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方法文章

石墨烯-羟基磷灰石纳米复合材料的合成及其在骨组织工程中的潜在应用

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DOI：

10.3791/63985

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2022年7月27日

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1Department of Physics, Faculty of Science, Kasetsart University, 2Department of Microbiology, School of Science, RK. University, 3Department of Chemical Engineering, Northeastern University, 4Defence Institute of Advanced Technology Campus, Navyukti Innovations Pvt. Ltd., 5Department of Biomedical Engineering, Hebei University of Technology, 6Department of Chemistry, Saveetha School of Engineering, Institute of Medical and Technical Science, Saveetha University, 7UFPI - Universidade Federal do Piauí

本文内容

摘要

采用溶液相合成法制备了石墨烯纳米带与羟基磷灰石纳米颗粒的新型纳米复合材料。这类杂化材料在生物活性支架中的应用，可在组织工程和骨再生领域展现出潜在应用价值。

摘要

开发用于骨组织工程的新型材料是纳米医学最重要的研究方向之一。已有多种纳米复合材料与羟基磷灰石结合制备而成，以促进细胞黏附、增殖和成骨作用。本研究成功开发了石墨烯纳米带（GNRs）与羟基磷灰石纳米颗粒（nHAPs）组成的杂化纳米复合材料，该材料若应用于生物活性支架，有望提升骨组织再生效果。这些纳米结构具有良好的生物相容性。本研究采用了两种方法来制备新型材料。第一种方法采用共功能化策略，同时合成nHAP并将其偶联至GNRs表面，形成nHAP负载于GNRs表面的纳米杂化物（记为nHAP/GNR）。高分辨率透射电子显微镜（HRTEM）证实，nHAP/GNR复合材料由细长且薄的GNRs结构（最大长度为1.8 µm）组成，其表面分布有离散的针状nHAP（长度为40–50 nm）区域（尺寸为150–250 nm）。另一种方法则将市售的nHAP与GNRs偶联，形成GNRs包覆的nHAP（记为GNR/nHAP），即其结构取向与nHAP/GNR纳米杂化物相反。采用后一种方法形成的纳米杂化物表现为直径在50 nm至70 nm之间的nHAP纳米球，其表面覆盖有GNRs构成的网络结构。能谱分析（EDS）、元素分布图以及傅里叶变换红外光谱（FTIR）均证实了两种纳米杂化物中nHAP与GNRs的成功整合。热重分析（TGA）表明，由于GNRs的存在，在高温加热条件下，GNR/nHAP和nHAP/GNR的重量损失分别为0.5%和0.98%。这两种具有相反取向的nHAP-GNR纳米杂化材料是极具潜力的生物活性支架候选材料，有望通过促进细胞功能来提升骨组织工程的应用效果。

引言

石墨烯是由sp杂化碳原子构成的片状二维结构。其他一些同素异形体也可归因于石墨烯的扩展蜂窝网络（例如，石墨烯片层的堆叠形成三维石墨，而将同一材料卷曲则形成一维纳米管1）。同样，零维富勒烯则是由于卷曲包裹而形成2。石墨烯具有优异的理化性质和光电特性，包括在室温下表现出双极性场效应和量子霍尔效应3,4。单分子吸附事件的检测能力以及极高的载流子迁移率进一步增强了石墨烯的吸引力5,6。此外，具有窄宽度、长平均自由程、低电阻率、高电流密度和高电子迁移率的石墨烯纳米带（GNRs）被认为是极具前景的互连材料7。因此，GNRs正在被探索用于多种器件中的应用，最近尤其在纳米医学领域，如组织工程和药物递送方面展现出潜力8。

在各种创伤性疾病中，骨损伤被认为是最具挑战性的疾病之一，其难点在于骨折的稳定、新骨的再生与替代、抗感染以及骨不连的重新对位9,10。股骨干骨折目前仍只能通过手术治疗。值得注意的是，仅在中美洲和欧洲，每年用于治疗骨损伤的费用近5200万美元11。

