研究胚胎期受伤鸡角膜中的无瘢痕组织再生

摘要

本方案展示了在鸡胚体内对角膜进行损伤处理的各个步骤。in ovo 损伤后，可通过多种细胞和分子技术分析角膜的再生能力，以评估其再生潜力。 

摘要

鸡胚角膜损伤表现出完全且快速再生的显著能力，而成年个体的受损角膜则因纤维化瘢痕形成而丧失透明性。受伤的鸡胚角膜能够内在地恢复组织完整性，且无明显瘢痕形成。由于其易于接近和操作，鸡胚是研究无瘢痕角膜损伤修复的理想模型。本实验方案展示了对鸡胚角膜进行损伤处理所涉及的各个步骤 在卵内首先，在胚胎发育早期打开卵壳以暴露眼睛。其次，进行一系列操作 在卵内 对胚外膜进行物理操作，以确保在发育后期（即角膜三层细胞结构形成阶段）仍能持续观察到眼部。第三步，使用显微外科刀在角膜上制造穿透外层上皮和前部基质的线性伤口。在造伤后，可通过多种细胞与分子技术对角膜的再生过程或完全恢复的角膜进行分析，以评估其再生潜能。迄今为止，利用该模型开展的研究表明，受损的胚胎角膜会出现角质形成细胞的活化分化，细胞外基质蛋白会协调性地重塑为原有的三维宏观结构，并能被角膜感觉神经充分再支配。未来，可通过发育生物学技术（如组织移植、电穿孔、逆转录病毒感染或微珠植入）分析内源性或外源性因素对愈合中角膜再生过程的潜在影响。目前的研究策略确立了鸡胚胎作为揭示无瘢痕角膜伤口愈合过程中分子与细胞因子协同作用的关键实验模型。

引言

角膜是眼睛最外层的透明组织，具有传导和折射光线的作用，有助于视觉敏锐度。在成年个体的角膜中，角膜基质若受到损伤或感染，会迅速引发强烈的伤口愈合反应，其特征包括角质细胞增殖、纤维化、炎症加剧导致细胞因子诱导的细胞凋亡、修复性肌成纤维细胞的生成，以及细胞外基质（ECM）的整体重塑^1,2。受伤后，此类角膜组织修复常形成不透明的瘢痕组织，降低角膜透明度并阻碍光线通过，从而导致视力扭曲，在最严重的情况下可引起角膜盲³。因此，迫切需要建立可靠的动物模型，以研究伤口愈合的复杂机制，并鉴定参与伤口闭合和组织再生的细胞与分子因素。

迄今为止，大多数关于角膜伤口愈合的研究均采用出生后⁴或成年动物模型^1,2,5,6,7。尽管这些研究显著推动了人们对角膜伤口愈合反应及瘢痕形成机制的理解，但这些愈合模型中的受损角膜组织无法实现完全再生，从而限制了其在识别损伤后角膜形态与结构完全重建所涉及的分子因子和细胞机制方面的应用价值。相比之下，利用刀片在鸡胚角膜中制造的胎儿伤口具有完全无瘢痕愈合的内在能力⁸。具体而言，鸡胚角膜可实现非纤维化的再生，完整重建细胞外基质结构及神经支配模式^8,9。

本方案描述了对鸡胚角膜进行损伤的一系列操作步骤 在卵内首先，在胚胎发育早期对卵进行开窗处理，以便接触胚胎。其次，进行一系列 在卵内 对胚外膜进行物理操作，以确保在发育后期（即角膜三层细胞结构形成并需要造成损伤时）仍能接触到眼球。第三步，使用显微手术刀在角膜中央作线性切口，切口穿透角膜上皮并深入前部基质。损伤后，可通过多种细胞和分子技术分析角膜的再生过程或完全恢复的角膜，以评估其再生潜能。

