模拟土壤培养实验中的温度

摘要

实验室土壤增温实验通常在多个培养箱中采用两种或以上的恒定温度。通过介绍一种复杂的环境培养箱，我们提供了一种精确的温度控制方法，用于模拟温度变化的幅度和振幅 原位 土壤温度并改进土壤培养实验的设计。

摘要

研究增温对土壤的影响需要对温度进行真实且准确的表征。在实验室培养研究中，普遍采用的方法是在多个培养箱中维持恒定的温度， 通过 比较低温和高温培养箱中土壤的响应，以推导增温对土壤变化的影响。然而，这种常用方法未能真实模拟野外条件下实际温度的幅度和波动范围，因而可能削弱此类研究的可靠性。随着精密环境培养箱的日益普及，迫切需要探索用于土壤培养研究的替代性温度控制方法。本实验方案将介绍一种先进的环境培养箱，并演示传统与新型的温度控制方法，以改进土壤培养实验设计。该方案主要包括四个步骤：温度监测与编程、土壤采集、实验室培养以及增温效应比较。文中将提供一个示例，展示不同的温度控制方法及其产生的不同增温情景，即恒温设计的逐步增温（stepwise warming, SW）和模拟 原位 温度设计为逐步升温（GW），以及其对土壤呼吸、微生物生物量和胞外酶活性的影响。此外，我们提出一种策略，以多样化温度变化情景，满足特定的气候变化研究需求（例如极端高温）。该温度控制方案及推荐的精心设计且多样化温度变化情景，将有助于研究人员在实验室中建立可靠且贴近实际的土壤培养实验。

引言

本世纪全球地表温度预计上升 1.8–6.4 °C^1,2全球变暖可能会增加CO₂ 土壤向大气的通量增加，导致与变暖产生正反馈^3,4,5,6因为微生物群落在调控土壤呼吸对增温的响应中起着关键作用^7,8，变暖条件下微生物呼吸的变化及其潜在的微生物机制已成为研究重点。尽管已在野外条件下开展了土壤增温实验， 通过 加热电缆⁹ 以及一个敞口顶室¹⁰，有利于捕捉土壤温度等自然特征¹¹，其高昂的安装和维护成本限制了它们的应用。相比之下，对土壤进行不同温度条件下的培养实验是一种更可取的选择。实验室土壤培养的主要优势在于，通过严格控制环境条件（如温度），能够将单一因素的影响从野外实验中的其他混杂因素中分离出来^12,13尽管生长室实验与田间实验之间存在差异（例如植物生长），但实验室结果向田间的转化应用仍具有可行性。¹⁴在实验室环境中孵育土壤样品有助于加深对土壤对增温响应机制的理解¹⁵.

我们的文献综述识别出以往土壤培养研究中采用的多种温度控制方法，从而形成了不同的温度变化模式（表1）。首先，用于控制温度的仪器主要包括培养箱、生长室、水浴装置，在极少数情况下使用加热电缆。基于这些仪器，已产生三种典型的温度变化模式（图1），包括应用最广泛的恒温模式（CT）、具有非零恒定温度变化速率的线性变化（LC），以及以昼夜型温度变化为特征的非线性变化（NC）。在CT模式下，温度可能随时间在幅度上有所波动，但在培养期间的特定时间段内仍保持恒定（图1B）。对于LC模式，不同研究中的温度变化速率差异超过两个数量级（例如，0.1 °C/天 与 3.3 °C/小时；表1）；对于NC模式，大多数研究依赖所用仪器的内在调控能力，因而导致多种变化形式。尽管有研究声称通过加热电缆或培养箱实现了某种昼夜温度变化模式^16,17，但这些实验中的腔室温度并未经过验证。其他主要的综述结果见于表1，包括培养温度范围为0–40 °C，其中大多数集中在5–25 °C；实验持续时间从数小时（<1天）到近2年（约725天）不等。此外，用于培养的土壤样品采自森林、草地和农田生态系统，涵盖主要的矿质层、有机层甚至污染土壤，采样地点主要集中于美国、中国和欧洲（表1）。

