本方案描述了利用 Arduino 及相关硬件和一个多功能的 Matlab 工具箱，开发用于啮齿类动物模型的开源五选一序列反应时间任务工具箱的方法，其中包括一个可选的自动化行为训练脚本。这些脚本具有可定制性，有助于实现不同的试验与测试设计。
本文内容
摘要
摘要
五选择序列反应时间任务（5-CSRTT）是一种常用于研究啮齿类动物视觉空间注意力和冲动性的行为学测试。该任务要求动物将注意力集中于一排水平排列的五个带有光源的小孔装置，并在限定的时间窗口内，用鼻部触碰被点亮的目标小孔，以在位于实验箱对侧壁的食物递送盒中获得食物奖励。该任务通过反应准确性与反应时间等行为控制指标，可推断动物的选择性注意力和冲动性。通过调节刺激持续时间及任务设计，可控制任务难度。目前市面上的商用设备通常由实验箱体和特定软件组成，用于设定任务参数；但由于其硬件和软件固定，难以灵活调整整体实验设计、特定任务需求以及相关数据输出，存在诸多限制。本文介绍一种完全可定制的替代方案，该方案基于易于使用的单片机微控制器和标准电工元件，结合开放获取的Arduino脚本以及用于硬件控制和行为任务设定的Matlab工具箱。该工具箱包含可选的阶梯式程序，可实现自动化行为训练。整套硬件系统可安装于自定义的实验箱中，软件亦可自由调整，支持非标准化的任务与箱体设计。本文详细描述了该系统的结构设计，以及用于硬件控制和实验设置的开源代码。
引言
5-CSRTT 是一种行为学测试，常用于啮齿类动物以研究视觉注意过程和冲动性1,2,3,4,5,6，例如确定胆碱能系统在注意力中的作用以及去甲肾上腺素再摄取抑制剂对冲动行为的影响7。标准实验装置可用于观察多种控制指标，如反应准确性、反应时间、冲动性和强迫性行为、运动能力以及动机水平1,2,3,4,5。该装置由五个配备LED的孔洞呈水平排列组成，与孔洞相对的箱壁上设有食盒，以及室内照明灯2,5。在典型任务中，室内灯被点亮，随后食盒灯亮起并自动投放一粒免费食丸，标志着实验会话的开始。当动物将鼻部伸入食盒以获取食丸时，即启动一次试验1。随后，食盒灯熄灭，开始试验间间隔（ITI），在此期间动物应将注意力集中于孔洞区域。ITI结束后，其中一个孔洞会呈现刺激光1,2,5。刺激光持续特定时间，称为刺激持续时间（StD）。动物可在刺激呈现期间或StD结束后的一段有限时间内作出反应，后者称为限时保持（LH）。为完成有效反应，动物需将鼻部伸入目标孔洞，若操作正确，则食盒中会释放奖励食丸1,2,5。否则，任何错误反应、在刺激呈现前的反应（预期性或过早反应），或未作出反应（遗漏）均会导致超时（TO），在此期间室内灯将关闭一定时间1,2,5（图1）。总体而言，辨别性刺激的准确性用于衡量注意功能，而过早反应和持续性反应（刺激呈现后在孔洞处重复作出的反应）分别被视为冲动行为和强迫行为的指标1,4,5,6。
图 1：典型 5-CSRTT 的可能试验序列。在试验间间隔结束后，刺激灯亮起特定持续时间，随后在限时保持（Limited Hold）间隔期间熄灭。在此期间，大鼠可作出正确应答以获得奖励，或作出错误应答而进入时间-out状态。若大鼠未能在规定时间内应答，则因遗漏应答而进入时间-out。同样，若其在灯光刺激呈现之前作出应答，则因过早应答而进入时间-out。在获得奖励或时间-out期结束后，开始下一次试验。 请点击此处查看该图的放大版本。
5-CSRTT 因其灵活性而被广泛使用：通过改变试验设计的参数，可以研究注意力的不同子类别。例如，在动物需要将注意力分配到五个不同孔洞（视觉空间注意力）的同时，引入无关刺激（如听觉刺激）可用于测试选择性或持续性注意力1,2,5,6。为此，实验装置可通过添加扬声器进行扩展，这些扬声器可用作干扰性甚至强化性刺激1,2,5,6。此外，通过改变刺激呈现方式或随机化 ITI 持续时间，可直接调节注意力负荷10。5-CSRTT 不仅用于啮齿类动物3,7，近年来还已被改编用于测试非人灵长类动物1,7,8 和鱼类7,9，进一步证明了其可行性。一个完全可定制的 5-CSRTT 工具箱使得标准啮齿类范式能够轻松适配其他动物模型。此外，5-CSRTT 工具箱的高度定制灵活性也促进了采用非标准任务设计的研究工作。
本文介绍的完全可定制的5-CSRTT工具箱包含用于硬件控制的Arduino脚本，该脚本在集成开发环境中编写。此外，工具箱还包括一个用于实验控制的Matlab工具箱（版本R2019b或更新版本）。以下方案说明了如何使用广泛采用的标准范式配置5-CSRTT工具箱，并展示了非标准范式的可选配置方法。
方案
本实验方案遵循欧盟关于实验动物福利的指令2010/63以及德国联邦政府发布的《动物福利法》的建议进行，并已获得当地主管部门的批准。由于研究仅涉及行为训练，未对任何动物实施安乐死，所有动物在研究结束后均继续饲养。研究使用了十只雄性Lister hooded大鼠（行为训练开始时为4月龄）。