方案

本实验方案所用鸡蛋的品系为白来航鸡，所有动物实验程序均经伊利诺伊卫斯理大学机构动物护理与使用委员会批准。

1. 鸡蛋的孵化

1. 在鸡蛋产出后，将其置于约 10 °C 环境中保存最多 1 周，以暂停胚胎发育。当需要启动鸡胚发育时，使用浸有室温水的无绒布（参见材料表）擦拭整个蛋壳，以去除污垢和碎屑。
2. 确保蛋壳已消毒。用经 70% 乙醇润湿的无绒布擦拭整个蛋壳表面。迅速擦去乙醇，使蛋壳干燥，避免乙醇透过蛋壳被胚胎吸收。
3. 将鸡蛋水平放置于托盘上。在蛋的顶部做标记，以指示胚胎预期所在的位置。将鸡蛋水平放入 38 °C 的加湿培养箱中，并开启摇动功能进行培养。

2. 对卵进行开窗处理以准备膜解剖

1. 在胚胎发育第3天（E3）从孵育箱中取出鸡蛋。用蘸有70%乙醇的无绒布擦拭蛋壳顶部进行消毒，并将蛋壳表面的乙醇擦干。
   注意：为确保在开窗操作期间胚胎发育未被延迟，可同时取出6–12枚鸡蛋并快速完成操作，其余鸡蛋则保留在孵育箱中。
2. 将一枚鸡蛋水平放置于稳固的蛋托中（见材料表）。使用解剖剪的尖端，在鸡蛋较尖一端附近的蛋壳顶部开一个小孔。
   注意：此小孔有助于移除蛋清，从而降低卵黄和胚胎的位置，使其远离蛋壳内表面。所用蛋托可采用运输鸡蛋时附带的纸浆蛋托。
3. 通过该孔（步骤2.2）插入一支18 G斜面皮下注射针头。将针头推至蛋壳底部内表面，并使针头斜面朝向鸡蛋的尖端（即远离卵黄和胚胎所在位置，胚胎通常位于蛋的中央区域），从中抽出2–3 mL蛋清并弃去。
   注意：若在此步骤中针头刺伤胚胎或其相关血管，会导致血液随蛋清一同被吸出，进而导致胚胎死亡。此外，若不慎将卵黄与蛋清一同吸出，胚胎也将失去活性。若发生上述任一情况，且胚胎无法立即用于其他实验目的，则应弃用该鸡蛋。
4. 用蘸有少量70%乙醇的无绒布清洁开孔周围的蛋壳表面，并擦干。使用透明胶带密封用于移除蛋清的孔洞。
5. 使用解剖剪的尖端，在标记位置（步骤1.3）的蛋壳顶部再开一个"窗口"孔。操作时应确保解剖剪不要深入蛋壳内部过深，以免接触并损伤位于第二孔正下方区域的胚胎或胚胎血管系统。
6. 使用弯头虹膜镊扩大"窗口"孔，使其直径达到约2–3 cm，形成一个通向蛋壳下方发育中胚胎的"窗口"。
   1. 将镊子一端插入孔中，保持其与蛋壳平行且紧贴蛋壳内壁。另一端位于蛋壳外侧，小心闭合镊子两端，使其夹碎并移除小片蛋壳。持续破碎并移除蛋壳碎片，直至形成一个直接覆盖胚胎区域的2–3 cm大小的窗口。
      注意：若胚胎未直接位于步骤2.6所开孔的下方，则该鸡蛋不可使用，因为后续的膜解剖操作将难以完成。即使通过水平摇动调整位置，仍有约10%的鸡蛋因胚胎位置不佳而无法使用。此类胚胎可用于其他用途。
7. 为减少细菌污染，通过窗口孔向蛋内加入约100–200 µL含青霉素/链霉素抗生素的林格氏溶液（每升蒸馏H₂O中含8 g NaCl、0.37 g KCl和0.23 g CaCl₂·2H₂O，含50 U/mL青霉素和50 µg/mL链霉素，见材料表）。
8. 使用透明胶带密封窗口孔。密封时，将胶带一角对准孔的长轴方向，并将胶带压在距离孔边缘约1–2 cm处的蛋壳上。
   1. 继续沿开口边缘贴合胶带，直至一侧留出一段悬垂的胶带片。将两侧胶带压合在一起，在孔上方形成穹顶状结构，最后将悬垂的胶带片压紧至蛋壳表面，完成密封。
      注意：鸡蛋应在E2或E3阶段进行开窗操作。根据经验，早于E2开窗会导致胚胎存活率降低。此外，到E4阶段，胚胎及胚外膜已与蛋壳粘连¹⁰，若在E4或更晚阶段尝试开窗，常会导致胚胎损伤或胚外血管撕裂，任一情况均会导致胚胎死亡。
9. 将已开"窗口"的鸡蛋放回孵育箱继续培养。确保鸡蛋保持水平放置，并关闭孵育箱的摇动功能。
10. 对每枚鸡蛋重复步骤2.2–2.9。

