本方案展示了在鸡胚体内对角膜进行损伤处理的各个步骤。in ovo 损伤后，可通过多种细胞和分子技术分析角膜的再生能力，以评估其再生潜力。
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摘要
摘要
鸡胚角膜损伤表现出完全且快速再生的显著能力，而成年个体的受损角膜则因纤维化瘢痕形成而丧失透明性。受伤的鸡胚角膜能够内在地恢复组织完整性，且无明显瘢痕形成。由于其易于接近和操作，鸡胚是研究无瘢痕角膜损伤修复的理想模型。本实验方案展示了对鸡胚角膜进行损伤处理所涉及的各个步骤 在卵内首先，在胚胎发育早期打开卵壳以暴露眼睛。其次，进行一系列操作 在卵内 对胚外膜进行物理操作，以确保在发育后期（即角膜三层细胞结构形成阶段）仍能持续观察到眼部。第三步，使用显微外科刀在角膜上制造穿透外层上皮和前部基质的线性伤口。在造伤后，可通过多种细胞与分子技术对角膜的再生过程或完全恢复的角膜进行分析，以评估其再生潜能。迄今为止，利用该模型开展的研究表明，受损的胚胎角膜会出现角质形成细胞的活化分化，细胞外基质蛋白会协调性地重塑为原有的三维宏观结构，并能被角膜感觉神经充分再支配。未来，可通过发育生物学技术（如组织移植、电穿孔、逆转录病毒感染或微珠植入）分析内源性或外源性因素对愈合中角膜再生过程的潜在影响。目前的研究策略确立了鸡胚胎作为揭示无瘢痕角膜伤口愈合过程中分子与细胞因子协同作用的关键实验模型。
引言
角膜是眼睛最外层的透明组织，具有传导和折射光线的作用，有助于视觉敏锐度。在成年个体的角膜中，角膜基质若受到损伤或感染，会迅速引发强烈的伤口愈合反应，其特征包括角质细胞增殖、纤维化、炎症加剧导致细胞因子诱导的细胞凋亡、修复性肌成纤维细胞的生成，以及细胞外基质（ECM）的整体重塑1,2。受伤后，此类角膜组织修复常形成不透明的瘢痕组织，降低角膜透明度并阻碍光线通过，从而导致视力扭曲，在最严重的情况下可引起角膜盲3。因此，迫切需要建立可靠的动物模型，以研究伤口愈合的复杂机制，并鉴定参与伤口闭合和组织再生的细胞与分子因素。
迄今为止，大多数关于角膜伤口愈合的研究均采用出生后4或成年动物模型1,2,5,6,7。尽管这些研究显著推动了人们对角膜伤口愈合反应及瘢痕形成机制的理解，但这些愈合模型中的受损角膜组织无法实现完全再生，从而限制了其在识别损伤后角膜形态与....
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方案
本实验方案所用鸡蛋的品系为白来航鸡，所有动物实验程序均经伊利诺伊卫斯理大学机构动物护理与使用委员会批准。
1. 鸡蛋的孵化
- 在鸡蛋产出后，将其置于约 10 °C 环境中保存最多 1 周，以暂停胚胎发育。当需要启动鸡胚发育时，使用浸有室温水的无绒布（参见材料表）擦拭整个蛋壳，以去除污垢和碎屑。
- 确保蛋壳已消毒。用经 70% 乙醇润湿的无绒布擦拭整个蛋壳表面。迅速擦去乙醇，使蛋壳干燥，避免乙醇透过蛋壳被胚胎吸收。
- 将鸡蛋水平放置于托盘上。在蛋的顶部做标记，以指示胚胎预期所在的位置。将鸡蛋水平放入 38 °C 的加湿培养箱中，并开启摇动功能进行培养。
2. 对卵进行开窗处理以准备膜解剖
- 在胚胎发育第3天（E3）从孵育箱中取出鸡蛋。用蘸有70%乙醇的无绒布擦拭蛋壳顶部进行消毒，并将蛋壳表面的乙醇擦干。
注意：为确保在开窗操作期间胚胎发育未被延迟，可同时取出6–12枚鸡蛋并快速完成操作，其余鸡蛋则保留在孵育箱中。 - 将一枚鸡蛋水平放置于稳固的蛋托中（见材料表）。使用解剖剪的尖端，在鸡蛋较尖一端附近的蛋壳顶部开一个小孔。
注意：此小孔有助于移除蛋清，从而....
