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方法文章

利用小鼠模型研究家族性肥厚型心肌病中MYH7基因Gly823Glu突变的发病机制

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DOI：

10.3791/63949

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2022年8月8日

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1Department of Cardiovascular Surgery, Guangdong Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, the Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, 2The Second Clinical College of Guangzhou University of Chinese Medicine, 3Department of Cardiovascular Surgery, The First Affiliated Hospital, Jinan University, 4Guangdong Provincial Key Laboratory of Laboratory Animals, Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute, 5Department of Anesthesiology, Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine, the Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

根据我们在临床工作中发现的家族性遗传性心肌病家系，我们利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，构建了在小鼠MYH7基因位点携带点突变（G823E）的C57BL/6N小鼠模型，以验证该突变的作用。

摘要

家族性肥厚型心肌病（HCM，OMIM：613690）是中国最常见的心肌病，但其潜在的遗传病因仍不明确。

我们先前在一个患有肥厚型心肌病（HCM）的中国汉族大家系中鉴定出肌球蛋白重链7（MYH7）基因的一个杂合变异，NM_000257.4: c.G2468A (p.G823E)。在此家系中，G823E变异与常染色体显性遗传病共分离。该变异位于MYH7蛋白颈部区域的杠杆臂结构域，且在同源肌球蛋白及不同物种间高度保守。为验证G823E变异的致病性，我们利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术构建了在小鼠MYH7基因位点携带点突变（G823E）的C57BL/6N小鼠模型。我们设计了靶向gRNA载体和供体寡核苷酸（靶序列两侧各含134 bp同源序列）。通过同源定向修复，将供体寡核苷酸中的p.G823E（GGG变为GAG）位点引入MYH7基因的第23号外显子。同时，还插入了一个沉默的p.R819突变（AGG变为CGA），以防止gRNA结合及同源定向修复后对序列的再次切割。超声心动图显示，在2月龄时，MYH7 G823E/-小鼠出现左心室后壁（LVPW）收缩期增厚。这些结果也通过组织学分析得到了验证（图3）。

这些结果表明，G823E 变异在肥厚型心肌病（HCM）的发病机制中起着重要作用。我们的发现扩展了与家族性 HCM 相关的 MYH7 变异谱，可能为该中国家庭的遗传咨询和产前诊断提供指导。

引言

肥厚型心肌病（HCM，OMIM：613690）是中国最常见的心肌病，估计发病率为0.2%，影响约15万人1,2。

HCM 的病理解剖学特征为非对称性心室肥厚，常累及心室流出道和/或室间隔3。临床表现为劳力性呼吸困难、乏力和胸痛。HCM 的个体表型差异较大，可从临床隐匿性表现到严重心力衰竭不等。HCM 患者需要接受药物治疗、心脏移植、生命支持设备以及多学科的随访管理4。

在过去的一个世纪中，PCR 技术改变了我们研究 DNA 的方式5。Sanger 及其同事发现了一种用于临床诊断的 DNA 测序方法6。Sanger 技术随后被应用于人类基因组计划，但这种方法成本高昂且耗时7。全基因组测序（WGS）的出现将人类遗传病研究提升到了新的高度，但其成本仍然令人望而却步。全外显子组测序（WES）技术长期以来一直被用于检测种系变异8，并在多种癌症的外显子组中成功鉴定了体细胞驱动突变9。通过 WES 对 DNA 外显子或编码区的检测，可用于揭示大多数孟德尔遗传病中的致病性变异。如今，随着测序成本的不断降低，WGS 预计将成为基因组学研究的重要工具，并可广泛应用于基因组中致病性变异的检测。