根据三种主要的温度变化模式，以往研究中实现的几种不同变暖情景已在表2中进行了总结。这些情景包括逐步变暖（SW）、不同幅度的逐步变暖（SW_v）、线性渐进式变暖（GW_l）、非线性渐进式变暖（GW_n）以及昼夜渐进式变暖（GW_d）。

综上所述，以往的土壤培养实验通常仅记录某一地点的平均空气或土壤温度。在许多情况下，如表1所示，培养箱或环境室被手动设定为恒定温度，但无法根据需要自动调节温度，缺乏对温度随时间变化模式和变化速率的控制能力（公式1），因此难以模拟当地土壤的昼夜温度变化。另一方面，尽管已有两项实验曾尝试实现这一目标^16,17，但我们通过文献调研发现，目前尚无研究在其培养实验中明确模拟过逐日渐进式变暖（GW_d）过程（表1）。根据文献综述结果，主要障碍在于实验设计不足，特别是缺乏一种精密的仪器，能够实现并验证昼夜性或其他渐进式变暖情景。

   (公式 1)

其中，ΔT 表示温度变化量，m 表示温度变化模式，r 表示温度变化速率，t 表示变化持续时间。

为提高土壤培养实验的严谨性，本研究提出了一种精确且先进的温度控制方法。采用日益普及且经济可行的尖端环境培养箱，该新设计不仅能实现对 原位 土壤温度（例如昼夜变化模式），并通过考虑可能的极端温度变化，提供一种可靠的方法以最大限度地减少仪器偏差带来的假象。当前的土壤培养设计应有助于研究人员确定满足其培养和研究需求的最佳策略。该方法的总体目标是为土壤生物地球化学研究者提供一种高度可操作的方法，以改进土壤培养设计。

方案

1. 温度监测与程序设置

1. 在研究样地内确定一个取样区域。在土壤中10厘米深度处安装一个或多个自动温度探头。将气象站连接至计算机 通过 连接数据传输电缆并在计算机上打开软件。
2. 点击 启动/属性 工具栏按钮，用于配置所用外部传感器的日志记录器。
3. 在 性质 屏幕中设置记录仪/站点名称（例如：Soil incubation exp.）和数据采集间隔（例如：60 min）。然后，在 特性 筛选，点击 启用 根据所使用的外部传感器端口，从每个传感器端口的下拉按钮中选择相应的传感器/单位（例如，A端口； "启用"：温度 ˚C）。最后，单击 好的 保存设置。
4. 每周监测探头读数，以防出现故障，并每月下载一次数据集。获取覆盖生长季（即4月至9月）数月的完整记录。
5. 对温度记录进行数据分析。通过平均所有观测值，获得生长季的逐小时平均温度。
   1. 通过生长季期间所有天数中相同小时的温度进行平均，获得每日每小时的平均温度。
6. 在精密腔室中，启动软件并点击 简介 在主菜单屏幕上点击按钮以创建新文件。在文件名输入栏中，输入 "SW 低". 点击 即时变化 选项，在“初始温度”处输入步骤1.5中获得的15.9 °C，并在2处输入 分钟 行以保持温度2分钟，然后单击 完成 按钮。然后，在下方 斜坡时间 选项，将目标设定点输入为 15.9 °C 并开启 小时 行输入850 h以维持温度。最后，点击 完成 按钮
   1. 在第二个腔室中重复上述步骤，每个温度节点增加 5 °C，并创建新的文件名 "SW 高".
   2. 在第三个腔室中重复步骤1.4，增加23个额外步骤，对应于步骤1.5.1中获得的23个观测到的 hourly 土壤温度。在最后一步，称为 JUMP，设置42次重复循环（跳跃计数42）。这将导致逐渐升温或低温全球变暖（GW low）的情景。
   3. 在第四个腔室中重复上述步骤，每个温度节点增加 5 °C。这将实现为期 42 天的较高温度水平（即 GW high）下的不同温度模拟。
7. 进行24小时的初步运行，并输出四个腔室记录的温度。将腔室记录的温度与程序设定的温度进行对比作图图2A- D).
   1. 如果腔室内达到的温度与程序设定的温度一致，则温度差 <0.1 °C，持续24小时（图2A，B，E，F），这些培养室适用于土壤培养实验。
   2. 如果这些腔室中的任何一个未满足标准，则重复进行24小时测试，或更换新的腔室。

