本文介绍了一种人为造成Wistar白化大鼠股骨干骨折并观察骨痂形成过程的实验方案。该股骨截骨模型可帮助研究人员评估骨折愈合过程，并研究药物对骨折愈合的影响。
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本文内容
摘要
摘要
骨折愈合是一个生理过程，通过成骨细胞和破骨细胞的协同作用实现骨缺损的再生。促骨形成药物具有促进骨折修复的潜力，但存在成本高或不良副作用等限制。一种药物的骨愈合潜力最初可通过体外（in vitro）研究来确定，但最终的概念验证仍需体内（in vivo）研究。我们的目标是建立一种股骨截骨啮齿类动物模型，以帮助研究人员理解股骨干骨折后骨痂形成的发育过程，并可用于评估潜在药物是否具有促进骨愈合的特性。实验采用经机构动物伦理委员会批准后的成年雄性Wistar白化大鼠。在无菌条件下对啮齿动物进行麻醉，通过开放性截骨术在股骨干中段三分之一处制造完全的横行骨折。骨折复位后，采用髓内克氏针进行内固定，允许发生继发性骨折愈合。术后给予腹腔注射镇痛药和抗生素，持续5天。通过连续每周的X光片评估骨痂形成情况。根据放射学预先确定的时间点处死大鼠，并通过放射学和免疫组织化学方法分析骨折骨痂的发育情况。
引言
骨是一种致密的结缔组织，由成骨细胞（osteoblasts）和破骨细胞（osteoclasts）组成。骨折愈合是一个生理过程，通过成骨细胞与破骨细胞的协同作用实现骨缺损的再生1。当发生骨折时，骨折部位的成骨和破骨活动是决定骨愈合的重要因素之一2。当骨折愈合偏离正常过程时，会导致延迟愈合、畸形愈合或骨不连。若骨折在9个月内未实现骨性连接，并且在最近3个月内无任何修复进展，则定义为骨不连3。大约10%–15%的骨折会出现修复延迟，可能最终发展为骨不连4。所有骨折中骨不连的发生率为5%–10%，具体比例因受累骨及骨折部位的不同而有所差异5。
治疗骨折不愈合的现行方案包括外科和/或药物治疗手段。目前，可通过骨移植等外科策略来解决骨折延迟愈合或不愈合的问题。然而，骨移植存在若干局限性和并发症，例如移植物组织的可获得性、供区疼痛、病患率及感染风险。6医学治疗包括骨形成促进类药物，如骨形态发生蛋白（BMP）和特立帕肽（甲状旁腺激素类似物）。目前使用的骨形成促进剂虽具有增强骨折修复的潜力，但存在价格昂贵或不良反应等局限性。7因此，寻找经济有效的非手术骨愈合替代方....
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方案
动物实验在获得印度新德里全印度医学科学研究所机构动物伦理委员会（IAEC）的伦理批准后进行（批准编号：286/IAEC-1/2021）。
1. 术前操作
- 将6至8周龄、体重在150-200 g之间的雄性Wistar白化大鼠饲养于中央动物实验设施（CAF）的单独笼具中。此举可避免多只大鼠共用笼具时对手术/骨折部位造成损伤。
- 将大鼠饲养在温度为 23 °C ± 2 °C、相对湿度为 50% ± 5% 的环境控制条件下，保持 12 小时光照/12 小时黑暗的循环光照周期，并给予 随意摄取 食物（标准半合成饲料）和水的供应：颗粒状干饲料和水。标准半合成饲料的成分为：烤孟加拉鹰嘴豆粉（60%）、小麦粉（22%）、酪蛋白（4%）、脱脂奶粉（5%）、精炼油（4%）、含淀粉的盐混合物（4.8%）以及含淀粉的维生素-胆碱混合物（0.2%）。
- 手术前至少让大鼠适应环境48小时。
- 使用电子天平称量每只大鼠的体重，并记录重量。
- 术前15分钟，对大鼠进行腹腔注射头孢呋辛（100 mg/kg体重）、曲马多（25 mg/kg体重）以及氯胺酮（75 mg/kg体重）与赛拉嗪（10 mg/kg体重）的混合制剂。双眼涂抹眼用软膏，以预防干眼。
- 使用脱毛膏局部涂抹，去除右侧下肢从 flank 区域至膝关节的毛发。
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结果
本研究旨在建立一种Wistar白化大鼠的股骨截骨模型。该模型可用于评估骨愈合过程，以及有潜力的促骨形成药物在骨愈合中的成骨作用。实验过程中遵循标准外科手术预防措施和操作规程。手术时穿戴无菌手术衣、铺巾，并使用无菌外科器械（图1）。所有器械（Table 1）在手术前48小时进行灭菌处理。根据既定方案使用麻醉剂、镇痛剂和抗生素，以确保动物在整个实验过程中无痛且无感染。可在骨折愈合过程中，从每只大鼠尾静脉采集血液（0.5 mL），用于基线分析以及不同参数的连续时间序列比较随访。使用脱毛膏去除从侧腹部至膝关节区域的毛发（图2）。截骨手术操作耗时约10分钟（从首次切口至缝合完成）。严格遵守无菌操作后，感染率和死亡率均极低。局部麻醉（利多卡因）后做切口，牵开股外侧肌纤维暴露股骨干（图3）。使用手术刀片在骨表面制造凹痕（沟槽），以防止凿子滑脱。骨折时使用无菌硬质支撑物（大理石块）支撑骨骼，以确保产生整齐的断裂（
