根据我们在临床工作中发现的家族性遗传性心肌病家系，我们利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，构建了在小鼠MYH7基因位点携带点突变（G823E）的C57BL/6N小鼠模型，以验证该突变的作用。
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方法文章
利用小鼠模型研究家族性肥厚型心肌病中MYH7基因Gly823Glu突变的发病机制
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
家族性肥厚型心肌病（HCM，OMIM：613690）是中国最常见的心肌病，但其潜在的遗传病因仍不明确。
我们先前在一个患有肥厚型心肌病（HCM）的中国汉族大家系中鉴定出肌球蛋白重链7（MYH7）基因的一个杂合变异，NM_000257.4: c.G2468A (p.G823E)。在此家系中，G823E变异与常染色体显性遗传病共分离。该变异位于MYH7蛋白颈部区域的杠杆臂结构域，且在同源肌球蛋白及不同物种间高度保守。为验证G823E变异的致病性，我们利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术构建了在小鼠MYH7基因位点携带点突变（G823E）的C57BL/6N小鼠模型。我们设计了靶向gRNA载体和供体寡核苷酸（靶序列两侧各含134 bp同源序列）。通过同源定向修复，将供体寡核苷酸中的p.G823E（GGG变为GAG）位点引入MYH7基因的第23号外显子。同时，还插入了一个沉默的p.R819突变（AGG变为CGA），以防止gRNA结合及同源定向修复后对序列的再次切割。超声心动图显示，在2月龄时，MYH7 G823E/-小鼠出现左心室后壁（LVPW）收缩期增厚。这些结果也通过组织学分析得到了验证（图3）。
这些结果表明，G823E 变异在肥厚型心肌病（HCM）的发病机制中起着重要作用。我们的发现扩展了与家族性 HCM 相关的 MYH7 变异谱，可能为该中国家庭的遗传咨询和产前诊断提供指导。
引言
肥厚型心肌病（HCM，OMIM：613690）是中国最常见的心肌病，估计发病率为0.2%，影响约15万人1,2。
HCM 的病理解剖学特征为非对称性心室肥厚，常累及心室流出道和/或室间隔3。临床表现为劳力性呼吸困难、乏力和胸痛。HCM 的个体表型差异较大，可从临床隐匿性表现到严重心力衰竭不等。HCM 患者需要接受药物治疗、心脏移植、生命支持设备以及多学科的随访管理4。
在过去的一个世纪中，PCR 技术改变了我们研究 DNA 的方式5。Sanger 及其同事发现了一种用于临床诊断的 DNA 测序方法6。Sanger 技术随后被应用于人类基因组计划，但这种方法成本高昂且耗时7。全基因组测序（WGS）的出现将人类遗传病研究提升到了新的高度，但其成本仍然令人望而却步。全外显子组测序（WES）技术长期以来一直被用于检测种系变异8，并在多种癌症的外显子组中成功鉴定了体细胞驱动突变9。通过....
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方案
通过采访家庭成员获取了这些家族的病史。本研究已获得广东省中医院伦理委员会（编号：2019074）的批准。所有家庭成员均签署了知情同意书。所有动物实验均遵循广东省中医院（中国广州）的伦理指导原则进行处理。
1. 研究对象
注意：先证者 III-3 于 2019 年 7 月在中国广东省中医院心血管外科就诊。
- 获取先证者的详细家族病史。通知并召集先证者的所有家庭成员。所有家庭成员均已接受细致的体格检查。
- 系统回顾所有临床资料，包括病历记录、心电图、超声心动图和心脏导管检查报告。
- 在干预或手术过程中，重新确认所有患者的 cardiac 表型。
- 从本地数据库中选取共计 174 例基于人群的健康对照个体。从每位患者采集约 4.0 mL 外周静脉血。
2. DNA 提取
注意：按照生产商说明书，使用商业血液试剂盒提取 DNA。
- 按照制造商的说明，使用阴离子去污剂并在DNA稳定剂存在下裂解血细胞。
- 向细胞裂解液中加入10 µL RNase A溶液，通过倒置离心管25次进行混匀。在37 °....
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结果
家族的临床特征
获得并展示了肥厚型心肌病（HCM）的家族系谱图（见图2）。所有记录在案的家庭成员在入组时均被诊断为HCM。
在该家系中（图2A），先证者为III-7号患者，该患者在46岁时被诊断为肥厚型心肌病（HCM）并伴有左心室流出道梗阻（LVOTO），并接受了心脏手术治疗。III-3号患者患有轻度HCM，无需手术治疗。IV-3号患者也表现为轻度HCM，与其父亲III-3号患者相似。II-5号患者患有HCM，因LVOTO于51岁时接受手术矫正。I-1号患者和II-2号患者分别于57岁和46岁时因心脏意外事件死亡。I-1号患者的病史资料不可获得。II-7号患者和III-9号患者表现为呼吸困难，经诊断患有HCM。
外显子序列分析与变异的分离
在该家系中，对五名个体进行外显子测序，共获得平均 19,978,731 对测序读段，平均读长为 125 bp。总计有 98.72% 的测序读段通过质量评估，.......