通过引入纳米羟基磷灰石（nHAP）可提高用于骨组织工程应用的生物活性支架的有效性，因为其结构可模拟骨组织本身的微观和纳米级结构特征12。羟基磷灰石（HAP）的化学式为Ca10(PO4)6(OH)2，钙磷摩尔比为1.67，在生物医学领域最受青睐，尤其适用于牙周缺损治疗、硬组织替代以及骨科手术中植入物的制备13,14。因此，以金纳米棒（GNRs）增强的nHAP基生物材料可能具有更优异的生物相容性，并因其促进骨整合和具备骨传导能力而具有应用优势15,16。此类杂化复合支架可保持细胞黏附、铺展、增殖和分化等生物学特性17。本文报道了两种新型纳米复合材料的制备方法，通过合理调控nHAP与GNRs的空间排列方式用于骨组织工程，如图1所示。本文对这两种不同nHAP-GNRs排列方式的化学和结构特性进行了评估。

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方案

1. 通过沉淀法合成纳米羟基磷灰石（nHAP）

  1. 使用50 mL反应混合物合成纯净的nHAP，该混合物包含1 M Ca(NO3)2∙4H2O和0.67 M (NH4)H2PO4，随后逐滴加入25% NH4OH，以维持pH值约为1018。
  2. 然后，通过超声辐照（UI）搅拌反应混合物30分钟（功率500 W，超声频率20 kHz）。
  3. 将所得溶液在室温下陈化120小时，直至nHAP白色沉淀析出。在室温下以1398 × g 离心5分钟，收集nHAP沉淀。
  4. 用去离子水（DI水）洗涤沉淀3次，并冷冻干燥48小时。将干燥粉末储存在4 °C条件下。

2. nHAP/GNR 纳米复合材料的制备

注意：以下描述了两种制备纳米羟基磷灰石/金纳米棒（nHAP/GNR，即nHAP负载于GNR表面）和金纳米棒/纳米羟基磷灰石（GNR/nHAP，即GNR包覆的nHAP）纳米复合材料的方法，代表了nHAP与GNR两种不同的空间排列方式（图1）。

  1. 合成 nHAP/GNR
    1. 为制备 nHAP/GNRs 纳米复合材料，采用共功能化策略，使 nHAP 的合成与 GNRs 的偶联同时进行，步骤如下。
    2. 将 5 mg 的 GNRs（材料表）溶解于 1 M 四水合硝酸钙 [Ca(NO3)2·4H2O] 与 0.67 M 磷酸氢二铵 [(NH4)2HPO4] 的混合溶液中，定容至 50 mL19。
    3. 反应过程中，逐滴加入 25% 的 NH4OH 以维持 pH 值约为 10。使用超声（UI）处理所得混合物 30 分钟。
    4. 反应完成后，在室温下静置溶液 120 小时，直至成熟。
    5. 观察到形成胶状的 nHAP 沉淀物包裹 GNRs，随后出现白色的 nHAP/GNRs 沉淀。
    6. 通过在室温下以 1398 × g 离心 5 分钟，重复洗涤沉淀物 3 次，每次离心后重新分散于去离子水中。
    7. 将洗涤回收的沉淀物冷冻干燥 48 小时。将干燥粉末储存于 4 °C。
    8. 使用原始的 nHAP 和 GNRs 作为对照样品。
  2. GNR/nHAP 纳米复合材料的合成
    1. 将市售 nHAP 以 5 mg/mL 的浓度悬浮于 50 mL 去离子水中，并加入 5 mg 的 GNRs。
    2. 使用超声（UI）处理所得混合物 30 分钟，之后在室温下静置 120 小时。
    3. 成熟后，在室温下以 1398 × g 离心 5 分钟，回收所得 GNR/nHAP 的白色沉淀。
    4. 使用去离子水洗涤样品 3 次，冷冻干燥 48 小时，将干燥粉末于 4 °C 储存以备后续使用。

