout DMEM	ThermoFisher	12660012	Matrigel 制备用基础培养基
低糖 DMEM	ThermoFisher	11885084	间充质干细胞培养基
Matrigel	Corning	354230	包被基质
MEM-alpha	ThermoFisher	12561056	脂肪细胞分化培养基
尼罗红	Sigma Aldrich	19123	脂肪细胞分选标志物
青霉素	ThermoFisher	15140122	间充质干细胞/脂肪细胞培养基补充剂
磷酸盐缓冲液	ThermoFisher	14190144	洗涤缓冲液
Pierce™ 20X TBS 缓冲液	Thermo Fisher	28358	洗涤缓冲液
PPARG	Cell Signaling Technology	2443	脂肪细胞成熟标志物
ReLeSR	Stem Cell Technologies	5872	解离试剂
视黄酸	Sigma Aldrich	R2625	间充质干细胞分化培养基补充剂
ROCK 抑制剂	Tocris	1254/10	人多能干细胞培养基补充剂
罗格列酮	Sigma Aldrich	R2408	脂肪细胞分化培养基补充剂
StemFlex	ThermoFisher	A334901	人多能干细胞培养基
Triton	Thermo Fisher	28314	通透化试剂
胰蛋白酶	ThermoFisher	25200072	解离试剂
Tween 20	Sigma Aldrich	P7942	洗涤缓冲液