方法文章

在啮齿类动物中实施微创脑肿瘤切除以实现高活性组织采集

DOI：

10.3791/64048

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2022年5月9日

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1Department of Neurosurgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Neurosurgery, University of Maryland School of Medicine, 3Marlene and Stewart Greenebaum Comprehensive Cancer Center, University of Maryland School of Medicine, 4Diagnostic Radiology and Nuclear Medicine, University of Maryland School of Medicine, 5Pontifical Catholic University of Parana, 6Department of Pathology, University of Maryland School of Medicine, 7Departments of Ophthalmology, Oncology and Biomedical Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案描述了一种通过微创方法结合组织保存系统对啮齿类动物脑肿瘤进行标准化切除的操作流程。该技术对于在啮齿类及其他动物模型中准确模拟临床治疗标准具有重要意义。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案描述了一种用于啮齿类动物脑肿瘤切除及组织保存的标准化操作范式。在临床实践中，最大程度切除肿瘤是大多数脑肿瘤的标准治疗方案。然而，目前大多数可用的临床前脑肿瘤模型未包含肿瘤切除步骤，或采用的手术切除模型耗时较长，且易导致显著的术后并发症、死亡率或实验结果变异。此外，由于缺乏与临床实践相匹配的手术器械或操作流程，以及缺少标准化组织采集平台，啮齿类动物的肿瘤切除手术对研究者而言具有较大挑战。本方案重点介绍一种多功能、非消融性切除装置及其配套的组织保存系统，该系统源自临床版本设备并经适应性改良。本研究所采用的设备在开口端集成了可调节吸力与圆柱形刀片，可精确探查、切割并吸除组织。该微创切除装置通过协同作用实现其功能 通过 最初植入肿瘤时所用的同一个颅骨钻孔。该方法可最大限度减少活检或切除手术过程中对局部解剖结构的改变，并降低大量失血的风险。这些因素显著缩短了手术时间<每只动物约2分钟），提高术后动物存活率，降低实验组间的变异性，并确保切除组织和细胞具有高活性，可用于后续分析。该过程得益于刀片速度约为1,400周期/分钟，可将组织采集至一个无菌封闭系统中，该系统可充入选定的生理溶液。鉴于手术影响、区域化肿瘤切除标本的保存与严格对比分析，以及腔内给药治疗研究日益重要的地位，这一独特方案将拓展探索脑肿瘤患者围手术期管理及治疗发现中尚未解答问题的机会。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

胶质母细胞瘤（GBM）是成人中最常见且最具侵袭性的原发性脑肿瘤。尽管近年来在神经外科、靶向药物开发和放射治疗方面取得了进展，但GBM患者的5年生存率仍低于5%，这一数据在三十多年间未得到显著改善1。因此，亟需开发更有效的治疗策略。

为了开发新的治疗方法，人们越来越清楚地认识到，研究性方案需要做到以下三点：（1）采用可转化的临床前模型，准确地再现肿瘤的异质性和微环境；（2）模拟目前胶质母细胞瘤（GBM）患者所采用的标准治疗方案，即包括手术、放疗和化疗在内的综合治疗；（3）考虑切除的肿瘤核心组织与残留的侵袭性肿瘤组织之间的差异2,3,4,5。 然而，目前大多数可用的临床前脑肿瘤模型要么未实施手术切除，要么采用的手术切除模型相对耗时，导致大量失血或缺乏标准化。此外，由于缺乏与临床相当的手术器械或操作规程，以及缺乏系统性组织采集的成熟平台6（表1），啮齿类动物脑肿瘤的切除手术实施起来具有挑战性。

本方案旨在描述一种使用多功能非消融性微创切除系统（MIRS）和集成化组织保存系统（TPS）对啮齿类动物脑肿瘤进行切除及组织保存的标准化操作范式（图1）。预计这一独特技术将为胶质母细胞瘤（GBM）及其他类型脑肿瘤模型的临床前研究提供一个可广泛采用的标准化平台。研究脑肿瘤治疗或诊断方法的研究人员可在其研究中采用本方案，以实现标准化的肿瘤切除操作。