1. 动物饲养、管理和操作
- 根据动物福利委员会的建议，将大鼠与其至多五只同窝幼崽共同饲养在配有合适垫料的标准笼具中。
- 将大鼠置于通风良好的房间内，环境温度控制在 20 ± 2 °C，相对湿度不超过 50%，光照周期为 12 小时光照/12 小时黑暗，或依照动物福利委员会的建议执行。限制食物供给（每只大鼠每日 12 g 饲料，参见 材料表），并自由供应饮水。
- 使用无毒的永久性记号笔标记动物的尾巴。
- 在开始行为学实验前，至少对大鼠进行一周的抓取操作训练，使其适应实验人员的接触，并让大鼠提前接触奖励性食物颗粒，以减少对新食物的恐惧。
2. 硬件与控制软件的准备
- 打开免费提供的集成开发环境（IDE）软件（参见材料表）。点击文件 > 打开，然后选择硬件控制脚本（补充文件 1）。
- 将微控制器的 USB 接口插入计算机。在屏幕左上半部分点击工具，检查自动选择的开发板和处理器信息是否与所连接的微控制器开发板一致。选择对应的开发板和处理器信息，然后点击端口以选择可用端口。
- 在屏幕左上半部分，点击草图 > 包含库 > 管理库。在新打开的库管理器窗口中，在搜索栏输入"Adafruit Motor Shield V2"，然后点击对应库的安装按钮。对搜索词"Adafruit Neopixel"重复相同操作。
- 在屏幕左上半部分，点击验证（带对勾图标的按钮），以确保脚本中无错误。然后点击上传（带向右箭头图标的按钮），将脚本上传至微控制器开发板。
3. 实验控制软件的准备
- 确保所有四个实验控制脚本和函数均位于同一文件夹中。
- 打开编程平台，点击屏幕上半部分的 HOME 工具栏选项卡，然后点击 Set Path。点击 Add Folder ，选择包含所有实验控制脚本的文件夹。
- 点击 Save 并关闭 Set Path 窗口。在屏幕上半部分的 HOME 工具栏选项卡中点击 Open ，并打开以下脚本和函数：User （补充文件 2）、Staircase （补充文件 3）和 DataProc （补充文件 4）。
- 按照说明下载并安装 Psychtoolbox 软件，以启用工具箱所使用的 ESC 按钮功能（访问链接见 材料表）。
5-CSRTT 工具箱中使用的参数配置
- 准备适应性训练的工具箱。
注意：图2 展示了本研究中使用的5-CSRTT装置。- 选择已打开的 User 脚本。确保第7行的适应性变量设置为“true”。在第8行输入以分钟为单位的时间（例如，“30”表示30分钟），以设定适应性训练的时间限制。在第9行输入一个介于0.01至1（全亮度）之间的数值，以选择刺激灯的亮度。
注意：本项目中使用的亮度水平设置为0.2。 - 进行行为学实验（步骤5）。
- 选择已打开的 User 脚本。确保第7行的适应性变量设置为“true”。在第8行输入以分钟为单位的时间（例如，“30”表示30分钟），以设定适应性训练的时间限制。在第9行输入一个介于0.01至1（全亮度）之间的数值，以选择刺激灯的亮度。
- 为实验阶段准备工具箱。
- 选择已打开的 User 脚本。确保第7行的变量定义为“false”。
- 在第12行输入实验数据将自动保存的目录路径（例如，“C:\Users\trainer\Desktop\5CSRTT”）。请确保存在与此名称完全相同的目录。
- 在第13行输入受试者标识符（例如，“red1”）。
- 确保第14行的变量定义为“true”，以便生成的数据能自动保存至指定目录路径。
- 确保第15行的变量定义为“true”，并在第16行和第17行分别输入数值，以设定试验次数限制和时间限制（单位为分钟），超过任一限制后程序将自动停止。
- 配置标准5-CSRTT范式的参数。
- 检查第32行的变量是否设置为“true”，以在首次试验前自由发放食丸。将第33行的变量定义为“true”，以确保每次试验开始前要求动物进入食丸仓。检查第34行的变量是否设置为“defined”，并在第35行输入一个数值，以指定ITI（间隔时间）的持续时间（单位为秒）。
- 确保第37行定义的变量设置为“true”，以便提前应答的试验不会影响该阶段的试验次数限制。在第38行输入一个数值，以定义有限保持期（LH）的持续时间（单位为秒）。
- 确保第39行的变量设置为“none”，第40行的变量定义为“false”。在第41行输入一个数值，以定义超时期（TO）的持续时间（单位为秒），并确保第42行的变量设置为“false”。
- 在第45行输入一个数值，表示可被点亮的孔洞数量（例如，“5”）。确保第46行的变量定义为“pseudorandom”或“random”，并在第47行输入一个数值，以设定刺激持续时间（StD）的长度（单位为秒）。检查第48行的变量是否定义为“single”，第49行的数值是否为“1”。在第50行输入一个数值，以定义目标刺激的亮度。