全外显子组测序（WES）技术已用于遗传性心肌病，以鉴定致病性变异，进一步阐明其病因。越来越多的证据表明，编码肌小节结构蛋白的基因突变，如 MYH710、MYH611、MYBPC312、MYL213、MYL314、TNNT215、TNNI316、TNNC117 和 TPM118，是肥厚型心肌病（HCM）遗传病因的基础。此外，一些罕见致病基因中的致病性变异，如隐蛋白、细胞骨架钙调蛋白及肌联蛋白相互作用的 RhoGEF（OBSCN, OMIM: 608616）19、α-辅肌动蛋白 2（ACTN2, OMIM: 102573）20 和富含半胱氨酸与甘氨酸的蛋白 3（CSRP3, OMIM: 600824）21，也与 HCM 相关。目前的遗传学研究发现，在约 40%–60% 的 HCM 患者中存在多种不同的肌小节蛋白基因致病性变异，HCM 患者的基因检测显示，大多数致病性变异发生在肌球蛋白重链（MYH7）和肌球蛋白结合蛋白 C（MYBPC3）中。然而，HCM 的遗传基础仍不明确。探索这些变异在人类 HCM 患者中的致病机制仍是一项重大挑战22。

本研究中，我们通过全外显子组测序（WES）在汉族肥厚型心肌病（HCM）家系中发现了一个MYH7基因的致病性变异。为验证该变异的致病性，我们利用CRISPR/Cas9系统建立了C57BL/6N-Myh7em1(G823E)基因敲入小鼠模型。同时，我们还探讨了该变异可能的作用机制。

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方案

通过采访家庭成员获取了这些家族的病史。本研究已获得广东省中医院伦理委员会（编号：2019074）的批准。所有家庭成员均签署了知情同意书。所有动物实验均遵循广东省中医院（中国广州）的伦理指导原则进行处理。

1. 研究对象

注意：先证者 III-3 于 2019 年 7 月在中国广东省中医院心血管外科就诊。

  1. 获取先证者的详细家族病史。通知并召集先证者的所有家庭成员。所有家庭成员均已接受细致的体格检查。
    1. 系统回顾所有临床资料，包括病历记录、心电图、超声心动图和心脏导管检查报告。
    2. 在干预或手术过程中，重新确认所有患者的 cardiac 表型。
  2. 从本地数据库中选取共计 174 例基于人群的健康对照个体。从每位患者采集约 4.0 mL 外周静脉血。

2. DNA 提取

注意：按照生产商说明书，使用商业血液试剂盒提取 DNA。

  1. 按照制造商的说明，使用阴离子去污剂并在DNA稳定剂存在下裂解血细胞。
  2. 向细胞裂解液中加入10 µL RNase A溶液，通过倒置离心管25次进行混匀。在37 °C下孵育15分钟至1小时。
  3. 通过盐析法去除蛋白质。使用蛋白沉淀溶液（将0.25 mg牛血清白蛋白溶解于25 mL蒸馏水中）和100%异丙醇沉淀蛋白质。然后加入200 µL 70%乙醇，在4 °C下以12,000 x g/min离心15分钟，以洗涤DNA沉淀。
  4. 用500 µL 70%乙醇沉淀回收基因组DNA。在12,000 x g下离心30秒，吸除上清后将沉淀溶解于水合溶液（1 mM EDTA，10 mM Tris·Cl，pH 7.5）中。
  5. 使用分光光度计（例如NanoDrop 2000）测定纯度。纯化的DNA通常A260/A280比值在1.7至1.9之间，大小可达200 kb。
  6. 将DNA长期储存于2-8 °C、-20 °C或-80 °C。

3. 全外显子组测序与变异分析

注意：为了系统性地搜寻致病基因突变，对患病个体（II-5、II-7、III-3、III-7、III-8、III-9 和 IV-3）以及未患病个体（III-2、III-5、IV-4）进行了外显子组测序。

  1. 按照制造商说明书使用外显子探针进行外显子捕获。
  2. 将合格的文库应用于HiSeq X-ten平台进行2 × 150 bp双端测序。详见补充文件1。
  3. 使用BWA v0.7.1318,19将FASTQ文件比对至人类参考基因组（hg19/GRCh37）。使用samtools对已比对文件（sam/bam格式）进行排序，然后使用Picard标记重复序列。详见补充文件1。
  4. 使用GATK对读段进行局部重比对并重新校准碱基质量。详见补充文件1。
  5. 利用BEDTools及内部开发的perl/python脚本，从重新校准后的文件中生成包括覆盖度和测序深度在内的比对统计信息。
  6. 使用GATK中的HaplotypeCaller工具的多样本处理模式，从重新校准的BAM文件中进行变异位点（SNVs和indels）的基因型鉴定。
  7. 使用VQSR（变异质量评分重校准）方法降低变异检测中的假阳性率。
  8. 使用ANNOVAR软件21对SNVs和indels进行注释，参考多个数据库，包括外显子聚合联盟（ExAC）（http://exac.broadinstitute.org）、外显子测序计划（ESP）（https://esp.gs.washington.edu）和1,000基因组计划（http://www.1000genomes.org）。依据ACMG指南解读序列变异的致病性。