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讨论
本方法清晰地描述了在Wistar大鼠中建立骨折截骨模型所需的各项细节。该模型可用于评估一种有前景的促骨形成药物在骨折愈合中的成骨作用，同时有助于理解骨愈合过程的复杂机制。本方法的显著优点在于操作简便，无需耗费过多时间或使用复杂的设备。在本方法中，选用成年雄性Wistar大鼠作为实验用啮齿类动物模型。选择单一性别是为了消除性激素对骨愈合可能带来的混杂因素影响。
本研究采用开放性截骨术的操作流程，该流程与其他研究团队以及其它小型动物模型所采用的方法相似11,18,19。与其它骨愈合模型相比，本方法所采用的开放性截骨术的优势在于，所造成的损伤（完全皮质骨骨折）更接近常规长骨骨折，且骨折愈合过程也类似于普通骨折，即通过骨痂形成实现间接骨愈合（软骨内成骨），而钻孔骨损伤模型则表现为直接骨愈合（膜内成骨）20。开放性截骨术方法也优于闭合性截骨术或三点加压致伤法，.......
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披露
所有作者均无任何利益冲突或其他财务披露。
致谢
作者感谢印度政府 AYUSH 部下属的顺势疗法中央研究委员会（CCRH）提供的研究经费支持。作者对新德里全印度医学科学研究所（AIIMS）中央动物实验中心在动物实验方面提供的帮助与支持，以及对 AIIMS CMET 在摄影与视频拍摄方面提供的帮助与支持，表示衷心感谢。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 酒精 | Raman & Weil Pvt. Ltd, 孟买, 马哈拉施特拉邦, 印度 | MFG/MD/2019/000189 | Sterillium 手部消毒剂 |
| 血管钳 | Nebula surgical, 古吉拉特邦, 印度 | G.105.05S | 5", 直型 |
| Bard-Parker 手柄 | Nebula surgical, 古吉拉特邦, 印度 | G.103.03 | 3号尺寸 |
| 碘伏溶液 | Win-medicare 新德里, 印度 | UP14250000001 | 10% w/v 聚维酮碘溶液 |
| 猫爪皮肤牵开器 | Nebula surgical, 古吉拉特邦, 印度 | 908.S | 小型 |
| EDTA | Sisco research laboratories Pvt. Ltd, 马哈拉施特拉邦, 印度 | 43272 | 二钠盐 |
| 伊红 | Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, 孟买, 马哈拉施特拉邦, 印度 | 115935 | 用于配制染色液 |
| 无齿镊 | Nebula surgical, 古吉拉特邦, 印度 | 115.06 | 6", 无齿 |
| 有齿镊 | Nebula surgical, 古吉拉特邦, 印度 | 117.06 | 6", 有齿 |
| 甲醛 | Sisco research laboratories Pvt. Ltd, 马哈拉施特拉邦, 印度 | 84439 | 用于配制中性缓冲福尔马林 |
| 苏木精 | Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, 孟买, 马哈拉施特拉邦, 印度 | 104302 | 用于配制染色液 |
| 锤子 | Nebula surgical, 古吉拉特邦, 印度 | 401.M | |
| 注射用头孢呋辛 | Akumentis Healthcare Ltd, 塔那, 马哈拉施特拉邦, 印度 | 48/UA/SC/P-2013 | 注射用头孢呋辛钠 IP, 1.5 g/瓶 |
| 注射用氯胺酮 | Baxter Pharmaceuticals India Private Limited, 古吉拉特邦, 印度 | G/28-B/6 | 盐酸氯胺酮 IP, 50 mg/mL |
| 注射用赛拉嗪 | Indian Immunologicals Limited, 海得拉巴, 特伦甘纳邦, 印度 | 28/RR/AP/2009/F/G | 盐酸赛拉嗪 USP, 20 mg/mL |
| 注射用利多卡因 | Jackson laboratories Pvt Limited, 旁遮普邦, 印度 | 1308-B | 2% 盐酸利多卡因 IP, 21.3 mg/mL |
| 注射用曲马多 | Intas Pharmaceuticals Limited, 艾哈迈达巴德, 古吉拉特邦, 印度 | MB/07/500 | 盐酸曲马多 IP, 50 mg/mL |