- 检查第64行和第65行的变量是否分别定义为“binary”和“non-dependent”。在第71行输入一个数值，表示在正确鼻触后释放的食丸数量。
- 进行行为学实验（步骤5）。
- 配置非标准5-CSRTT范式的参数。
注意：本小节中描述的所有步骤均为可选。- 若希望使用自动阶梯训练程序中的自动性能检查功能，请确保第18行的变量定义为“true”，并在第20行输入一个数值，以定义性能检查的频率。在第21行输入一个数值，以定义在当前会话中计算受试者性能前必须完成的最少试验次数。确保第21行的变量定义为“all”，以便将当前会话的所有试验纳入性能检查。
- 确保第22行的变量设置为“true”，以便程序根据先前完成的会话更新当前会话的参数。在第23行输入“latest”，以指定上传最近一次的会话。
注意：程序将根据 "Staircase" 函数中的设定，跳转至先前完成的训练层级。也可通过输入以 ".mat" 结尾的数据文件完整路径，选择特定数据集进行上传。 - 若希望启用自动行为训练，请确保第26行的变量设置为“true”。在第27行和第28行分别输入数值，以定义起始训练层级和可用的总层级数。若需对队列进行分组，请在第29行输入一个名称（例如，“group1”）以指定组别。
注意：每个组别可使用其独立的训练层级和层级更新标准。各组别的参数在 "Staircase" 函数（步骤4.2.8）中定义。 - 若希望ITI持续时间随机化，请在第34行输入“random”。输入一个数值区间（例如，“[0,2]”），以定义将被添加至固定ITI持续时间的随机数值的范围。
- 若希望提前应答的试验影响会话的试验次数限制，请在第37行输入“false”。
- 若希望定义一个时间窗口，期间额外的鼻触被计为持续性应答，请在第39行输入一个数值。在第40行输入“true”，以便提前应答触发超时。
- 若希望定义不同的目标孔洞分组方式，请在第48行输入“neighbour”、“shifted”或“all”。在第49行输入一个数值，以定义目标孔洞的总数。若需要使用弱光刺激，请在第51行和第52行分别输入数值，以定义弱光孔洞的数量及其亮度。
- 若希望在刺激呈现前发出短音（C4音调，262 Hz（科学音高记号）），请确保第55行的变量设置为“true”。在第56、57和58行输入数值，以定义扬声器发声与刺激呈现之间的时间窗口（单位为毫秒）、音调持续时间（单位为毫秒）以及音量（允许输入0（无声）至1（全音量）之间的数值）。
- 若希望在成功鼻触后发出短音（C6音调，1047 Hz），请确保第59行的变量设置为“true”。在第60行和第61行输入数值，以定义音调持续时间（单位为毫秒）和音量（允许输入0（无声）至1（全音量）之间的数值）。
- 若希望对弱光点亮孔洞中的应答给予奖励，请确保第64行的变量设置为“non-binary”。在第73行输入一个数值，以定义在弱光点亮孔洞中鼻触所释放的食丸数量。
- 若使用多个食丸分配器，请在第70行和第72行分别输入对应的目标孔洞和弱光点亮孔洞所使用的电机编号。
注意：电机编号只能为1或2。相应的电机驱动板上的螺丝端子M3和M4已在脚本中定义，用于硬件控制。 - 若希望根据反应时间对奖励进行分级，请确保第65行的变量设置为“dependent”。
- 通过在第67行输入数值，定义目标孔洞中鼻触的依赖关系，将反应时间（单位为秒）、电机编号和待发放的食丸数量划分为不同类别，使得特定的反应时间区间对应选定的电机编号和食丸数量。
- 在第68行输入数值，以定义弱光点亮孔洞中鼻触的反应时间（单位为秒）、电机编号和待发放食丸数量的不同类别。
- 按照以下步骤配置Staircase函数。
注意：此步骤为可选。- 选择已打开的 Staircase 函数。在第4行输入第一组的名称（例如，“group1”）。如适用，在第77行输入第二组的名称（例如，“group2”）。
- 若要更改第一组的第二个训练层级的参数，请在第17行输入性能检查中计算出的任一参数（例如，若标准为正确完成30次鼻触，则输入“PerformanceCheck.NumCorrect >= 30”）。
注意：当使用自动加载先前会话功能时（步骤4.2.7.2），请勿更改参数 "Config_trigger == 2"。 - 在第19行输入希望更新的变量及相应的数值（例如，“Config.LED.StimDuration = 30”表示将StD长度设置为30秒）。
注意：可自由选择需更改的参数数量及其新值。唯一要求是，所有希望更新的层级中，待更新的参数必须在变量“UpdateTrigger = 1”之后输入。
- 配置 "DataProc" 函数。