3. 胚外膜的显微解剖

1. 从孵育箱中取出一枚E5.5的开窗鸡胚蛋。使用灭菌的解剖剪剪开覆盖窗口的胶带，暴露鸡胚。
2. 利用解剖显微镜通过窗口观察鸡胚及其胚外膜。如有必要，使用剪刀或弯头虹膜镊扩大窗口，使鸡胚位于窗口正下方，注意避免损伤鸡胚的血管系统。
   1. 加入两滴含有青霉素/链霉素抗生素的林格氏液，以湿润鸡胚并消毒蛋体。
3. 使用解剖显微镜确认鸡胚处于正确的发育阶段（Hamburger-Hamilton 27期，约E5.5）^11,12，并定位羊膜绒毛膜（ACM）和绒毛尿囊膜（CAM）的位置。
   注意：在此阶段，鸡胚被羊膜绒毛膜（ACM）所包围，该膜由羊膜和其上方的绒毛膜融合而成，并部分被高度血管化的尿囊覆盖；尿囊从鸡胚的肠道区域延伸而出，与上方的绒毛膜融合形成绒毛尿囊膜（CAM）^11,12。ACM本身血管化程度较低，因此可对其进行解剖以暴露鸡胚，而不会损伤血管或伤害鸡胚。
4. 在此阶段（E5.5）进行胚外膜的解剖。
   注意：E5.5是进行胚外膜解剖的理想时间。若在更早阶段（例如E4）即在CAM形成前进行解剖，会降低后续阶段对鸡胚的可及性¹¹。此外，在E5.5时，鸡胚仅被高度血管化的CAM部分覆盖，但在接下来的1-2天内，CAM会迅速扩展并完全包裹鸡胚，从而阻碍进一步操作^11,12。因此，在E6或更晚阶段进行膜解剖具有挑战性，因为撕裂血管的风险显著增加。
   1. 使用一对灭菌的精细镊子轻轻夹住ACM，并将其从鸡胚上拉开。然后使用灭菌的显微解剖剪在ACM上剪出一个孔洞，位置位于前肢正上方，切口从覆盖前肢的膜延伸至覆盖头部的膜。
      注意：此步骤可松弛绒毛膜和羊膜，使其在后续步骤中更易于用镊子夹取并进一步解剖。参见图1，了解通过蛋壳窗口进行膜解剖的示意图。
5. 使用两对精细且无菌的镊子，轻轻夹住位于ACM与CAM之间区域的羊膜（例如，前肢上方切口与CAM最近边缘之间的区域）。
   1. 小心地将每对镊子向相反方向移动，两对镊子均牢固夹住羊膜，其中一对向鸡胚背侧移动，另一对向腹侧移动。
      注意：该操作可进一步撕裂羊膜，同时将ACM（被一对镊子相对于鸡胚向背侧拉动）与CAM（被另一对镊子相对于鸡胚向腹侧拉动）分离。
   2. 当CAM不再覆盖鸡胚，且从鸡胚肠道延伸至CAM的尿囊动脉和静脉清晰可见时，表明膜已成功分离。
6. 使用灭菌的精细镊子解剖并移除覆盖在鸡胚上的任何残留羊膜组织。通常可见残留的羊膜部分覆盖鸡胚的尾半部。
   1. 使用灭菌镊子夹住鸡胚中颅区附近的羊膜，小心地将羊膜相对于鸡胚向尾侧方向拉，直至与先前移位的CAM区域重合。此时鸡胚已完全暴露，CAM的进一步生长将主要远离发育中的鸡胚。
      注意：参见图1，了解膜解剖后暴露鸡胚的示意图。此外，可参考先前发表的报告¹¹，获取步骤3.3–3.6的有用示意图。
7. 加入数滴含有青霉素/链霉素抗生素的林格氏液，以湿润鸡胚并消毒蛋体。
8. 使用透明胶带重新密封窗口，方法如步骤2.8所述。将蛋放回孵育箱继续发育，保持蛋体水平，并关闭孵育箱的摇摆功能。
9. 对每枚蛋重复步骤3.1–3.8。
   注意：上述在E5.5进行的胚外膜解剖可使研究人员在E7前持续接触鸡胚，此时可进行损伤实验^8,9。到E8时，CAM组织的持续生长将开始覆盖鸡胚的颅部区域，从而阻碍对角膜的进一步接触。若需在较老的E8–E9角膜上进行损伤操作，可将生长中的CAM相对于鸡胚向腹侧重新定位（步骤3.10）。若计划在E7进行损伤，则无需执行步骤3.10，可直接进入步骤4（角膜损伤）。
10. 从孵育箱中取出一枚在E5.5已进行过胚外膜解剖（步骤3.1–3.8）的E7鸡胚蛋。使用灭菌镊子夹住任何与CAM融合的可用羊膜组织，相对于鸡胚向腹侧方向轻轻将羊膜从鸡胚颅部区域拉开。
    ​注意：由于被移开的羊膜与CAM融合，因此生长中且高度血管化的CAM将随夹持羊膜的镊子移动，从而远离鸡胚颅部区域。每日重复此步骤，持续将CAM从鸡胚区域移开，直至鸡胚达到所需损伤年龄。

