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结构生物学领域已经发展成为一个强大的系统，通过生物分子结构的原子细节来理解生物学，丰富了我们对生化途径和疾病分子基础的理解，并为转化研究提供了不可或缺的工具。
多年来，结构生物学已经远远超出了提供静态结构的范围，还报告了溶液和细胞中的分子相互作用，检查了时间尺度和动力学。可以获得信息来解释不同大小尺度的过程，即从原子和单个分子到整个病毒颗粒和细胞。不同的技术提供了一套协同的实验方法，包括基于X射线、中子或电子的散射方法，例如X射线晶体学（MX）或小角度X射线散射（SAXS）;固态和溶液核磁共振（NMR）;以及通过冷冻电子显微镜 （cryo-EM） 进行单颗粒重建。冷冻电镜断层扫描、冷冻软 X 射线断层扫描和细胞内核磁共振等方法增加了研究大分子系统的方法库，特别是与其他成像工具的结合。连同提供有关分子相互作用的亲和力和时间尺度的补充信息的其他生物物理方法，如今的综合结构生物学为了解生命和开发药物、生物制剂（抗体、纳米抗体、疫苗）、生物材料和其他生物制剂（例如可用于降解塑料和帮助环境的酶）提供了强大的软件包。
很早的时候，欧盟委员会 （EC） 就认识到结构生物学研究对社会的好处，自 1980 年代以来，欧洲大力投资向更大的科学界免费开放昂贵的结构生物学设备。这种获得数百万欧元设施的民主化是国际结构生物学领域发展的驱动力和基石。这使欧洲处于该领域的前沿，从而形成了强大的工业部门并为当地经济做出了贡献。
欧共体在外部研究人员接触和培训结构生物学技术方面有着悠久而令人印象深刻的传统。继 iNEXT 计划（用于转化研究的核磁共振、电磁和 X 射线基础设施）取得成功之后，在 2019 年底之前允许免费进入高端设施和所有欧洲研究人员使用结构生物学，Horizon2020 项目 iNEXT-Discovery 于 2020 年 2 月启动，为期四年，全额资助使用结构生物学基础设施。与此同时，Instruct-ERIC 是欧洲研究基础设施战略论坛的里程碑，构成了欧洲和国际科学界结构生物学的可持续据点。他们共同渴望让生命科学家和其他人参与结构生物学研究，为此，他们为学术界和工业界的研究人员提供了全球一些最好的结构生物学专业知识、技术和设施。他们还与其他合作伙伴一起组织研讨会和实践培训。
由于 Covid19 大流行，前往 iNEXT-Discovery 和 Instruct-ERIC 研究设施的旅行在很大程度上受到了影响，基本上禁止了实践培训机会。为了部分弥补这一点，iNEXT-Discovery 和 Instruct-ERIC 都安排了网络研讨会系列（https://inext-discovery.eu/events/what-can-inext-discovery-do-for-us、 https://instruct-eric.eu/content/instructeric-webinar-series-structure-meets-function），以及《可视化实验杂志》的这期特别方法。在这里，您不仅可以找到我们几种主流访问程序的详细说明，还可以找到综合结构生物学领域正在开发的专业程序的详细说明。虽然本期详细介绍了我们的方法，但有些方法需要当地难以建立的专业知识和设备。Instruct-ERIC 和 iNEXT-Discovery 设施可用于提供这些方法，包括在高技能当地工作人员的帮助和监督下生产结构研究所需的生物分子。
确定大分子结构的改进方法
在过去的十年中，冷冻电镜发展成为一种非常流行的确定大分子复杂结构的技术。来自英国利兹大学的团队概述了单颗粒电磁分析涉及的所有步骤，重点关注在工作流程和常见问题故障排除过程中可以优化的变量1.随着外部用户在线作显微镜成为标准，需要高效的远程作和成像协议。通过单颗粒分析，玻璃化样品被成像以生成显示随机方向颗粒的电影。图像处理工作流程确定了重建所研究标本的参数。CSIC （ES） 的软件 Scipion 提供了创建此工作流程的所有工具，还允许对结果进行直接可追溯性2。