3. nHAP、nHAP/GNR 和 GNR/nHAP 的表征

  1. 使用高分辨率透射电子显微镜（HRTEM）（参见材料表）表征纳米复合材料的形貌和尺寸11。
  2. 采用能量色散光谱（EDS）分析纳米复合材料的元素组成，并利用扫描透射电子显微镜 （STEM）进行元素分布成像11。
  3. 对纯样品进行傅里叶变换红外（FTIR）光谱分析，波数范围为500–4000 cm−1，以分析纳米复合材料中的化学基团16。
  4. 对合成的nHAP进行粉末X射线衍射（XRD）分析，X射线波长为1.5406 Å，电流和电压设置分别为40 mA和40 kV，2θ扫描范围为20°至90°。
  5. 通过热重分析（TGA）评估纳米复合材料中GNR的负载百分比，实验在氮气氛围下进行，以10 °C/min的升温速率将样品从室温加热至1000 °C。

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结果

高分辨透射电子显微分析
单个石墨烯纳米带（GNRs）呈细长的竹节状结构，并在某些位置出现弯曲，如图2所示。最长的GNR为1.841 µm，而最短的弯曲GNR为497 nm。这些纳米带的宽度常表现出明显变化，可能归因于在多处发生扭曲而形成螺旋构型。此类GNRs的单向排列可能有助于获得磁性、导电性或热传导等优异特性7。

在室温下使用四水合硝酸钙和磷酸氢二铵合成的纳米羟基磷灰石（步骤1）呈棒状或针状，尺寸范围为40 nm至50 nm（图3）。由于聚集和晶体生长，所合成的纳米材料以团块形式存在。另一方面，所用的市售纳米羟基磷灰石呈球形（图4）；这些纳米球的直径为50–70 nm，以包含15–20个球体的独立簇状结构存在。

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讨论

尽管已有多种金属、聚合物、陶瓷及其复合材料被研究用于骨科植入物和固定附件，但由于羟基磷灰石（HAP）在化学成分上与骨组织本身相似，因而具有优异的细胞相容性，被认为是其中最理想的材料之一20,21,22。在本研究中，HAP的取向被加以调控，这可能对其促进成骨、骨整合及骨传导等独特性能产生显著影响。此外，改变HAP的取向还可调节纳米复合材料的力学性能，以进一步模拟天然骨的特性，因为人体长骨中的羟基磷灰石与胶原呈各向异性排列，而立方形骨则呈随机排列。需要注意的是，尽管天然HAP是人体牙齿和骨骼的主要成分，其物理性质却在很大程度上依赖于反应条件，如反应时间、pH值、磷酸盐浓度以及磷酸钙（CaP）相的化学性质23。因此，本研究采用湿化学法在pH为10的条件下结合超声辐照（UI）合成纳米羟基磷灰石（nHAP）。Barbosa等（2013）也报道指出，超声辐照结合无需煅烧的水相沉淀法是一种简单、快速且高效的合成方法，可...

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致谢

Sougata Ghosh 博士感谢印度政府科学技术部科学技术局以及印度贾瓦哈拉尔·尼赫鲁高级科学研究中心为纳米科学与技术领域的博士后海外奖学金项目提供的资助（参考编号：JNC/AO/A.0610.1(4) 2019-2260，日期：2019年8月19日）。Sougata Ghosh 博士同时感谢泰国曼谷的 Kasetsart 大学提供的博士后奖学金，以及“重塑大学计划”（Reinventing University Program）的资助（参考编号：6501.0207/10870，日期：2021年11月9日）。作者谨此感谢 Kostas 先进纳米表征设施（KANCF）在表征实验方面提供的协助。KANCF 是位于美国东北大学的 Kostas 研究所（KRI）内设的多学科共享科研与教育平台。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
磷酸二氢铵Sigma-Aldrich216003-100G合成
硝酸钙四水合物Sigma-Aldrich237124合成
离心机HettichEBA 200S回收
傅里叶变换红外光谱仪BruckerVertex 70表征
石墨烯纳米带Sigma-Aldrich922714合成
高分辨率透射电子显微镜Thermo Fisher ScientificThemis Titan 300表征
磁力搅拌器IKAC-MAG HS7 S68功能化
微量移液器TreffLab06H35687试剂制备
pH计Eutech pH5+ECPH503PLUSK试剂制备
热重分析仪TA InstrumentsSDT Q600表征
超声波清洗机BandelinDT100功能化
通用烘箱MemmertUF55功能化
电子天平PrecisaXB220A试剂制备
X射线衍射仪BruckerD8-Advanced表征

参考文献

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