- 选择已打开的 DataProc 函数。若需要自动生成并保存包含会话概览的图表，请从第83行开始输入所需绘图命令。
注意：当前第83行及之后的命令用于绘制会话结果的概览图，以及一些必要的控制指标，例如提前应答的总次数或ITI期间食丸仓按压次数。
- 选择已打开的 DataProc 函数。若需要自动生成并保存包含会话概览的图表，请从第83行开始输入所需绘图命令。
5. 行为学实验
- 在习惯化或实验开始前至少30分钟，将大鼠笼从动物房转移至实验房间，使动物适应测试环境。
- 对于习惯化阶段，准备操作箱：在每个孔洞中放置两粒奖励性食物颗粒，并在食盒门内放置五粒食物颗粒。按照步骤2-4.1设置会话参数。
注意：本实验方案所用的操作箱为改良型斯金纳PVC箱，尺寸为30 × 30 × 45 cm。
注意：在第一阶段习惯化期间，用胶带固定食盒翻板门使其保持开启；在第二阶段习惯化期间，移除食盒翻板门上的胶带。 - 打开用户脚本。确保第75行中的“COM”描述与步骤2.2中选择的可用端口一致。若不匹配，请修改实验控制脚本中的数值（例如，从“COM3”更改为“COM4”）。
- 轻柔地将大鼠放入操作箱中。
- 在已打开的用户脚本中，点击屏幕上半部分的编辑器工具栏选项卡，然后点击绿色播放按钮运行。通过查看"命令窗口"信息，检查程序是否正常运行。
- 如需随时终止实验，请按计算机键盘上的退出键ESC。等待命令窗口显示消息出现，输入"y"，然后按计算机键盘上的回车键，以结束当前会话并保存采集的数据。
- 当达到习惯化或实验会话时间或试验次数上限（分别为步骤4.1.1或4.2.5）时，查看命令窗口 显示的消息。输入"y"，然后按计算机键盘上的回车键，以停止当前会话。
注意：该消息仅在新一次试验开始时显示，并会暂停正在进行的会话，直至输入响应（"y"表示停止会话，"n"表示继续实验）。 - 若为习惯化会话，请检查大鼠是否已摄取全部食物颗粒。重复该习惯化阶段，直至所有颗粒均被摄取，再进入下一习惯化阶段；或在完成第二阶段后，开始进行5-CSRTT训练。
- 会话结束后，清洁操作箱的墙壁和地板，例如使用70%乙醇溶液和纸巾擦拭。在引入下一只大鼠前，等待2-3分钟，直至乙醇气味消散。
- 当日实验结束后，从计算机上拔下微控制器USB线。可选择性关闭硬件控制和实验控制的两个脚本。
结果
图 2：本研究中使用的 5-CSRTT 装置。该装置由一台配备 5-CSRTT 工具箱的笔记本电脑运行，该工具箱提供用于控制微控制器及所有相关设备的脚本，以及多个用于控制 5-CSRTT 实验的脚本。请点击此处查看此图的放大版本。
该完全可定制的工具箱基于单板微控制器和标准电工电子元件，使用简便。图3展示了一个简化的电路和接线图。整个箱体包含5个作为光刺激源的LED和5个用于检测鼻触行为的红外传感器。箱内照明灯由一条含8个LED的灯带构成，食丸仓则由带微动开关的翻板门、电机驱动的食丸分配器以及一条用于照明的8个LED灯带组成。该电路还示例性地展示了可选组件的连接方式，例如用于听觉反馈的无源蜂鸣器扬声器和用于调节音量的数字电位器。有关开发此工具箱所用设备的清单，请参见材料表。
图3：微控制器硬件的简化电路图。 为便于快速定制，微控制器设备已连接 通过 一块面包板。从左上角开始，沿顺时针方向至左下角：微控制器板连接至电机扩展板和直流电机（代表食丸分配器电机）。右侧为用于箱体灯和食盒灯的LED灯带，中间部分包含用于刺激光的五个白色LED以及用于孔道的五对红外传感器。微控制器板下方为一个简单的微动开关（代表食盒翻门中使用的开关）。最后，中间位置还展示了无源蜂鸣器和数字电位器。该图像使用开源软件Fritzing制作。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图 4：实验控制脚本所有组件之间的关联及其“代码”功能的简化示意图。（A）“用户”脚本将其参数发送给“代码”功能，后者直接连接到“阶梯”功能，从而可在实验进行过程中更新“代码”功能中使用的任意参数。“代码”功能随后在会话结束时将其结果发送给“DataProc”功能。（B）在开始实验会话之前，“代码”功能首先检查是否应启动习惯化协议。若否，则根据“用户”脚本中选定的定义设置参数。在每次试验开始前，该功能会检查键盘上的 ESC 键是否被按下。若未按下，则继续进行下一次试验；否则，停止实验会话并将收集的数据传递给 DataProc 功能。每次试验开始前的这一关键检查，使程序能够在达到任意预设时间限制之前停止。请点击此处查看此图的放大版本。