2. 土壤采集与均质化

1. 在温度探头附近区域，采集0-20 cm深度的五个土壤样品，去除地表枯落物层后，放入一个塑料袋中。
2. 通过扭转、按压和揉捏袋内样品，充分混合，直至无法分辨出单个土壤样品。
3. 将样品置于装有冰袋的冷藏箱中，并立即运送至实验室。
4. 去除每个土芯中的根系，用2 mm孔径土壤筛过筛，并在进行后续分析前充分混合和均质化样品。

3. 实验室培养

1. 孵育前，称取10.0 g新鲜土壤，在105 °C下烘干24 h，再称量干土质量。计算新鲜土壤与干土质量之差，并以该差值除以干土质量，求得土壤含水量，记录于电子表格中。
2. 利用所计算的含水量，按照后续步骤所述方法，计算土壤微生物生物量碳（MBC）、胞外酶活性（EEA）和土壤异养呼吸速率。这些数据有助于理解处理措施对土壤呼吸的影响及其潜在的微生物机制。
3. 孵育前，称取田间湿润土壤亚样品（10 g），采用氯仿熏蒸-K₂SO₄提取法和过硫酸钾消化法测定土壤MBC¹⁸。
4. 孵育前，称取田间湿润土壤亚样品（1.0 g），测定土壤水解酶和氧化酶活性¹⁹。
5. 称取16份田间湿润土壤亚样品（相当于15.0 g干重），分别装入16个聚氯乙烯（PVC）土柱（直径5 cm，高7.5 cm），土柱底部用玻璃纤维滤纸密封。
6. 将PVC土柱放入广口玻璃罐（约1 L）中，罐底铺一层玻璃珠，以防止土柱吸收水分。
7. 按照步骤1.4所述，将四个玻璃罐分别置于四个培养室中。开启培养室设备，并同时在四个培养室中启动程序。
8. 在孵育期间，于2 h以及第1、2、7、14、21、28、35和42天，取出四个培养室中的所有玻璃罐，使用便携式CO₂气体分析仪，将分析仪的密封环置于每个罐体顶部，测定土壤呼吸速率（R_s）。
9. 在孵育结束时（即第42天），将所有玻璃罐进行破坏性取样，按照步骤3.3所述方法测定土壤MBC。
10. 在孵育结束时（即第42天），将所有玻璃罐进行破坏性取样，按照步骤3.4所述方法测定土壤酶活性。

4. 保温效果比较

1. 假设两次连续采集间的呼吸速率（Rs）保持恒定，将呼吸速率乘以持续时间，以计算累积呼吸量（R_c).
2. 采用三因素重复测量方差分析（ANOVA）检验时间、温度（增温）和温度模式（增温情景）对R的主效应及交互效应_s 和 R_c此外，进行双因素方差分析（two-way ANOVA），以检验增温及其增温情景对微生物生物量碳（MBC）和胞外酶活性（EEA）的影响。

结果

所选的先进培养室能够高精度地复现目标温度（图2A、B、E、F），并满足孵化实验的技术要求。鉴于其操作简便易用，该技术标志着在土壤增温研究及其他应用（如植物研究）中温度模拟方法的改进。该方法已在我们最近一项基于美国田纳西州中部柳枝稷农田的案例研究中得到应用。

研究结果表明，与对照处理相比，两种增温情景（SW 和 GW）下的增温均导致显著更高的呼吸损失（R_s 和 R_c），且 GW 情景下的增温诱导呼吸损失（R_c）是 SW 情景的两倍，分别为 81% 与 40%（图 3）。在第 42 天，SW 与 GW 之间的微生物生物量碳（MBC）和酶活性（EEA）也存在显著差异，表现为 SW 中的 MBC 高于 GW（69% 与 38%；图 4），而糖苷酶和过氧化物酶（如 AG、BG、BX、CBH、NAG、AP、LAP）在 GW 中显著高于 SW 情景（图 5）。