4. 角膜损伤

1. 从孵化箱中取出处于所需胚胎发育阶段（E7-E9）的鸡蛋进行损伤操作。使用无菌解剖剪剪开胶带，暴露窗口处的胚胎。滴加数滴含有青霉素/链霉素抗生素的林格氏液，以保持胚胎湿润并消毒鸡蛋。
2. 使用显微解剖刀在右眼角膜上做一个切口，切口应与脉络膜裂平行并对齐（由于胚胎在蛋内的位置关系，左眼无法操作，可作为未损伤对照）（图1）。第一次切割将穿过角膜上皮层。
   1. 在同一位置使用显微解剖刀再进行两次角膜切割（共三次切割，其中第二次和第三次切割与第一次在角膜上的位置相同）¹¹。第二次切割将穿过基底膜，第三次切割将穿透前部基质层。
      注意：如果胚胎已沉入被切开的绒毛尿囊膜（CAM）下方，可使用无菌弯头虹膜镊小心地将头部从CAM下方移出。将弯头虹膜镊置于头部下方，接触头部左侧，用闭合的镊子托住整个头部，轻柔地将头部抬升至CAM上方。为提高存活率，在手术完成后，可使用相同技术用弯头虹膜镊将胚胎重新置于CAM下方，以促进CAM正常生长。
3. 滴加3–4滴含有青霉素/链霉素抗生素的林格氏液，以保持胚胎湿润并消毒鸡蛋。
4. 用透明胶带重新密封窗口，将鸡蛋水平放回孵化箱。让胚胎继续发育，并使角膜伤口在设定的时间内愈合（例如0.5–11天），随后通过断头法人道处死胚胎。
5. 将已处死的胚胎置于盛有林格氏生理盐水的培养皿中，使用弯头虹膜镊轻轻夹住眼球后部（即眼球与面部组织交界处），小心地将整个眼球从面部组织中完整取出。
   1. 使用精细镊子在完整眼球的后部刺一个小孔（3–5 cm），并在4 °C条件下用4%多聚甲醛固定过夜，同时施加轻微振荡。