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方案

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所有动物实验均经马里兰大学和约翰斯·霍普金斯大学机构动物护理和使用委员会批准。本研究采用6至8周龄的C57BL/6雌性小鼠。小鼠来自商业来源（见材料表）。所有操作均遵守生物安全二级（BSL-2）规定，包括佩戴口罩、手套和防护服。

1. 颅内肿瘤初始移植

  1. 在研究的初始阶段，按照先前已发表的文献7，向每只小鼠颅内注射 100,000 个细胞（GL261 小鼠胶质瘤细胞系），细胞悬浮于 4 µL 磷酸盐缓冲液（1× PBS）中，注射深度为 2.5 mm。
  2. 在肿瘤植入后第 9 天，使用 in vivo 成像系统8 对每只小鼠的肿瘤信号进行定量。
    注意：如有需要，可根据肿瘤负荷将小鼠分为两组。在本研究中，两组分别为：（1）肿瘤负荷相对较小的小鼠（平均生物发光信号 = 5.5e+006 ± 0.1e+006 光子/秒，n = 10）和（2）肿瘤负荷相对较大的小鼠（平均生物发光信号 = 1.69e+007 ± 0.2e+007 光子/秒，n = 10），（p < 0.05，Mann-Whitney 检验）9。
  3. 将每组再分为两个可比的亚组。
    注意：在本研究中，两个亚组分别为：未治疗小鼠（n = 5）和接受 MIRS 手术切除肿瘤的小鼠（n = 5），（p > 0.05，Mann-Whitney 检验）9。
  4. 从切除手术当天开始，根据肿瘤生长模式，以相应的频率使用 in vivo 成像系统追踪肿瘤进展。
    注意：对于 GL261 细胞系，应在切除手术当天开始追踪，并随后每 3–6 天进行一次。