图1：根据表1概念化绘制的土壤增温实验中温度变化模式示意图。（A）大多数研究采用的恒定温度（CT）。（B）幅度可变的恒定温度（CT_v）。（C、D）具有正负变化速率的线性变化（LC）。（E、F）具有不规则模式和昼夜模式的非线性变化（NC）。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：24小时测试期间通过程序设定的目标温度与实际箱体温度。（A、B）逐步增温（SW）条件下对照组与增温组的目标温度（灰色实线）与箱体温度记录（虚线）；（C、D）渐进增温（GW）条件下对照组与增温组的目标温度（灰色实线）与箱体温度记录（虚线）；（E、F）由（C）和（D）图中数据计算得出的温度差值。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：在42天土壤培养实验中，逐步增温（SW）和渐进增温（GW）条件下对照组（空心）与增温组（实心）的平均（± 标准误）累积土壤呼吸速率（R_c, µg CO₂-C·g_soil^-1）。 插图显示用于估算累积呼吸速率的土壤呼吸速率（R_s, µg CO₂-C·h^-1·g_soil^-1），假设R_s在下一次测量前保持恒定。（A）逐步增温（SW）和（B）渐进增温（GW）。每组采集样本数N = 4。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：在为期 42 天的土壤培养实验中，SW 和 GW 条件下对照组与增温处理组的微生物生物量碳（MBC）平均值（± 标准误）。 MBC = 微生物生物量碳；每组采集样本数 N = 4。S 表示增温情景（SW 与 GW）的显著效应，基于三因素重复测量方差分析，p < 0.05。请点击此处查看该图的放大版本。

图 5：在 SW 和 GW 的 42 天培养实验中，对照和增温处理下糖苷酶和过氧化物酶的平均值（± 标准误）（µmol 活性 h^-1·gsoil^-1）。BX = β1,4-木糖苷酶； AP = 酸性磷酸酶； LAP = 亮氨酸氨肽酶； NAG = β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶； OX = 氧化酶； PHO = 酚氧化酶； PER = 过氧化物酶。每次采样重复数 N = 4。S 表示增温情景（SW 与 GW）的显著效应，p < 0.05，基于三因素重复测量方差分析。 请点击此处查看该图的放大版本。

表1：土壤培养研究中温度控制方法和温度变化模式的文献综述^{12,13,16,17,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,
33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,
52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62}。
本综述共纳入46项研究。请点击此处下载该表格。

表2：基于文献综述（表1）的主要温度变化模式及相应的变暖情景。 确立了五种模式与情景，以代表一系列可能的温度变化和变暖条件。请点击此处下载该表格。

讨论

恒温控制方法已被广泛应用（表1）。然而，这些方法中所采用的温度大小和时间模式难以真实模拟野外条件下观测到的土壤温度变化。尽管近年来已有研究尝试模拟昼夜温度变化模式，但相关研究仍十分有限，且未能明确说明所使用的设备与操作流程，也未对温度模拟的准确性与可靠性进行验证^16,17。随着科学界不断致力于深入理解土壤增温的响应机制，优化土壤培养实验方法，使其具备更真实的温度条件和可行的控制手段，已成为当务之急。然而，此类新方法尚未建立，因此未来培养实验的标准化方法仍遥不可及。面对全球温度变化在幅度、振幅、季节性、持续时间和极端性方面日益增加的复杂性，亟需一套全面系统的实验方案。

本文介绍了一种利用精密培养室操控昼夜温度变化过程的方法，该方法能够实现恒定、线性及非线性温度变化，进而构建多种变暖情景，以满足未来研究需求。本实验方案包含四个关键步骤。第一步是确定野外条件下的土壤温度。由于不同研究中所关注的土壤类型、深度以及土地利用类型可能存在差异，因此应根据具体研究地点的实际条件，适当调整所需温度探头的数量。 通常情况下，0–20 cm 的土壤深度可满足大多数研究需求，用于表征土壤温度的探头数量应控制在1至3个之间。关键在于至少在一个典型土壤位置获得长期连续的温度记录。

第二个关键步骤是设置程序，以在腔室内实现目标的温度幅度和变化模式。由于腔室具有高灵敏度和高准确性（图4），因此可以精确编程，以准确再现野外条件下观测到的温度变化。尽管本实验方案仅以每小时观测的温度作为腔室的目标温度，但通过该方法还可实现更频繁的土壤温度监测，例如每30分钟、15分钟，甚至更短时间间隔。然而，在实验开始前，必须对目标温度与腔室实际温度进行连续24小时的测试，并确保在所有时间点上，两者之间的差异小于0.1 °C。所选择用于模拟的温度观测频率越高，实验前在腔室中设置程序所需的步骤就越多。