不同实验控制脚本之间的相互关系如图4A所示。“用户”脚本包含定义实验的所有参数，在其中可自由选择决定实验时序、光照刺激的数量与亮度、ITI持续时间等变量。代码函数（补充文件5）详细描述了单次试验的流程及所有可能的结果，该流程在实验过程中反复执行，如图4B所示。此外，该函数还包含动物对实验装置适应过程的协议。代码函数还会定期检查动物的行为表现。此外，阶梯函数为可选模块。系统将动物的表现与预先设定的标准进行比较，当表现达到标准时，相关参数将自动更新。阶梯函数还可参考前一日实验会话中获得的结果。在实验运行过程中，每次试验结束时的性能检查将计算已完成试验的准确率、遗漏次数以及正确反应的总次数，并将结果与阶梯函数中设定的标准进行比较，以决定是否进行阶段更新。最后，DataProc函数处理所有收集到的数据，并生成简单的图表以供快速分析。每次实验会话结束时，工具箱会自动将所有数据保存为*.mat文件，并生成一个包含实验关键信息的额外*.xlsx文件。
图5：5-CSRTT工具箱中不同刺激配置的示例。 该示意图展示了根据所选配置下目标刺激可能出现的组合方式。“全亮”和“单个”配置均用于标准范式中（分别用于习惯化阶段和行为实验）。“相邻”和“偏移”配置则代表非标准刺激配置，允许使用不同数量的点亮刺激，且这些刺激的对比度也可能与目标刺激不同。请点击此处查看该图的放大版本。
步骤 4.2.7.7 提到一个可选功能：更改目标孔洞的分组方式。标准的 5-CSRTT 范式使用单一的目标刺激。在此，我们举例说明所介绍的工具箱如何实现对标准范式的修改。图 5 展示了在总共五个孔洞中，针对所选配置可能出现的一些分组组合。“all”配置会点亮所有可用的孔洞，使每个孔洞都成为目标孔洞，这在初始训练阶段可能有所帮助。“neighbour”配置确保（可自由选择数量的）目标孔洞彼此相邻。可进行设置，使相邻孔洞的照明对比度低于（甚至高于）目标孔洞，但不完全相同。使用不同照明对比度的孔洞可用于测试新范式，例如对在高对比度或低对比度孔洞中进行鼻触探的行为给予不同等级的奖励。图 5 展示了一个具有三个照明强度相同的目标孔洞的示例。“single”配置通常用于标准 5-CSRTT，其中仅有一个目标被点亮。最后，“shifted”配置是对 neighbour 配置的扩展：当目标孔洞位于第一个或最后一个位置时，相邻刺激会分别向最后一个或第一个孔洞偏移。与 neighbour 配置一样，相邻刺激的照明强度可自由设定，可以与目标孔洞相同或不同。此外，总体点亮刺激的数量也可自由选择。工具箱将自动计算所有可能的刺激组合。但此配置下，参数“Config.LED.NumHighLED”必须设置为“1”。
根据方案，对大鼠（N = 10）进行5-CSRTT训练，训练步骤如表1所示。
表1：5-CSRTT训练计划及进入下一级别的标准。（A）在每一训练阶段，试次间间隔均保持恒定，为5 s。（B）每一训练阶段的刺激持续时间。（C）限时响应窗口（Limited Hold, LH），即刺激结束至任意鼻触响应之间的最长允许时间。（D）通过相应训练阶段所需的正确响应总次数。（E）准确率百分比按以下公式计算：
。（F）遗漏错误百分比定义为：
。该标准不包括提前响应。 请点击此处下载该表格。
大鼠的表现根据完成 表1 中各训练阶段所需的训练天数（训练次数）进行比较。所有动物均从训练阶段1开始，初始刺激持续时间（StD）和保持时间（LH）均为60秒。然而，部分大鼠（N = 5）接受了增强的习惯化训练，以测试此前报道的一些额外刺激选项，这解释了不同个体动物在训练阶段1所停留的训练次数存在差异的原因。当动物达到总计30次或更多正确反应时，即视为完成该阶段。在后续的训练阶段中，StD和LH逐渐缩短，同时进入下一训练阶段的标准也更为严格，从而提高了任务对注意力的要求1,6。
表2 显示了一只大鼠在一次训练会话中自动生成的 *.xlsx 电子表格示例。该大鼠以训练等级5规定的配置开始训练。在完成四次试验后，结合本次会话中的试验次数以及上一次会话中达到的准确率，该大鼠进入等级6。在当前会话中，要进入下一个训练等级所需最少完成的试验次数由变量“Config.Experiment.MinNumTrials”指定。在同一会话中，该大鼠在等级6完成了66次试验，并达到准确率 > 80% 且遗漏率 < 20% 的要求后，进一步进入训练等级7。总体上，大鼠共接受了26天的训练，训练等级配置如表1所示。每个训练等级所花费的会话次数见图6A。黑色线条表示所有受试动物的平均值，每条彩色线条代表一只大鼠的数据。所有大鼠均在14至22个会话内达到了第八个训练等级（图6B）。图6C 显示了受试动物在5-CSRTT装置中每个训练等级及全部训练天数的平均表现。虚线黑线表示准确率百分比，实线黑线表示遗漏率百分比。准确率计算为正确反应次数与总反应次数之比。遗漏率计算为遗漏次数与总试验次数之比（即正确反应、错误反应和遗漏次数的总和）。灰色线条表示每个等级所有试验中正确反应的平均总数。图6D 展示了每只受试动物在第八个也是最终训练等级上达到的最终准确率。