结果

在E5.5期对ACM和CAM进行初步解剖以暴露胚胎头颅区域后，于E7期在中央角膜区域进行了一系列贯穿性切口 在卵内 (图1）。理想的角膜再生研究伤口是在角膜相同位置进行三次切口所致。第一次切口穿透角膜上皮层，第二和第三次切口则分别穿透下方的基底膜和前部基质。为获得理想的伤口，必须使用锋利的显微解剖刀（参见 材料表）并在制造裂伤时施加适当的压力（图2，参见理想伤口）。压力过小会导致伤口过浅，仅撕裂角膜上皮而未能充分穿透前基质层。图2，见浅层伤口）。然而，施加压力过大则会导致全层伤口，穿透整个基质层，使房水暴露于外部环境（图2，见伤口全貌。

进行适当的切割切口可形成理想的伤口（图2），该伤口在初期会扩大（伤后0-3天）

讨论

鸡是研究胎儿期无瘢痕角膜损伤修复的理想模型系统。与哺乳动物不同，鸡在发育过程中可通过蛋内（in ovo）⁸ 或离体蛋（ex ovo）策略方便地进行操作²⁴。鸡胚胎的角膜远大于啮齿类动物的角膜，其颅腔体积中近50%被眼睛占据²⁵，因此非常适合进行如损伤等物理操作。此外，鸡胚蛋全年均可获得，通常可从本地农场获取，成本低廉，仅需恒温恒湿培养箱即可支持其发育。

本方案介绍了一系列用于制备鸡胚角膜损伤的实验步骤。鸡胚角膜所形成的损伤能够完全再生，可完整重建天然角膜结构，且无任何可检测到的瘢痕形成。该技术使鸡胚成为揭示无瘢痕角膜伤口愈合过程中分子与细胞因子协同作用的关键动物模型。

尽管本文所述的胎儿伤口愈合模型具有明确的前景，但值得注意的是，胎儿与成体角膜伤口愈合之间存在显著差异。胚胎期角膜表达多种在成体组织中被沉默或缺失的生长因子和形态发生信号

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
18 G 皮下注射针头	Fisher Scientific	14-826-5D
30度角显微解剖刀	Fine Science Tools	10056-12
4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）	Molecular Probes	D1306
5 mL 注射器	Fisher Scientific	14-829-45
Alexa Fluor 标记的二抗	Molecular Probes
二水合氯化钙（CaCl2-H20）	Sigma	C8106
鸡卵托盘	GQF	O246
解剖镊，细尖，带齿	VWR	82027-408
解剖剪，尖头	VWR	82027-578
全弯式 1×2 齿虹膜组织镊	VWR	100494-908
Kimwipes 擦镜纸	Sigma	Z188956
显微解剖剪	VWR	470315-228
小鼠抗纤维连接蛋白（IgG1）	发育研究杂交瘤库	B3/D6
小鼠抗层粘连蛋白（IgG1）	发育研究杂交瘤库	3H11
小鼠抗神经元特异性 β-微管蛋白（Tuj1，IgG2a）	Biolegend	801213
小鼠抗腱生蛋白（IgG1）	发育研究杂交瘤库	M1-B4
多聚甲醛	Sigma	158127
青霉素/链霉素	Sigma	P4333
氯化钾（KCl）	Sigma	P5405
氯化钠（NaCl）	Fisher Scientific	BP358
Sportsman 1502 孵化器	GQF	1502
手动撕取包装胶带（1.88 英寸宽）	Scotch	n/a