2. 使用MIRS进行肿瘤切除

  1. 使用异氟烷-氧气混合气体麻醉小鼠2 在诱导室中使用混合气体，或腹腔注射赛拉嗪/氯胺酮溶液。
    1. 若使用气体麻醉剂，将气体流速设置为1.0 mL/min，蒸发器浓度设置为2.0%，以进行麻醉诱导，通常在麻醉舱内需要3–5分钟（参见 材料表).
    2. 若使用注射用麻醉剂，通过注射0.2 mL麻醉溶液（每千克体重80-100 mg氯胺酮和每千克体重10-12.5 mg赛拉嗪，参见 材料表腹腔内注射。
  2. 通过捏压脚趾评估动物镇静是否充分。在眼睛上涂抹眼用软膏以防止角膜干燥。在操作前给予镇痛剂（0.03–0.06 mg/kg 皮下注射布托啡诺）。
  3. 将小鼠置于立体定位仪上（参见 材料表在确认完全麻醉后。
    注意：如果使用气体麻醉剂，将小鼠的鼻部置于鼻罩中，使其持续吸入异氟烷-氧混合气体。2 操作过程中混合物的比例（1.5%）。
  4. 移除之前的缝合钉，然后使用脱毛膏或剃须的方式去除毛发。使用氯己定/聚维酮碘溶液与酒精交替擦拭的方式对皮肤进行消毒。接着，用无菌手术刀沿先前的手术瘢痕做一条1 cm的纵行正中切口。
  5. 通过载物台适配器/手柄架将MIRS手柄连接到立体定位臂上，以增强稳定性和精确性。
  6. 设置MIRS仪器（参见 材料表) 使用以下设置（图1).
    1. 将电源线组插入后侧面板上的电源线插座。通过拨动开关打开或关闭系统电源（1 = 开，0 = 关）。
    2. 将氮气管的一端（随控制台提供）插入控制台背面面板上的公头接头中。顺时针旋转连接螺母以拧紧连接。
      注意：软管的另一端需连接至氮气供应源。
    3. 在将软管连接至氮气供应源之前，需确认供应压力不超过100 psig，此为设备控制台推荐的输入供应压力。
      注意：当脚踏板启动后，控制台在接通氮气供应时将自动产生负压。
    4. 固定真空端口的盖子并进行密封，以避免真空系统出现任何泄漏。抽吸系统中的任何泄漏都会影响MIRS控制台的性能。
    5. 如果在设置或引物过程中吸力低于17，请检查控制台前面的吸力旋钮是否已调至最大值（100），确保吸力系统无泄漏，并确认氮气输入压力正确。
    6. 将灰色脚踏板插头插入控制台上的灰色插座中，直至发出咔嗒声并牢固就位。
      注意：脚踏开关连接器以特定方向与控制台连接，且具有防错键设计。
    7. 将蓝色手柄连接器插入其对应的蓝色插孔中，直至听到咔嗒声并牢固就位，以完成手柄与主机的连接。
      注意：手柄连接器以特定方向与控制台连接，且具有定位键。
    8. 使用系统前，应先对每个手柄进行预冲洗：从小碗中吸取无菌液体，经由开口、管路和手柄，最终进入集液瓶，以确保管路和手柄内部得到润滑，从而减少组织堵塞的发生。
    9. 通过控制面板选择仅抽吸或抽吸结合切割模式，然后使用脚踏板启动。
  7. 将23 G MIRS套管插入钻孔，深度为2.5 mm。
  8. 通过踩下与套管相连的脚踏板启动切除过程。使用手柄上的控制旋钮完成一个或多个完整的切除循环（360°）。
    注意：进行的循环次数越多，切除的肿瘤组织体积越大。
  9. 切除过程完成后，将23 G MIRS套管从钻孔中撤出，并用5 mL的1×PBS冲洗管路，以清除任何残留碎屑。
  10. 将小鼠从立体定位仪上取下，并使用钉皮器或4-0缝合材料缝合伤口（参见 材料表).
  11. 将小鼠放于加热垫上或保温灯下，待其从麻醉状态恢复后再放回笼中。
  12. 实验结束后，冲洗导管 通过 灌流。交替使用冷培养基和空气 "推" 将所有切除的组织放回收集罐中。从系统上取下收集罐，并用提供的盖子盖紧。
  13. 完成步骤 2.12 后，将套管的远端尖端插入 3% H2O2 以24–25 in Hg的负压抽吸，使吸液管路回抽至吸引收集瓶，并静置60–90秒。使用无菌培养基间歇性地脉冲式通入空气和培养基进行冲洗。
  14. 观察小鼠术后是否出现任何神经学症状（如异常的抽搐运动或癫痫发作）。
  15. 对出现严重神经功能缺损（表现为嗜睡、消瘦外观、弓背或运动失调）的小鼠实施安乐死。
    注意：本研究中，使用200 mg/kg的市售安乐死溶液（参见 材料表用于对每只小鼠实施安乐死。

3. 组织采集 通过 TPS

  1. 将肿瘤样本浸入含有红细胞裂解液的组织培养皿中（参见材料表），在室温下孵育5分钟。
    注意：从MIRS获取并转移至TPS的组织主要以单细胞形式存在，同时伴有少量组织碎片。
  2. 将一个70 µm滤膜（参见材料表）置于50 mL锥形管上，使用5 mL注射器的推杆将肿瘤样本通过滤膜。
  3. 用移液管吸取RPMI-1640培养基，协助细胞及任何组织团块通过滤膜。
  4. 在4 °C条件下，以428 × g离心5分钟，随后用移液器弃去上清液。
  5. 将每份样本重悬于5 mL预先配制的RPMI-1640培养基中。
  6. 为提高组织活性，特别是当初始观察到较大组织团块时，向每份样本中加入所需体积的酶混合液（包含DNAse I、胶原酶IV、分散酶、木瓜蛋白酶和EDTA，参见材料表），使用涡旋振荡器混匀。
    注意：步骤3.6为可选步骤。酶混合液的组成（每份样本总体积为5 mL）：DNAse I II型300 µL，胶原酶/分散酶150 µL（可切割纤连蛋白、胶原酶IV、I及非极性氨基酸），木瓜蛋白酶250 µL（非特异性蛋白酶），0.5 M EDTA 6 µL。
  7. 将样本置于摇床培养箱中，在200 rpm、37 °C条件下孵育20分钟。
  8. 孵育20分钟后，在4 °C条件下以428 × g离心5分钟，弃去上清液。
  9. 将单细胞悬液通过70 µm细胞滤网过滤，并在4 °C条件下以274 × g离心3分钟。使用台盼蓝染色和血细胞计数板进行细胞活力分析10（参见材料表）。
    注意：第0天的细胞活力范围为30%–70%，并在2–3天内显著提高。
  10. 根据所需的活力检测方法，继续进行步骤4、5或6。

