本方案描述了一种通过微创方法结合组织保存系统对啮齿类动物脑肿瘤进行标准化切除的操作流程。该技术对于在啮齿类及其他动物模型中准确模拟临床治疗标准具有重要意义。
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摘要
摘要
本方案描述了一种用于啮齿类动物脑肿瘤切除及组织保存的标准化操作范式。在临床实践中，最大程度切除肿瘤是大多数脑肿瘤的标准治疗方案。然而，目前大多数可用的临床前脑肿瘤模型未包含肿瘤切除步骤，或采用的手术切除模型耗时较长，且易导致显著的术后并发症、死亡率或实验结果变异。此外，由于缺乏与临床实践相匹配的手术器械或操作流程，以及缺少标准化组织采集平台，啮齿类动物的肿瘤切除手术对研究者而言具有较大挑战。本方案重点介绍一种多功能、非消融性切除装置及其配套的组织保存系统，该系统源自临床版本设备并经适应性改良。本研究所采用的设备在开口端集成了可调节吸力与圆柱形刀片，可精确探查、切割并吸除组织。该微创切除装置通过协同作用实现其功能 通过 最初植入肿瘤时所用的同一个颅骨钻孔。该方法可最大限度减少活检或切除手术过程中对局部解剖结构的改变，并降低大量失血的风险。这些因素显著缩短了手术时间<每只动物约2分钟），提高术后动物存活率，降低实验组间的变异性，并确保切除组织和细胞具有高活性，可用于后续分析。该过程得益于刀片速度约为1,400周期/分钟，可将组织采集至一个无菌封闭系统中，该系统可充入选定的生理溶液。鉴于手术影响、区域化肿瘤切除标本的保存与严格对比分析，以及腔内给药治疗研究日益重要的地位，这一独特方案将拓展探索脑肿瘤患者围手术期管理及治疗发现中尚未解答问题的机会。
引言
胶质母细胞瘤（GBM）是成人中最常见且最具侵袭性的原发性脑肿瘤。尽管近年来在神经外科、靶向药物开发和放射治疗方面取得了进展，但GBM患者的5年生存率仍低于5%，这一数据在三十多年间未得到显著改善1。因此，亟需开发更有效的治疗策略。
为了开发新的治疗方法，人们越来越清楚地认识到，研究性方案需要做到以下三点：（1）采用可转化的临床前模型，准确地再现肿瘤的异质性和微环境；（2）模拟目前胶质母细胞瘤（GBM）患者所采用的标准治疗方案，即包括手术、放疗和化疗在内的综合治疗；（3）考虑切除的肿瘤核心组织与残留的侵袭性肿瘤组织之间的差异2,3,4,5。 然而，目前大多数可用的临床前脑肿瘤模型要么未实施手术切除，要么采用的手术切除模型相对耗时，导致大量失血或缺乏标准化。此外，由于缺乏与临床相当的手术器械或操作规程，以及缺乏系统性组织采集的成熟平台6（表1），啮齿类动物脑肿瘤的切除手术实施起来具有挑战性。
本方案旨在描述一种使用多功能非消融性微创切....
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方案
所有动物实验均经马里兰大学和约翰斯·霍普金斯大学机构动物护理和使用委员会批准。本研究采用6至8周龄的C57BL/6雌性小鼠。小鼠来自商业来源（见材料表）。所有操作均遵守生物安全二级（BSL-2）规定，包括佩戴口罩、手套和防护服。
1. 颅内肿瘤初始移植
- 在研究的初始阶段，按照先前已发表的文献7，向每只小鼠颅内注射 100,000 个细胞（GL261 小鼠胶质瘤细胞系），细胞悬浮于 4 µL 磷酸盐缓冲液（1× PBS）中，注射深度为 2.5 mm。
- 在肿瘤植入后第 9 天，使用 in vivo 成像系统8 对每只小鼠的肿瘤信号进行定量。
注意：如有需要，可根据肿瘤负荷将小鼠分为两组。在本研究中，两组分别为：（1）肿瘤负荷相对较小的小鼠（平均生物发光信号 = 5.5e+006 ± 0.1e+006 光子/秒，n = 10）和（2）肿瘤负荷相对较大的小鼠（平均生物发光信号 = 1.69e+007 ± 0.2e+007 光子/秒，n = 10），（p < 0.05，Mann-Whitney 检验）9。 - 将每组再分为两个可比的亚组。
注意：在....
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结果
使用MIRS进行手术切除可显著减少肿瘤负荷
在肿瘤负荷较小的组中，接受切除术的亚组其基线平均生物发光信号为 5.5e+006 光子/秒 ± 0.2e+006。切除术后，平均生物发光信号下降至 3.09e+006 光子/秒 ± 0.3e+006（p <0.0001，Mann-Whitney 检验）9 （图2）。随后数天内生物发光信号逐渐上升，直至小鼠被实施安乐死。同样，在肿瘤负荷较大的组中，接受切除术的亚组其基线平均生物发光信号为 1.68e+007 光子/秒 ± 0.1e+007。切除术后，平均生物发光信号下降至 5.19e+006 光子/秒 ± 0.2e+006（p <0.0001，Mann-Whitney 检验）9。随后数天内生物发光信号同样逐渐上升，直至小鼠被实施安乐死。
使用 MIR.......