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结果
在E5.5期对ACM和CAM进行初步解剖以暴露胚胎头颅区域后，于E7期在中央角膜区域进行了一系列贯穿性切口 在卵内 (图1）。理想的角膜再生研究伤口是在角膜相同位置进行三次切口所致。第一次切口穿透角膜上皮层，第二和第三次切口则分别穿透下方的基底膜和前部基质。为获得理想的伤口，必须使用锋利的显微解剖刀（参见 材料表）并在制造裂伤时施加适当的压力（图2，参见理想伤口）。压力过小会导致伤口过浅，仅撕裂角膜上皮而未能充分穿透前基质层。图2，见浅层伤口）。然而，施加压力过大则会导致全层伤口，穿透整个基质层，使房水暴露于外部环境（图2，见伤口全貌。
进行适当的切割切口可形成理想的伤口（图2），该伤口在初期会扩大（伤后0-3天）
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讨论
鸡是研究胎儿期无瘢痕角膜损伤修复的理想模型系统。与哺乳动物不同，鸡在发育过程中可通过蛋内（in ovo）8 或离体蛋（ex ovo）策略方便地进行操作24。鸡胚胎的角膜远大于啮齿类动物的角膜，其颅腔体积中近50%被眼睛占据25，因此非常适合进行如损伤等物理操作。此外，鸡胚蛋全年均可获得，通常可从本地农场获取，成本低廉，仅需恒温恒湿培养箱即可支持其发育。
本方案介绍了一系列用于制备鸡胚角膜损伤的实验步骤。鸡胚角膜所形成的损伤能够完全再生，可完整重建天然角膜结构，且无任何可检测到的瘢痕形成。该技术使鸡胚成为揭示无瘢痕角膜伤口愈合过程中分子与细胞因子协同作用的关键动物模型。
尽管本文所述的胎儿伤口愈合模型具有明确的前景，但值得注意的是，胎儿与成体角膜伤口愈合之间存在显著差异。胚胎期角膜表达多种在成体组织中被沉默或缺失的生长因子和形态发生信号
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披露
作者声明，对本文所述信息不存在任何竞争性财务利益。
致谢
本研究得到了伊利诺伊卫斯理大学授予TS的艺术与学术发展基金以及NIH-R01EY022158（PL）的部分资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 18 G 皮下注射针头 | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| 30度角显微解剖刀 | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI） | Molecular Probes | D1306 | |
| 5 mL 注射器 | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Alexa Fluor 标记的二抗 | Molecular Probes | ||
| 二水合氯化钙（CaCl2-H20） | Sigma | C8106 | |
| 鸡卵托盘 | GQF | O246 | |
| 解剖镊，细尖，带齿 | VWR | 82027-408 | |
| 解剖剪，尖头 | VWR | 82027-578 | |
| 全弯式 1×2 齿虹膜组织镊 | VWR | 100494-908 | |
| Kimwipes 擦镜纸 | Sigma | Z188956 | |
| 显微解剖剪 | VWR | 470315-228 | |
| 小鼠抗纤维连接蛋白（IgG1） | 发育研究杂交瘤库 | B3/D6 | |
| 小鼠抗层粘连蛋白（IgG1） | 发育研究杂交瘤库 | 3H11 | |
| 小鼠抗神经元特异性 β-微管蛋白（Tuj1，IgG2a） | Biolegend | 801213 | |
| 小鼠抗腱生蛋白（IgG1） | 发育研究杂交瘤库 | M1-B4 | |
| 多聚甲醛 | Sigma | 158127 | |
| 青霉素/链霉素 | Sigma | P4333 | |
| 氯化钾（KCl） | Sigma | P5405 | |
| 氯化钠（NaCl） | Fisher Scientific | BP358 | |
| Sportsman 1502 孵化器 | GQF | 1502 | |
| 手动撕取包装胶带（1.88 英寸宽） | Scotch | n/a |
参考文献
- Wilson, S. E. Corneal wound healing. Experimental Eye Research. 197, 108089(2020).
- Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
- Whitcher, J. P., Srinivasan, M., Upadhyay, M. P.
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