4. Sanger 测序

  1. 使用 ABI 3500 测序仪进行 Sanger 测序，以确认潜在的致病变异，并分析该变异在家族中的分离情况23。
  2. 针对 MYH7 基因（NM_000257）中的变异设计引物序列如下：5'-TTCAAACACAGAGACCTGCAGG-3' 和 5'-CGGACTTCTCTAGCGCCTCTT-3'。
  3. 确认变异后，对所有可获得的家族成员进行筛查，以确定该变异在家族中的分离模式23。

5. 构建C57BL/6N-MYH7em1(G823E)基因敲入小鼠

  1. 使用 CRISPR/Cas9 系统构建 C57BL/6N-Myh7em1(G823E) 基因敲入小鼠。小鼠 Myh7 基因（GenBank登录号：NM_001361607.1；Ensembl：ENSMUSG00000053093）位于小鼠14号染色体上，包含41个外显子。ATG起始密码子位于第4外显子，TAG终止密码子位于第41外显子，G823E突变位于第23外显子。选择第23外显子作为靶向位点。
  2. 设计靶向载体的gRNA序列和供体寡核苷酸（包含靶向序列，两侧各带有134 bp同源序列）。
    1. 登录 NCBI 网站并点击 在线BLAST引物设计 功能在右侧。
    2. 点击 引物-BLAST 在页面底部使用功能设计引物。
    3. 将 MYH7 基因的 NCBI 参考序列编号 NM_000257.4 粘贴至 PCR 模板输入框中。
    4. 扩增目标片段（MYH7 cDNA 第23外显子及其相邻外显子），因此在第21外显子（2392-2528）上设计上游引物，在第25外显子（3205-3350）上设计下游引物。将上游和下游引物所在的外显子编号填入相应的范围框中。
    5. 点击 获取引物 在底部点击按钮，以自动生成多对引物。
  3. 在ZFIN数据库中输入MYH7基因，在供体寡核苷酸中引入p.g823e（GGG至GAG）突变位点以及外显子23中的同义突变p.r819（AGG至CGA）。该同义突变可防止同源定向修复后gRNA对序列的再次结合与切割。
    1. 根据通用序列设计gRNA，两端序列分别为TAATACGACTCACTATA-和-GTTTTAGAGCTA，中间为上述靶位点序列。
  4. 共注射 Cas9 mRNA 和通过体外转录生成的 gRNA 体外 转录和供体寡核苷酸导入受精卵以制备基因敲入小鼠。
    1. 使用 Cas9/gRNA 靶点效率检测试剂盒将设计的 gRNA 靶序列转录为 gRNA 体外 并根据制造商的说明书检测转录本的活性（详见VK007试剂盒说明书中的具体检测方法）。
    2. 解冻T7 ARCA mRNA试剂盒组分，混匀后在微型离心机中瞬时离心，使溶液沉至管底。在室温下按以下顺序配制反应体系：加入10 µL的2× ARCA/NTP混合液，1 µg模板DNA，2 µL T7 RNA聚合酶混合液，最后用无核酸酶水补足至20 µL。
    3. 充分混匀后，在微型离心机中瞬时离心。37 °C 下孵育 30 分钟。
    4. 加入 2 µL DNase I 以去除模板 DNA，充分混匀后于 37 °C 孵育 15 分钟，获得 mRNA。
    5. 使用0.5 mL注射器，对约4周龄的预处理C57BL/6雌性小鼠进行腹腔注射，每只注射剂量约为5 U的血清促性腺激素和人绒毛膜促性腺激素，两次注射间隔48 h。
    6. 激素注射后18小时，通过颈椎脱位法处死C57BL/6雌性小鼠和一只8-12周龄的C57BL/6雄性小鼠。分别收集卵子和精子。
    7. 精子在获能液中获能。将精子吸取并滴加至短寿命卵细胞液滴边缘进行 体外 受精3-4小时。
    8. 稀释成功转录的gRNA和Cas9 mRNA 体外 用无RN酶水稀释至25 ng/µL和50 ng/µL。通过显微注射导入小鼠受精卵的细胞质中。将状态良好的受精卵移植到雌鼠扩张的输卵管中。与结扎雄鼠合笼饲养。
  5. 通过PCR对仔鼠进行基因型鉴定。采用以下PCR条件：94 °C预变性3 min，随后进行35个循环：94 °C变性30 s，60 °C退火35 s，72 °C延伸35 s，最后72 °C终延伸5 min。随后进行测序分析。
    1. 用剪刀剪取4月龄小鼠的尾尖，放入1.5 mL EP管中。每份尾组织（2–5 mm）加入180 µL Buffer GL、20 µL Proteinase K和10 µL RNase A至微量离心管中。注意不要剪取过多尾组织。
    2. 将试管在56 °C下孵育过夜。
    3. 在微量离心管中以1,000 x g离心 g 2分钟以去除杂质。
    4. 加入200 µL Buffer GB和200 µL无水乙醇，充分混匀。
    5. 将离心柱放入收集管中。加入样品至离心柱内，于1,000 x g条件下离心 g 2 分钟。弃去滤液。
    6. 向离心柱中加入 500 µL Buffer WA，于 1,000 x g 条件下离心 g 1 分钟。弃去滤液。
    7. 向离心柱中加入 700 µL WB 缓冲液，于 1,000 x g 条件下离心 g 1 分钟。弃去滤液。
      注意：确保缓冲液 WB 已与 100% 乙醇预混。加入缓冲液 WB 时，应沿管壁加入，以冲洗残留的盐分。
    8. 重复步骤 5.5.7。
    9. 将离心柱放入收集管中，1,000 x g 离心 g 2 分钟。
    10. 将离心柱放入一个新的1.5 mL离心管中。向柱膜中心加入50–200 µL无菌水或洗脱缓冲液，静置5分钟。
      注意：将灭菌水或洗脱缓冲液加热至 65 °C 可提高洗脱产量。
    11. 为洗脱DNA，将离心柱在1,000 x g 2分钟。为提高DNA得率，可将流出液和/或50–200 µL无菌水或洗脱缓冲液加入离心柱膜中央，静置5分钟。然后以1,000 x g 2 分钟。
    12. 通过电泳定量洗脱的基因组DNA。