收集非常小的晶体样品的 X 射线衍射数据提供了巨大的研究机会和技术挑战。Diamond（英国）团队介绍了使用冷冻电镜工具在单个网格上制备数百个微晶，在低噪声支架上周围液体最少，然后在专用光束线环境中收集数据，包括样品前后的 X 射线路径中的真空3。同步加速器中的串行 X 射线数据收集也是研究其他困难晶体系统的关键。在另一篇贡献中，戴蒙德通过一系列示例展示了使用各种晶体输送系统收集数据的分步说明、图表和视频4。
药物发现中的现代综合结构生物学
X 射线晶体学在基于片段的药物发现中得到了很好的应用，并且已经普遍用于识别可以顺利开发到主要候选药物上的命中。来自 Diamond5、Helmholtz-Zentrum Berlin （DE） 和 MAX IV （SE）6 以及 EMBL Grenoble 装置 （FR）7 的团队描述了他们在自动化工作流程方面的最新发展，以实现高效的靶标结晶、碎片浸泡、晶体安装、晶体学驱动的碎片筛选和结构沉积。他们的管道相当自动化，并被世界各地的外部研究人员使用。它们已经应用于 100 多个靶标（通常是远程的），以识别命中以进行进一步的化合物设计和结构辅助先导化合物开发。
核磁共振还常用于药物开发活动中的片段筛选，靶向可溶性或膜结合的蛋白质或多核苷酸。法兰克福歌德大学（德国）提出了优化的核磁共振筛选管道，减少了实验和分析过程中的人工干预8。他们的自动进样器在几天不间断的实验和自动分析中，在一次运行中处理数百个核磁共振样品。
此外，生物物理方法是 X 射线和核磁共振的补充。荷兰癌症研究所 （NL） 的团队提出了一种工作流程，使用纳米差示扫描量热法进行热位移测定，以测量添加片段9 后目标熔化温度的变化。在蛋白质质量和浓度的先决条件之后是用于实验设计、数据收集和分析的分析方案。
迈向细胞结构生物学
冷冻电子断层扫描通常是研究细胞中大分子复合物的首选方法。以不同的倾斜角度获取玻璃化样品的图像，并重建 3D 断层扫描，从中提取子体积，通过子断层扫描平均提供更高的分辨率。由于电子与物质相互作用强烈，因此此类研究需要厚度小于 200 nm 的样品。CEITEC团队（CZ）提出了一种方案10 ，用于在急入式冷冻后制备细胞薄片。尽管冷冻电磁系统的自动化取得了令人瞩目的进展，但在进行倾斜系列采集之前需要数小时的数据收集，并且通常仍通过目视网格检查来识别目标。EMBL Heidelberg （DE） 准备了一个自动化协议，用于绘制网格和网格方块、选择目标并设置倾斜系列采集11。
ALBA（ES）和Diamond同步加速器共同讨论了冷冻电镜断层扫描的缺陷和优势，该断层扫描允许检查完整的细胞，即冷冻软X射线断层扫描（cryo-SXT）12。将超分辨率技术应用于低温，可以与冷冻 ET 和冷冻 SXT 进行相关成像。此外，高通量冷冻结构照耀显微镜 （cryo-SIM） 的分辨率是传统荧光的两倍，从而确定分子或结构在厚样品中的特定位置。这可以与冷冻SXT相关联，以查明细胞环境中的特定特征13。
乌得勒支大学 （NL） 团队报告了样品制备和高灵敏度固态核磁共振实验，可用于研究具有挑战性的生理系统，包括天然膜和蛋白质-脂质-聚糖系统14。此外，细胞内溶液核磁共振正在迅速发展以阐明功能过程。CERM/CIRMMP （IT） 团队描述了如何组装和作生物反应器，该反应器允许为高场磁铁核心的 NMR 探针内的活细胞补充营养物质和氧气15。这允许扩展测量和时间分辨实验，例如，用于监测细胞内蛋白质-配体相互作用。
结束语
本期 JoVE 完全致力于欧洲研究基础设施中的最新结构生物学发展和应用。iNEXT-Discovery 和 Instruct-ERIC 共同使结构生物学专家以及越来越多的非专业生命科学家和其他研究人员能够通过提供最先进的服务来追求他们的研究目标。