| K型钢针 | Nebula surgical, 古吉拉特邦, 印度 | 166 (1mm) | 12", 双头 |
| 用于插入K型钢针的机械钻 | Bosch, 德国 | 06019F70K4 | GSR 120-LI Professional |
| 梅克剪刀（Metzenbaum剪刀） | Nebula surgical, 古吉拉特邦, 印度 | G.121.06S | 6", 直型 |
| 持针器 | Nebula surgical, 古吉拉特邦, 印度 | G.108.06 | 6", 直型 |
| 眼科软膏 | GlaxoSmithKline Pharmaceutical Limited, 班加罗尔, 卡纳塔克邦, 印度 | KTK/28a/467/2001 | 新霉素、硫酸多粘菌素B和杆菌肽锌眼科软膏 USP |
| 骨凿（凿子） | Nebula surgical, 古吉拉特邦, 印度 | 1001.S.10 | 10 mm, 直型 |
| 骨膜剥离器 | Nebula surgical, 古吉拉特邦, 印度 | 918.10.S | 10 mm, 直型 |
| 钳子兼钢丝剪 | Nebula surgical, 古吉拉特邦, 印度 | 604.65 | |
| 雷诺兹剪刀（Reynold’s scissors） | Nebula surgical, 古吉拉特邦, 印度 | G.110.06S | 6", 直型 |
| 标准半合成饲料 | Ashirvad Industries, 昌迪加尔, 印度 | 无目录编号 | 材料使用中提供详细成分 |
| 用于盛放碘伏的不锈钢杯 | 本地采购 | 无目录编号 | |
| 带盖不锈钢托盘（用于器械高压灭菌） | 本地采购 | 无目录编号 | |
| 无菌纱布 | Ideal Healthcare Industries, 德里, 印度 | E(0047)/14/MNB/7951 | 无菌, 5cm×5cm, 12层 |
| 用于支撑的无菌大理石块 | 本地采购 | 无目录编号 | 本地制作；可高压灭菌 |
| 注射器及针头（1 mL） | Becton Dickinson India Pvt. Ltd., 哈里亚纳邦, 印度 | REF 303060 | 1 mL 无菌注射器，配 26 G × 1/2 (0.45 mm × 13 mm) 针头 |
| 注射器及针头（2 mL） | Becton Dickinson India Pvt. Ltd., 哈里亚纳邦, 印度 | REF 307749 | 2 mL 无菌注射器，配 24 G × 1'' (0.55 mm × 25 mm) 针头 |
| 注射器及针头（10 mL） | Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd. 法里达巴德, 印度 | 334-B(H) | 10 mL 无菌注射器，配 21 G ×1.5" (0.80 mm × 38 mm) 针头 |
| 手术刀片（15号） | Paramount Surgimed Ltd, 新德里, 印度，为 Medline Industries Inc, IL, 美国代工 | REF MDS15115E | 无菌，一次性使用 |
| 手术刀片（24号） | Paramount Surgimed Ltd, 新德里, 印度，为 Medline Industries Inc, IL, 美国代工 | REF MDS15124E | 无菌，一次性使用 |
| 缝合线 | Healthium Medtech Pvt Ltd, 班加罗尔, 卡纳塔克邦, 印度 | SN 3318 | 4-0, 16 mm, 3/8 圆弧切割针, 单丝聚酰胺缝合线 |
| 置于铝制托盘中的石蜡块 | 本地制作 | 无目录编号 | 30 cm × 30 cm × 4 cm 铝制托盘，内含石蜡（防止动物滑动） |
| X射线机 | Philips India Ltd, 古鲁格拉姆, 哈里亚纳邦 | SN19861013 | 型号：Philips Digital Diagnost R 4.2 |
参考文献
- Wang, T., Zhang, X., Bikle, D. D. Osteogenic differentiation of periosteal cells during fracture healing. Journal of Cellular Physiology. 232 (5), 913-921 (2017).
- Fakhry, M., Hamade, E., Badran, B., Buchet, R., Magne, D. Molecular me....
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