6. 心脏形态与功能的评估

注意：采用M型超声心动图评估C57BL/6N-Myh7em1(G823E)基因敲入小鼠的心脏形态与功能。

  1. 将基因敲入小鼠放入与麻醉机相连的密闭亚克力箱中，调节三通接口使异氟烷（浓度：3%）流入亚克力箱内。待基因敲入小鼠自主运动停止后，将其取出。
  2. 将基因敲入小鼠平放在小动物麻醉机的生命体征监测平台上，持续吸入由氧气（流速：0.8 L/min）和异氟烷（浓度：3%）混合的麻醉气体。对麻醉后的小鼠眼部涂抹眼用润滑剂，以防止角膜干燥。
  3. 将基因敲入小鼠水平固定于平台上，使平台向小鼠尾侧倾斜30°。使用脱毛膏去除小鼠前胸壁的毛发。
  4. 将探头垂直放置，凸起部分朝向动物头部方向，然后将探头逆时针旋转约45°。
  5. 在胸骨旁长轴切面下，将探头顺时针旋转90°以观察胸骨旁短轴切面。探头旋转90°后，调整Y轴位移以获得正确的切面。
  6. 观察心脏的长轴图像（图1C），然后选择M型测量数据。
  7. 从小鼠胸骨旁长轴切面获取超声数据（图1）。测量指标包括心率（HR）、左心室射血分数（LVEF）、心输出量（CO）、左心室舒张末期内径（LVDd）、左心室收缩末期内径（LVSd）、室间隔厚度（IVS）以及左心室后壁厚度（LVPW）。
  8. 测量结束后，给予小鼠氧气，并在其恢复自主活动后放回各自笼中。