第三个关键步骤是进行孵育本身。为了减少土壤异质性⁶³的影响，均质化土壤样品至关重要，且建议每种处理至少设置三个重复。在孵育开始之前，需要进行预孵育处理，当前程序可通过在实验正式开始前设定温度和持续时间来实现预处理。这种方法有助于减少实验干扰，并使整个孵育过程更加连贯。最后一个关键步骤是同时包含恒温处理和变温处理，以便能够比较土壤对增温的响应。

该方案可轻松修改，以调控温度变化的幅度、强度和持续时间。例如，除能够反映气候变化导致的夏季热浪期间的极端高温和早春突发霜冻外，还可模拟这些事件不同的持续时间和强度。通过组合模拟规律性和非规律性温度变化，还可模拟未来预测的长期复杂温度变化效应。如表2所总结，以往许多独立研究中所采用的各类增温情景，均可在单个研究中综合实现。本方案有望为土壤培养实验中的温度模拟提供一种精密的方法。期望其广泛应用将有助于基于实验室培养，识别或验证未来土壤增温研究中更为准确的方法。

该实验方法的一个重要局限性在于，当前方案所使用的培养室体积相对较小，因此每个培养室仅能容纳九个培养罐。尽管使用较小的培养罐可增加培养室的容量，但仍建议采用大体积的培养室。新型号设备（例如 TestEquity 1007）的容量可达原来的八倍，因此更适用于大规模实验。尽管当前方案在土壤培养的温度控制方面有所改进，但水分控制和土壤均质化方面可能存在的问题仍无法通过采用本方案得到解决。

我们展示了该精密温度控制方法的显著优势。该方法提供了一种可靠且经济的温度控制策略，可实现准确的温度模拟，并为改进土壤培养实验提供了可行途径，有助于更深入理解土壤对增温的响应。尽管恒温控制被广泛接受且在操作上较为简便，但长期恒温可能对土壤微生物群落产生人为干扰，从而偏离对土壤真实响应的准确捕捉。其他已报道的实验室增温方法在可控性和可重复性方面大多较差。本实验方案由于操作简便、温度模拟精度高且可重复性强、程序设置明确，以及能够在单个实验中整合多种温度变化情景，因而具有明显优越性。高精度的温度控制可行性将使研究人员能够探索多种温度变化情景。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 mL注射器	Fisher Scientific	14-826-13	用于土壤呼吸测定
Composer软件	TestEquity	型号 #107	用于设置培养温度
环境培养箱	TestEquity	型号 #107	用于土壤培养
环境气体分析仪	PP Systems	EGM5	用于土壤呼吸测定
滤纸	Fisher Scientific	1005-125	用于土壤培养
梅森罐	Ball	15381-3	用于土壤培养
烘箱	Fisher Scientific	15-103-0520	用于土壤水分测定
塑料拉链密封储存袋	Fisher Scientific	09-800-16	用于土壤采集
酶标仪	Molecular devices	FilterMax F5	用于土壤胞外酶分析
R软件	The R Foundation	R版本 4.1.3 (2022-03-10)	用于统计计算
冰箱/冷冻柜	Fisher Scientific	13-991-898	用于土壤储存
螺丝刀	Fisher Scientific	19-313-447	用于土壤采集
Sharpie记号笔	Fisher Scientific	50-111-3135	用于土壤采集
筛子	Fisher Scientific	04-881G	用于筛分土壤样品
硅胶隔垫	Duran Wheaton kimble	224100-070	用于土壤培养所用的梅森罐
土壤钻	AMS	350.05	用于土壤采集
SpecWare软件	Spectrum Technologies	WatchDog E2700 (3340WD2)	用于设置温度采集间隔
温度探头	Spectrum Technologies	WatchDog E2700 (3340WD2)	用于土壤温度测量
总有机碳/总氮分析仪	Shimadzu	TOC-L系列	用于土壤微生物生物量分析