通过无创经鼻途径在免疫功能健全小鼠脑内移植人诱导多能干细胞来源的小胶质细胞

摘要

本文介绍的实验方案允许通过鼻腔途径将诱导多能干细胞来源的人小胶质细胞（iPSMG）移植到免疫功能健全的小鼠脑内。文中展示了细胞的制备与鼻腔移植方法，以及为维持iPSMG存活而给予细胞因子混合物的操作步骤。

摘要

小胶质细胞是脑内具有巨噬细胞样特性的特殊细胞群体，在生理和病理条件下的脑功能中均发挥关键作用。目前对小胶质细胞的大多数认识主要基于小鼠实验获得。人类小胶质细胞与小鼠小胶质细胞存在差异，因此小鼠小胶质细胞的反应特征并不总能代表人类小胶质细胞。此外，由于伦理和技术上的困难，对人类小胶质细胞的研究受到限制 体外 培养系统，不会屈服 体内 小胶质细胞的特性。为了解决这些问题，已开发出一种简化方法，通过鼻腔途径将诱导多能干细胞来源的人源小胶质细胞（iPSMG）非侵入性地移植到免疫功能健全的小鼠脑内，同时联合使用集落刺激因子1受体（CSF1R）拮抗剂以药理学方式清除内源性小胶质细胞。该方案提供了一种非侵入性地将细胞移植至小鼠脑内的方法，因此可能在评估 体内 人小胶质细胞在生理和病理脑功能中的作用

引言

小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中一类特殊的巨噬细胞样细胞，在调控多种脑功能（如神经环路发育、神经递质传递调节以及脑内稳态维持）中发挥关键作用^1,2,3尽管小鼠小胶质细胞与人类小胶质细胞具有许多相似功能，但二者存在物种特异性差异。因此，小鼠小胶质细胞对各种刺激的反应可能并不总能代表人类小胶质细胞的反应^4,5,6尽管许多研究已对人类小胶质细胞进行了分析，但这些实验仅限于 体外 研究。 体外 培养的人类小胶质细胞在形态特征和基因表达方面与体内细胞存在显著差异 体内因此， 体外 实验结果并不总是屈从于 在体内 人小胶质细胞的特性。因此，需要建立一种用于研究人小胶质细胞的实验体系 体内 是必需的。

最近，为了研究 体内 人小胶质细胞的特性， 体外 将由诱导性多能干细胞（iPSCs）或胚胎干细胞分化而来的人源小胶质细胞通过手术移植至小鼠脑内^{7,8,9,10,11,12,13,14}. 采用这种方法，可实现多种 体内 已对人源小胶质细胞的特征进行了表征。然而，该方法的广泛应用受到两个因素的限制。首先是需要使用免疫缺陷小鼠。因此，为了研究人源小胶质细胞在多种神经退行性疾病中的作用，必须将携带疾病突变的小鼠与免疫缺陷小鼠进行杂交，这一过程耗时且费力。此外，在多种神经系统疾病中，外周免疫细胞（如T细胞）能够调节小胶质细胞的功能^15,16,17因此，在免疫缺陷小鼠中进行的实验可能无法真实反映人类小胶质细胞的固有特性 体内其次，移植小胶质细胞所需的侵入性手术需要额外的设备和培训。此外，侵入性移植过程中可能造成的脑损伤会改变小胶质细胞的表型。

本方案描述了将iPSMG非侵入性地经鼻移植（Tsn）到免疫功能健全的野生型小鼠体内的方法¹⁸。通过联合使用CSF1R拮抗剂PLX5622（可清除内源性小鼠小胶质细胞）¹⁹的药理学开关调控作用与Tsn技术，可实现iPSMG非侵入性地移植至小鼠脑内。此外，在外源性人源细胞因子的应用下，移植的iPSMG可在无需任何免疫抑制剂的条件下，在脑内特定区域存活长达60天。

方案

本研究中使用的所有动物均按照 "生理科学领域中动物护理与使用的指导原则" 由日本生理学会出版²⁰，并已获得日本山梨大学动物护理委员会（Yamanashi, Japan）的预先批准。