大鼠平均需要 5.9（±1.03 SEM）次训练 session 完成第 1 级，1.5（±0.17）至 3.5（±0.5）次 session 完成第 2 至第 6 级，以及 1.7（±0.16）次 session 完成第 7 级，之后达到最终的第 8 级。图 6A 显示，受试个体间的差异在初始级别最为显著（第 1 级标准差 SD = 3.25，第 2 级为 1.58），随后在较高级别中逐渐减小（第 6 级和第 7 级分别为 0.47 和 0.48）。在第 4 级，当刺激持续时间进一步缩短时，大鼠完成该级别的平均 session 次数（2.6 ± 0.52）以及个体间变异（1.64）均有所增加，其中有两只大鼠分别耗时 5 天和 6 天才完成该级别。
图6：使用5-CSRTT工具箱进行行为实验的结果。（A）每个训练阶段完成的会话次数。黑线表示所有受试者在每个阶段的平均会话次数（均值 ± 标准误），彩色线条代表各个受试者的数据。（B）每位受试者达到最终阶段所需的总会话次数。（C）整个训练过程中的平均表现指标（均值 ± 标准误）。黑色虚线表示所有受试者在各训练阶段所有应答中的总体准确率，实黑线表示相应的遗漏率。灰色线表示所有受试者在每个训练阶段的正确应答绝对数量的平均值。（D）每位受试者在第八个也是最后一个训练阶段中的准确率。请点击此处查看该图的放大版本。
表2：一次训练过程中从一只示例大鼠收集的数据。 A列显示了当前训练阶段在整个训练过程中的试验次数，如B列所示。C列显示了ITI持续时间，D列显示了每次试验的开始时间。E至I列分别显示了1至5号孔洞LED刺激的亮度水平。亮度水平为0表示刺激关闭，亮度水平为0.2表示刺激以最大强度的20%开启。J列和K列分别显示了刺激开启和关闭的确切时间。L列显示了试验结果：0表示“未响应”，1表示“正确响应”，3表示“错误响应”（将鼻部探入非目标孔洞），4表示“过早响应”。M列显示了试验中被鼻部探入的孔洞，N列显示了鼻部探入的确切时间。O、P和Q列分别显示了食丸分配器电机启动的时间、对应的电机编号，以及大鼠打开食丸分配器获取奖励的时间。R列显示了每次试验的结束时间。S、T、U、V和W列分别显示了过早响应的总次数、超时次数、ITI期间面板按压次数、持续性错误回答的总次数，以及整个训练过程的总运行时间（以分钟为单位）。请点击此处下载该表格。
补充文件 1：IDE 软件硬件控制脚本（Arduino 代码）。 该文件包含用于控制工具箱中硬件及电工电子组件的全部指令。请点击此处下载该文件。
补充文件 2：实验控制软件中“User”功能的脚本。 该文件包含定义实验的全部参数。请点击此处下载该文件。
补充文件 3：实验控制软件中“阶梯函数”的脚本。 该脚本用于监测受试者的性能，并将其与先前设定的标准进行比较。如果动物的表现达到这些标准，所需参数将自动更新。请点击此处下载该文件。
补充文件 4：实验控制软件中“DataProc”函数的脚本。 该脚本用于处理所有采集的数据，并生成简单的图表以进行快速分析。请点击此处下载该文件。
补充文件5： “代码”功能的脚本。其中包含对单次试验及所有可能结果的详细描述，该内容在实验过程中会反复使用。请点击此处下载该文件。
讨论
本实验方案旨在开发并测试一种低成本、完全可定制的装置，作为标准商用五选择序列反应时间任务（5-choice serial reaction time task, 5-CSRTT）设备的替代方案。通常，市面上的设备仅提供运行标准5-CSRTT研究所必需的有限功能，因此难以对试验设计进行非标准修改，例如调整试验顺序或目标刺激组合。此外，许多现有设备配备专用的封闭式软件，可能无法提供实验中全部的行为学数据，例如提前反应和重复性应答的发生时间及对应孔位。相比之下，本研究所提出的工具箱除成本低廉外，其关键优势在于能够实现多种不同的试验设计和研究范式。目前，该工具箱支持定义多种刺激模式，例如使用弱光刺激、配备两个食丸递送系统，以及根据反应时间调整奖励发放。它还支持使用微型扬声器提供听觉反馈。然而，其主要目的仍是便于用户根据研究目标灵活修改试验序列，例如引入弱光照明孔位、设置决策任务的奖励程序，或整合先进的正向强化训练方法11。此外，系统会完整记录并开放整个实验过程中获取的所有原始数据。该工具箱提供一种阶梯式（Staircase）自动化行为训练功能，该功能同样完全可定制，允许用户调整每一训练层级的升级标准、训练层级数量以及需更新的参数。同时，该装置本身具有高度适应性，试验设计和行为箱布局的调整均可轻松实现，从而使得5-CSRTT范式可应用于那些需要不同于现有商用设备所支持的研究设计的动物物种。