4. 贴壁培养细胞的培养

  1. 在经过认证的层流罩中，用含血清的贴壁培养基（如DMEM、10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（P/S）溶液）重悬细胞沉淀，并将细胞接种至贴壁细胞培养瓶中。
  2. 将细胞置于受控的培养环境（37 °C，5% CO2）中培养。

5. 悬浮培养细胞（神经球）

  1. 在经过认证的层流罩中，用无血清的完全干细胞培养基11重悬细胞沉淀，并接种至悬浮培养瓶中。
  2. 将细胞置于受控的培养环境（37 °C，5% CO2）中培养 2–3 天，以促进神经球的形成。
  3. 在培养基中观察到神经球后，使用胰蛋白酶-EDTA 或 Accutase（见材料表）处理，获得单细胞悬液用于传代。
    注意：只要在收获过程中格外小心，并使用支持神经干细胞生长的适当培养基，收获组织中的干细胞应在数天内形成神经球。

6. 准备用于重新植入的细胞

  1. 用4 µL的1x PBS重悬沉淀，浓度为每4 µL含100,000个活细胞。
  2. 立即采用颅内肿瘤植入法（步骤1）注射到未处理小鼠体内。

7. 组织学分析

  1. 切除后立即取出脑组织，并用4%多聚甲醛（PFA）固定24小时12。
  2. 将脑组织转移至30%蔗糖溶液中，直至其充分浸透蔗糖（沉降至容器底部）。
  3. 将脑组织转移至70%乙醇溶液中。
  4. 按照先前发表的文献方法进行石蜡包埋、切片及标准苏木精-伊红（H&E）染色13。
    注意：用于染色的每个切片厚度为10 µm。

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结果

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使用MIRS进行手术切除可显著降低肿瘤负荷
在肿瘤负荷较小的组中，接受切除术的亚组其平均基线生物发光信号为5.5e+006 光子/秒 ± 0.2e+006。切除术后，平均生物发光信号下降至3.09e+006 光子/秒 ± 0.3e+006（p <0.0001，Mann-Whitney检验）9 （图2）。在随后的几天内，生物发光信号逐渐上升，直至小鼠被实施安乐死。同样，在肿瘤负荷较大的组中，接受切除术的亚组其平均基线生物发光信号为1.68e+007 光子/秒 ± 0.1e+007。切除术后，平均生物发光信号下降至5.19e+006 光子/秒 ± 0.2e+006（p <0.0001，Mann-Whitney检验）9。在随后的几天内，生物发光信号同样逐渐上升，直至小鼠被实施安乐死。