1. 细胞培养基、移植培养基和麻醉混合液的制备

1. 在 DMEM 中加入 10% 胎牛血清和 0.1% 青霉素/链霉素，配制细胞培养基。
2. 在细胞培养基中加入 hCSF1（250 ng/mL）和 hTGF-β1（100 ng/mL），配制移植培养基。
3. 将 0.45 mL 盐酸美托咪啶、1.2 mL 咪达唑仑和 1.5 mL 酒石酸布托啡诺溶于 11.8 mL 生理盐水中，配制用于腹腔注射的麻醉混合液。

iPSMG 的制备

注意：诱导性多能干细胞来源的间充质样细胞（iPSMG）（材料表）保存在 -80 °C，直至使用。

1. 将冻存的细胞在37 °C水浴中快速解冻。轻轻摇动样品，直至所有可见冰晶完全融化。
2. 将解冻后的iPSMG加入预热至37 °C的培养基中。取1 mL含解冻细胞的培养液（含1 × 10⁶个细胞），加入10 mL培养基中。
3. 以300 x g离心5分钟，获得细胞沉淀。
4. 离心后，小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。建议彻底去除上清液，以减少对移植介质中细胞因子浓度的稀释。
5. 加入移植介质，调整细胞浓度至1 × 10⁵个细胞/µL。
6. 将iPSMG置于冰上，并立即进行移植。
   ​注意：iPSMG的移植前制备应在洁净工作台中进行，以避免污染。

3. 小鼠经鼻移植（Tsn）的准备

1. 用含有PLX5622的饲料喂养野生型雄性小鼠（C57BL/6J，8周龄）7天。
2. 7 结束时^th 第几天停止给予PLX饮食，并将小鼠转为正常饮食直至研究结束。
   注意：含PLX5622的饲料通过将1.2 g PLX5622加入1 kg AIN-93G中制备材料表).

4. 细胞经鼻移植

1. 在停止PLX喂养24小时后，称量小鼠体重，并通过腹腔注射麻醉混合物（0.2 mL/20 g）进行麻醉。
2. 当小鼠完全麻醉（通过足底回缩反射测试，即用力捏脚趾无反应）后，于iPSMG经鼻移植前1小时，使用10 µL移液枪头向每侧鼻孔分两次给予2.5 µL含透明质酸酶的PBS溶液（100 U/mL），以增加鼻黏膜通透性。
3. 应用透明质酸酶后，将小鼠置于仰卧位。
4. 在iPSMG经鼻移植前10分钟，重复步骤4.2。
5. 使用10 µL移液枪头向小鼠一侧鼻孔给予2.5 µL细胞悬液。
6. 在向另一侧鼻孔给药前，将小鼠保持仰卧位5分钟。
7. 重复步骤4.5和4.6共四次，每只动物总给药体积为20 µL。
8. 将小鼠仰卧置于37 °C加热垫上，直至从麻醉中恢复。
9. 在停止PLX喂养48小时后，对同一批小鼠再次重复执行步骤4.1–4.7。
   ​注意：iPSMG在移植过程中应置于冰上保存。

细胞因子的应用

1. 通过腹腔注射麻醉混合物（0.2 mL/20 g）使小鼠麻醉。
2. 使用10 µL移液器吸头将2.5 µL移植培养基注入小鼠一侧鼻孔。
3. 在向另一侧鼻孔给予移植培养基前，将小鼠保持仰卧位5分钟。
4. 重复步骤5.2和5.3共四次，每只动物总注射体积为20 µL。
   注意：应注意到，为保证移植的iPSMG细胞在研究结束前的存活，需每12小时通过鼻腔给予一次移植培养基（人源细胞因子）。

结果

该技术可使研究者无创地将iPSMG移植至小鼠脑的海马和小脑，但无法移植至大脑皮层。研究完成后，对麻醉小鼠进行冰浴PBS(−)经心灌注，随后灌注冰浴的含4% (w/v)多聚甲醛的PBS。取出脑组织，在4% (w/v)多聚甲醛中后固定过夜，并转移至含30% (w/v)蔗糖的PBS中进行冷冻保护。随后将脑组织包埋于包埋剂中，在冷冻切片机上切片（冠状面，厚度20 µm）。切片用PBS(−)洗涤三次（每次10分钟），再用含0.5% (v/v) Triton X-100和10%正常山羊血清的溶液进行通透和封闭处理1小时。接着，切片与人特异性胞质标记抗体STEM121（1:100）和抗Iba1抗体（1:1000）在4℃孵育5天。随后，切片再次用PBS(−)洗涤三次（每次10分钟），再与二抗——Alexa Fluor 488或546标记的小鼠或兔IgG（1:1000）——室温孵育2小时。用PBS(−)洗涤三次后，将切片用抗荧光淬灭封片剂封片。使用配备40倍物镜的共聚焦显微镜采集荧光图像。图1展示了移植后2个月海马和皮层中iPSMG的存活情况。移植细胞的数量可通过计数同时表达人特异性抗体和泛小胶质细胞/单核细胞标记物的细胞来确定，而内源性小鼠小胶质细胞仅表达泛小胶质细胞/单核细胞标记物，如先前所述¹⁸。移植的iPSMG可替代小鼠小胶质细胞，在海马中呈现分支状形态，而在皮层中未检测到¹⁸。