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讨论
肿瘤切除术是神经外科肿瘤学治疗低级别和高级别脑肿瘤患者的核心手段。脑肿瘤患者的细胞减灭和肿瘤去瘤体积与神经功能改善及总体生存率提高密切相关1,2,5,6。尽管既往已有文献描述过啮齿类动物模型中的手术切除方案，但这些方案存在若干局限性，可能干扰实验结果的可靠性以及临床前模型的整体可转化性。例如，以往报道的手术切除方案通常包括开颅术，需钻3-4个小型骨孔以形成骨瓣，随后依靠研究者经验对肿瘤组织与正常脑组织在颜色和质地上的差异进行细致辨别和区分6。此类操作耗时较长，且要求研究人员具备熟练使用手术显微镜、操作手术器械、识别肿瘤边界相对于周围正常脑组织的能力，并能实现充分的止血。此类操作常导致显著的失血及动物死亡。此外，在同一实验中，不同动物间实现切除肿瘤体积一致的标准化切除具有挑战性。当由多名操作人员共同执行该操作时，这种连续性和一致性更加难以.......
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披露
BT 获得了美国国立卫生研究院（NIH）的研究资助，是 Accelerating Combination Therapies* 的共同所有人，且 Ashvattha Therapeutics 公司已获得其一项专利的授权。GW 获得了 NIH 资助（R01NS107813）。HB 担任 Insightec 公司的付费顾问，并担任该公司医学顾问委员会主席。此安排已根据约翰斯·霍普金斯大学的利益冲突政策进行了审查并获得批准。HB 获得了 NIH、约翰斯·霍普金斯大学以及慈善资金的研究资助，并担任 CraniUS、Candel Therapeutics, Inc.、Accelerating Combination Therapies*、Catalio Nexus Fund II, LLC*、LikeMinds, Inc*、Galen Robotics, Inc.* 和 Nurami Medical* 的顾问。（*包括股权或期权）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 mL 注射器 | BD | 309628 | |
| 15 mL 圆底离心管 | Corning | 430052 | |
| 200 proof 乙醇 | PharmCo | 111000200 | |
| 5 mL 移液管 | CoStar | 4487 | |
| 70 微米滤膜 | Fisher | 08-771-2 | |
| Accutase | Millipore Sigma | SIG-SCR005 | |
| Anased（赛拉嗪注射液，100 mg/mL） | Covetrus | 33198 | |
| 麻醉系统 | Patterson Scientific | 78935903 | |
| 麻醉废气收集容器 | Patterson Scientific | 78909457 | |
| 实验台防护垫 | Covidien | 10328 | |
| C57Bl/6，6-8 周龄小鼠 | Charles River Laboratories | 品系编号 027 | |
| ChroMini Pro | Moser | 型号 1591-Q | |
| 胶原酶-分散酶 | Roche | #10269638001 | |
| Countess II 自动细胞计数仪 | Thermo Fisher | ||
| Countess II FL 血细胞计数板 | Thermo Fisher | A25750 | |
| 去碎片溶液 | Miltenyi Biotech | #130-109-398 | |
| D-荧光素 | Goldbio | LUCK-1G | |
| DMEM F12 培养基 | Corning | 10-090-CV | |
| DMEM 培养基 | Corning | 10-013-CV | |
| DNase I | Sigma Aldrich | #10104159001 | |
| Eppendorf 管 | Posi-Click | 1149K01 | |
| 安乐死溶液 | Henry Schein | 71073 | |
| FBS | Millipore Sigma | F4135 | |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher | 10437-028 | |
| 福尔马林 | Invitrogen | INV-28906 | |
| 纱布 | Henry Schein | 101-4336 | |
| hEGF | PeproTech EC | 100-15 | |
| 肝素 | Sigma | H-3149 | |
| hFGF-b | PeproTech EC | 1001-18B | |
| 诱导室 | Patterson Scientific | 78933388 | |
| 异氟烷 | Covetrus | 11695-6777-2 | |
| 异氟烷挥发器 | Patterson Scientific | 78916954 | |
| 氯胺酮 | Covetrus | 11695-0703-1 | |
| Kopf 立体定位仪 | Kopf Instruments | 5001 | |
| Lightfield 显微镜 | BioTek | Cytation 5 | |
| 微量注射装置 | Kopf | 5001 | |
| 微型电机钻 | Foredom | F210418 | |
| MRI 系统 | Bruker | 7T Biospec Avance III MRI 扫描仪 | |
| NICO Myriad 系统 | NICO Corporation | ||
| 眼科软膏 | Puralube vet ointment | ||
| 木瓜蛋白酶 | Sigma Aldrich | #P4762 | |
| PBS | Invitrogen | #14190250 | |
| 青霉素-链霉素 | Millipore Sigma | N1638 | |
| Percoll 溶液 | Sigma Aldrich | #P4937 | |
| 移液管控制器 | Falcon | A07260 | |
| 聚维酮碘溶液 | Aplicare | 52380-1905-08 | |
| 孕酮 | Sigma | P-8783 | |
| 腐胺 | Sigma | P-5780 | |
| RPMI 培养基 | Invitrogen | INV-72400120 | |
| 手术刀片 | Covetrus | 7319 | |
| 手术刀柄 | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| 皮肤标记笔 | Time Out | D538,851 | |
| 缝钉拆除器 | MikRon | ACR9MM | |
| 缝合器 | MikRon | ACA9MM | |
| 缝钉 | Clay Adams | 427631 | |
| 立体定位仪 | Kopf Instruments | 5000 | |
| 蔗糖 | Sigma Aldrich | S9378 | |
| 缝线，Vicryl 4-0 | Ethicon | J494H | |
| T-75 培养瓶 | Sarstedt | 83-3911-002 | |
| TheraPEAKTM ACK 裂解缓冲液（1x） | Lonza | BP10-548E | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Corning | MDT-25-053-CI |
参考文献
- Mineo, J. F., et al. Prognosis factors of survival time in patients with glioblastoma multiforme: a multivariate analysis of 340 patients. Acta Neurochirurgica. 149 (3), 245-252 (2007).
- Miyai, M., et al. Current tr....
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