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结果

家族的临床特征
获得并展示了肥厚型心肌病（HCM）的家族系谱图（见图2）。所有记录在案的家庭成员在入组时均被诊断为HCM。

在该家系中（图2A），先证者为III-7号患者，该患者在46岁时被诊断为肥厚型心肌病（HCM）并伴有左心室流出道梗阻（LVOTO），并接受了心脏手术治疗。III-3号患者患有轻度HCM，无需手术治疗。IV-3号患者也表现为轻度HCM，与其父亲III-3号患者相似。II-5号患者患有HCM，因LVOTO于51岁时接受手术矫正。I-1号患者和II-2号患者分别于57岁和46岁时因心脏意外事件死亡。I-1号患者的病史资料不可获得。II-7号患者和III-9号患者表现为呼吸困难，经诊断患有HCM。

外显子序列分析与变异的分离
在该家系中，对五名个体进行外显子测序，共获得平均 19,978,731 对测序读段，平均读长为 125 bp。总计有 98.72% 的测序读段通过质量评估，...

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讨论

本研究描述了一个患有肥厚型心肌病（HCM）的中国汉族家系。遗传学分析显示，MYH6基因的杂合突变p.G823E与该家系中常染色体显性遗传的疾病共分离。为了验证G823E突变的致病性并探讨其潜在机制，我们利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，在C57BL/6N小鼠的Myh7基因位点引入G823E突变，构建了相应的转基因小鼠模型。

通过超声心动图评估了C57BL/6N-Myh7em1(G823E)基因敲入小鼠的表型特征。与对照组相比，C57BL/6N-Myh7em1(G823E)基因敲入小鼠表现出心肌小梁增多，以及非致密化心肌层与致密化心肌层的比值升高。转基因小鼠还表现出左心室后壁（LVPW）和室间隔（IVS）肥厚，以及心率（HR）增加。然而，两组之间心脏功能未见显著差异。这些结果提示，在心脏重构过程中，心率升高可能对维持心室功能具有代偿作用。仍需进一步研究以观察和分析心脏的形态与功能变化。

肌球蛋白-7（MYH7）属于心肌肌节结构蛋白家族。MYH7 由 MYH7 基因（14q11....

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披露

作者声明无任何经济利益冲突。

致谢

本工作由广东省医学科研基金项目（A2022363）和中国广东省科学技术委员会重大项目（资助号：2022）资助。

我们感谢马里兰大学帕克分校的 Qingjian Chen 在本文手稿准备过程中提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.5×TBE上海桑戈
2× Taq Master Mix (Dye Plus)南京诺唯赞生物科技股份有限公司
琼脂糖瑞固
小动物麻醉机瑞沃德生命科技有限公司R500
BEDTools2.16.1
Cas9体外消化法检测gRNA靶点效率试剂盒微构生物科技有限公司VK007
DNA Marker赛默飞世尔科技
DNA稳定剂上海源叶生物科技有限公司DNAstable LD防止DNA降解
电动石蜡切片机沈阳恒晟科技有限公司HS-S7220-B
GATKv3.5
Gentra Puregene 血液试剂盒圣克拉拉
载玻片、盖玻片江苏英拓生物科技有限公司
苏木精染色液、伊红染色液上海碧云天生物技术有限公司C0107-500ml, C0109
HiSeq X-ten 测序平台Illumina对捕获文库进行测序
绒毛膜促性腺激素注射液丽珠医药集团股份有限公司
孕马血清促性腺激素注射液丽珠医药集团股份有限公司
异氟烷本地供应商吸入麻醉
显微注射显微镜尼康ECLIPSE Ts2
NanoDrop赛默飞世尔科技2000
石蜡包埋机沈阳恒晟科技有限公司HS-B7126-B
Picard(2.2.4) 20
蛋白酶K默克股份有限公司
samtools1.3
测序仪应用生物系统公司ABI 3500
体视显微镜尼康SMZ745T
SureSelect Human All Exon V6安捷伦科技有限公司外显子探针
T7 ARCA mRNA 试剂盒新英格兰生物实验室股份有限公司NEB-E2065S
恒温箱BINDER GmbHKBF-S Solid.Line
Trizma 盐酸溶液西格玛，默克股份有限公司货号 T2663
兽用超声系统飞利浦医疗CX50

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