图1：Tsn后2个月iPSMG在皮层和海马体中的存活情况。 左侧图显示使用泛小胶质细胞/单核细胞标记物Iba1（绿色）进行的免疫染色。中间图显示使用人源特异性胞质标记物STEM121（红色）进行的免疫染色。右侧图为Iba1与STEM121免疫染色的合并图像。(A) 在对照组小鼠中，皮层和海马体中仅检测到小鼠来源的小胶质细胞（Iba1+/STEM121-）。(B) 在移植iPSMG的小鼠中，皮层中仅检测到小鼠小胶质细胞（Iba1⁺/STEM121^-），而在海马体中检测到了iPSMG（Iba1⁺/STEM121⁺）。图像中的箭头指示小鼠小胶质细胞，箭头指示iPSMG。荧光图像使用配备40倍物镜的共聚焦显微镜采集。最大图像尺寸：1024 x 1024像素。放大倍数：2。比例尺 = 50 µm 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本方案描述了将诱导性小胶质样细胞（iPSMG）非侵入性移植到小鼠脑内的方法。本方案的独特之处在于，通过结合药理学PLX ON/OFF方法与经鼻腔移植技术，可实现iPSMG在免疫功能健全小鼠脑内的非侵入性移植。移植后的iPSMG通过占据空置的生态位，在海马和小脑中形成了大部分的小胶质细胞，持续时间可达60天，但在大脑皮层中未见类似现象。

高效移植iPSMG的关键因素包括：（i）内源性小鼠小胶质细胞的清除效率；（ii）每12小时给予人源细胞因子。小胶质细胞在大脑中维持自身的空间区域。为了给移植的iPSMG提供植入生态位，必须高效清除小鼠小胶质细胞。当内源性小鼠小胶质细胞清除不充分时，iPSMG在小鼠海马和小脑中的定植将无法观察到。小胶质细胞的存活依赖于CSF1R和TGFBR信号通路^19,21,22。已有报道表明，hCSF1可选择性增强人源小胶质细胞的存活能力，而hTGF-β1不仅对小胶质细胞的存活至关重要，且每12小时给药一次还能抑制炎症反应^21,23,24。若未外源性补充人源细胞因子，则在小鼠脑中无法观察到iPSMG的存在。此外，在移植前应避免通过过度吹打或其他机械方式激活iPSMG，因为这会不可逆地改变iPSMG的特性及其移植效率。如果未观察到理想的iPSMG移植效果，则必须评估移植前iPSMG的存活率以及内源性小胶质细胞的清除情况。若内源性小鼠小胶质细胞的清除率未达到90%以上，可调整PLX5622的给药时间以提高清除效率。

与具有侵入性且需要额外设备和培训的传统外科移植方法相比，Tsn 能够以非侵入性、简单、稳定且便捷的方式实现移植。 此外，该方法允许将 iPSMG 移植到免疫功能健全的小鼠脑内；因此，可利用免疫功能健全的疾病模型小鼠来研究 iPSMG 的反应。

当前方法最大的缺点是iPSMG移植后存在区域异质性。如果需要进行脑区特异性的iPSMG移植，现有方案并不适用，因为移植的iPSMG仅在海马和小脑中可持续植入60天，而在皮层中则无法植入。此外，每12小时需经鼻给予外源性人源细胞因子，这也是当前方案的局限性，因其需要大量人力且成本较高。

综上所述，本文提供了一种将iPSMG移植到免疫功能健全小鼠脑内的详细方案。当该方案与PLX5622介导的小鼠小胶质细胞药理学开启/关闭调控相结合时，可实现iPSMG的成功植入。由于在施加外源性细胞因子的情况下，移植的细胞可在海马和小脑中长期存活，因此该方法可能有助于评估人源小胶质细胞在这些脑区生理和病理状态中的作用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	赛默飞世尔科技	10566
AIN 93G	Oriental Yeast Co
抗Iba1抗体	富士胶片	019–19741
抗STEM121抗体	Takara生物科学	Y40410
酒石酸布托啡诺	Kyoritsu Seiyaku	8019
共聚焦显微镜	Olympus	FV1200
胎牛血清	GE Healthcare Life Sciences	SH30070.03
冷冻的iPSMG	Shionogi & Co., Ltd		药物发现与疾病研究实验室
人集落刺激因子1（hCSF1）	PeproTech	300-25
透明质酸酶	Sigma-Aldrich	H-3506
盐酸美托咪定	明治制果	VETLI5
咪达唑仑	Astellas	18005A2
多聚甲醛	和光纯药工业	162-16065
青霉素/链霉素	赛默飞世尔科技	15140-122
移液器	Eppendorf	3120000011
移液器吸头	Eppendorf	30076028
PLX5622	Amadis Chemical	A930097
转化生长因子-β1（Tgf-b1）	PeproTech	100-21
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X-100
VECTA SHIELD 硬封固封片介质	Vector Laboratories	H-1400-10	抗荧光淬灭封片剂