使用MIRS...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

肿瘤切除术是神经外科肿瘤学治疗低级别和高级别脑肿瘤患者的核心手段。脑肿瘤患者的细胞减灭和肿瘤去瘤体积与神经功能改善及总体生存率提高密切相关1,2,5,6。尽管既往已有文献描述过啮齿类动物模型中的手术切除方案，但这些方案存在若干局限性，可能干扰实验结果的可靠性以及临床前模型的整体可转化性。例如，以往报道的手术切除方案通常包括开颅术，需钻3-4个小型骨孔以形成骨瓣，随后依靠研究者经验对肿瘤组织与正常脑组织在颜色和质地上的差异进行细致辨别和区分6。此类操作耗时较长，且要求研究人员具备熟练使用手术显微镜、操作手术器械、识别肿瘤边界相对于周围正常脑组织的能力，并能实现充分的止血。此类操作常导致显著的失血及动物死亡。此外，在同一实验中，不同动物间实现切除肿瘤体积一致的标准化切除具有挑战性。当由多名操作人员共同执行该操作时，这种连续性和一致性更加难以...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BT 获得了美国国立卫生研究院（NIH）的研究资助，是 Accelerating Combination Therapies* 的共同所有人，且 Ashvattha Therapeutics 公司已获得其一项专利的授权。GW 获得了 NIH 资助（R01NS107813）。HB 担任 Insightec 公司的付费顾问，并担任该公司医学顾问委员会主席。此安排已根据约翰斯·霍普金斯大学的利益冲突政策进行了审查并获得批准。HB 获得了 NIH、约翰斯·霍普金斯大学以及慈善资金的研究资助，并担任 CraniUS、Candel Therapeutics, Inc.、Accelerating Combination Therapies*、Catalio Nexus Fund II, LLC*、LikeMinds, Inc*、Galen Robotics, Inc.* 和 Nurami Medical* 的顾问。（*包括股权或期权）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 mL 注射器BD309628
15 mL 圆底离心管Corning430052
200 proof 乙醇PharmCo111000200
5 mL 移液管CoStar4487
70 微米滤膜Fisher08-771-2
AccutaseMillipore SigmaSIG-SCR005
Anased（赛拉嗪注射液，100 mg/mL）Covetrus33198
麻醉系统Patterson Scientific78935903
麻醉废气收集容器Patterson Scientific78909457
实验台防护垫Covidien10328
C57Bl/6，6-8 周龄小鼠Charles River Laboratories品系编号 027
ChroMini ProMoser型号 1591-Q
胶原酶-分散酶Roche#10269638001
Countess II 自动细胞计数仪Thermo Fisher
Countess II FL 血细胞计数板Thermo FisherA25750
去碎片溶液Miltenyi Biotech#130-109-398
D-荧光素GoldbioLUCK-1G
DMEM F12 培养基Corning10-090-CV
DMEM 培养基Corning10-013-CV
DNase ISigma Aldrich#10104159001
Eppendorf 管Posi-Click1149K01
安乐死溶液Henry Schein71073
FBSMillipore SigmaF4135
胎牛血清Thermo Fisher10437-028
福尔马林InvitrogenINV-28906
纱布Henry Schein101-4336
hEGFPeproTech EC100-15
肝素SigmaH-3149
hFGF-bPeproTech EC1001-18B
诱导室Patterson Scientific78933388
异氟烷Covetrus11695-6777-2
异氟烷挥发器Patterson Scientific78916954
氯胺酮Covetrus11695-0703-1
Kopf 立体定位仪Kopf Instruments5001
Lightfield 显微镜BioTekCytation 5
微量注射装置Kopf5001
微型电机钻ForedomF210418
MRI 系统Bruker7T Biospec Avance III MRI 扫描仪
NICO Myriad 系统NICO Corporation
眼科软膏Puralube vet ointment
木瓜蛋白酶Sigma Aldrich#P4762
PBSInvitrogen#14190250
青霉素-链霉素Millipore SigmaN1638
Percoll 溶液Sigma Aldrich #P4937
移液管控制器FalconA07260
聚维酮碘溶液Aplicare52380-1905-08
孕酮SigmaP-8783
腐胺SigmaP-5780
RPMI 培养基InvitrogenINV-72400120
手术刀片Covetrus7319
手术刀柄Fine Science Tools91003-12
皮肤标记笔Time OutD538,851
缝钉拆除器MikRonACR9MM
缝合器MikRonACA9MM
缝钉Clay Adams427631
立体定位仪Kopf Instruments5000
蔗糖Sigma AldrichS9378
缝线，Vicryl 4-0EthiconJ494H
T-75 培养瓶Sarstedt83-3911-002
TheraPEAKTM ACK 裂解缓冲液（1x）LonzaBP10-548E
胰蛋白酶-EDTACorningMDT-25-053-CI

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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