软件配置方案中的特定步骤对于确保实验流程顺利至关重要：尤其是实验第一天，硬件和实验控制软件的准备（步骤2和步骤3）以及步骤5.3的配置尤为关键。必须确保微控制器硬件、其配套软件与实验控制软件之间的串口连接正常工作，这是建立完整功能的5-CSRTT工具箱的关键。在每次实验开始前，建议重复上述三个步骤，以确保硬件和实验控制脚本已正确配置。
最后，该工具箱目前的局限性在于其仅实现在一个专属的编程平台上，这在一定程度上影响了其作为完整开源工具箱的可用性。然而，从原理上讲，由于单次试验的流程保持不变，该工具箱应可轻松适配到其他编程语言（如 Python）中。
与现有的其他方法相比，本文介绍的5-CSRTT工具箱能够实现标准的5-CSRTT范式及其多种改进，例如设定持续性应答的时间窗口，或引入干扰性或强化性刺激（如扬声器或闪烁灯光）。该装置不仅易于使用且高度可调，还具有低成本优势，易于复制，有助于推动采用非啮齿类动物模型的研究工作。
披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作由 DFG WE 5469/3-1 项目资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1200 欧姆电阻器 | 实验室已有 | ||
| 8 位 10 kΩ 数字电位器 | Microchip | MCP42010-I/P | Conrad.de 网站：1083205 |
| ARD MEGA2560 KIT Arduino - Mega 2560 R3 学习套件 | JOY-IT | ARD-Set01 | Reichelt.de 网站：ARD MEGA2560 KIT |
| ARD SHD MOTOR Arduino 扩展板 - 电机控制 | Adafruit | 1438 | Reichelt.de 网站：ARD SHD MOTOR |
| ARDUINO 可堆叠排针套件 - R3 | Sparkfun Electronics | PRT-11417 | Antratek.de 网站：PRT-11417 |
| 动物饲料 | Altromin | 1324 N | Altromin 饲料产品 |
| Euro-Gehäuse | Hammond Electronics | 1591EBK | Conrad.de 网站：520691 |
| 食物颗粒 | Bio-Serv | F0021 | Bio-serv.com 网站：无尘精密颗粒啮齿类饲料 |
| Fritzing | 波茨坦交互设计实验室 | Fritzing 软件下载 | |
| 集成开发环境 | Arduino | Arduino IDE 下载（免费提供） | |
| 红外对射传感器 - 3mm LED | Adafruit | 2167 | Mouser.de 网站：485-2167 |
| 笔记本电脑或计算机 | |||
| 白色圆形 LED 5mm 2000mcd 20mA | TruComponents | 1573731 | Conrad.de 网站：1573731 |
| 微动开关 | Hartmann | MBB1 01 A 01 C 09 A | Conrad.com 网站：707243 |
| NeoPixel 条 - 8 个 WS2812 5050 RGB LED | Adafruit | 1426 | Reichelt.de 网站：DEBO LED NP8 2 |
| 无源蜂鸣器扬声器 | Conrad Components | 93038c213a | Conrad.de 网站：1511468 |
| 颗粒释放盘 | 实验室已有。下图展示类似产品。请注意，其中一些产品使用了不同（且更强）的电机和红外传感器。需根据新规格调整微动开关（第 7 行）和 Arduino 电机扩展板（第 3 行）的使用方式。我们建议使用 3D 打印该转盘，以适配所提供的材料和软件。 Carbatec 通用底板 开放科学框架 Open Feeder Open Ephys 3D 模型食物颗粒分配器 Campden Instruments 45mg 颗粒分配器 | ||
| 编程平台 | Mathworks | R2019b 或更新版本 | |
| Psychtoolbox 软件 | V3 | Psychtoolbox-3 下载 | |
| 带直流有刷电机的直齿轮电机 | Micromotors | B138F.12.208 | Micromotos B138F 系列技术参数 |
参考文献
- Bari, A., Dalley, J. W., Robbins, T. W. The application of the 5-choice serial reaction time task for the assessment of visual attentional processes and impulse control in rats. Nature Protocols. 3 (5), 759-767 (2008).