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讨论
本研究描述了一个患有肥厚型心肌病（HCM）的中国汉族家系。遗传学分析显示，MYH6基因的杂合突变p.G823E与该家系中常染色体显性遗传的疾病共分离。为了验证G823E突变的致病性并探讨其潜在机制，我们利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，在C57BL/6N小鼠的Myh7基因位点引入G823E突变，构建了相应的转基因小鼠模型。
通过超声心动图评估了C57BL/6N-Myh7em1(G823E)基因敲入小鼠的表型特征。与对照组相比，C57BL/6N-Myh7em1(G823E)基因敲入小鼠表现出心肌小梁增多，以及非致密化心肌层与致密化心肌层的比值升高。转基因小鼠还表现出左心室后壁（LVPW）和室间隔（IVS）肥厚，以及心率（HR）增加。然而，两组之间心脏功能未见显著差异。这些结果提示，在心脏重构过程中，心率升高可能对维持心室功能具有代偿作用。仍需进一步研究以观察和分析心脏的形态与功能变化。
肌球蛋白-7（MYH7）属于心肌肌节结构蛋白家族。MYH7 由 MYH7 基因（14q11........
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披露
作者声明无任何经济利益冲突。
致谢
本工作由广东省医学科研基金项目（A2022363）和中国广东省科学技术委员会重大项目（资助号：2022）资助。
我们感谢马里兰大学帕克分校的 Qingjian Chen 在本文手稿准备过程中提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.5×TBE | 上海桑戈 | ||
| 2× Taq Master Mix (Dye Plus) | 南京诺唯赞生物科技股份有限公司 | ||
| 琼脂糖 | 瑞固 | ||
| 小动物麻醉机 | 瑞沃德生命科技有限公司 | R500 | |
| BEDTools | 2.16.1 | ||
| Cas9体外消化法检测gRNA靶点效率试剂盒 | 微构生物科技有限公司 | VK007 | |
| DNA Marker | 赛默飞世尔科技 | ||
| DNA稳定剂 | 上海源叶生物科技有限公司 | DNAstable LD | 防止DNA降解 |
| 电动石蜡切片机 | 沈阳恒晟科技有限公司 | HS-S7220-B | |
| GATK | v3.5 | ||
| Gentra Puregene 血液试剂盒 | 圣克拉拉 | ||
| 载玻片、盖玻片 | 江苏英拓生物科技有限公司 | ||
| 苏木精染色液、伊红染色液 | 上海碧云天生物技术有限公司 | C0107-500ml, C0109 | |
| HiSeq X-ten 测序平台 | Illumina | 对捕获文库进行测序 | |
| 绒毛膜促性腺激素注射液 | 丽珠医药集团股份有限公司 | ||
| 孕马血清促性腺激素注射液 | 丽珠医药集团股份有限公司 | ||
| 异氟烷 | 本地供应商 | 吸入麻醉 | |
| 显微注射显微镜 | 尼康 | ECLIPSE Ts2 | |
| NanoDrop | 赛默飞世尔科技 | 2000 | |
| 石蜡包埋机 | 沈阳恒晟科技有限公司 | HS-B7126-B | |
| Picard | (2.2.4) 20 | ||
| 蛋白酶K | 默克股份有限公司 | ||
| samtools | 1.3 | ||
| 测序仪 | 应用生物系统公司 | ABI 3500 | |
| 体视显微镜 | 尼康 | SMZ745T | |
| SureSelect Human All Exon V6 | 安捷伦科技有限公司 | 外显子探针 | |
| T7 ARCA mRNA 试剂盒 | 新英格兰生物实验室股份有限公司 | NEB-E2065S | |
| 恒温箱 | BINDER GmbH | KBF-S Solid.Line | |
| Trizma 盐酸溶液 | 西格玛，默克股份有限公司 | 货号 T2663 | |
| 兽用超声系统 | 飞利浦医疗 | CX50 |
参考文献
- Toepfer, C. N., et al. Myosin sequestration regulates sarcomere function, cardiomyocyte energetics, and metabolism, informing the pathogenesis of hypertrophic cardiomyopathy. Circulation. 141 (10), 828-842 (2020).
- Writing Committee Members et al.
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重印与许可