- Asinof, S. K., Paine, T. A. The 5-choice serial reaction time task: a task of attention and impulse control for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51574(2014).
- Higgins, G. A., Silenieks, L. B. Rodent Test of Attention and Impulsivity: The 5-Choice Serial Reaction Time Task. Current Protocols in Pharmacology. 78 (1), 1-34 (2017).
- Humby, T., Wilkinson, L., Dawson, G. Assaying aspects of attention and impulse control in mice using the 5-choice serial reaction time task. Current Protocols in Neuroscience. 31 (1), 1-15 (2005).
- Robbins, T. The 5-choice serial reaction time task: behavioural pharmacology and functional neurochemistry. Psychopharmacology. 163 (3-4), 362-380 (2002).
- Amitai, N., Markou, A. Disruption of performance in the five-choice serial reaction time task induced by administration of N-methyl-D-aspartate receptor antagonists: relevance to cognitive dysfunction in schizophrenia. Biological Psychiatry. 68 (1), 5-16 (2010).
- Fizet, J., Cassel, J. C., Kelche, C., Meunier, H. A review of the 5-Choice Serial Reaction Time (5-CSRT) task in different vertebrate models. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 71, 135-153 (2016).
- Spinelli, S., et al. Performance of the marmoset monkey on computerized tasks of attention and working memory. Cognitive Brain Research. 19 (2), 123-137 (2004).
- Parker, M. O., et al. Development and automation of a test of impulse control in zebrafish. Frontiers in Systems Neuroscience. 7, 65(2013).
- Birtalan, E., Bánhidi, A., Sanders, J. I., Balázsfi, D., Hangya, B. Efficient training of mice on the 5-choice serial reaction time task in an automated rodent training system. Scientific Reports. 10 (1), 1-8 (2020).
- Fischer, B., Wegener, D. Emphasizing the "positive" in positive reinforcement: using nonbinary rewarding for training monkeys on cognitive tasks. Journal of Neurophysiology. 120 (1), 115-128 (2018).
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