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方法文章

体外 单液滴乳液的消化 通过 模拟胃肠液的多步亚相交换

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DOI：

10.3791/64158

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2022年11月18日

 ,  ,  , 
1Department of Applied Physics, Faculty of Sciences, Campus de Fuentenueva, University of Granada, 2Department of Physical Chemistry, Faculty of Pharmacy, Campus de Cartuja, University of Granada, 3Department of Software Engineering, School of Computer and Telecommunication Engineering, Campus de Aynadamar, University of Granada

本文内容

摘要

一种采用多相下层溶液交换的悬滴表面膜天平，被昵称为OCTOPUS，可通过将原始体相溶液依次替换为模拟胃肠液，从而模拟消化环境。该模拟 体外 通过记录来监测消化过程 原位 消化界面层的界面张力。

摘要

乳液目前正被用于包封和递送营养物质与药物，以应对多种胃肠道疾病，如肥胖、营养强化、食物过敏和消化系统疾病。乳液能否实现预期功能，例如到达胃肠道内的特定部位、抑制或延缓脂质水解、或促进消化，最终取决于其在胃肠道中对酶降解的敏感性。在水包油乳液中，脂滴被界面层所包围，乳化剂通过稳定乳液并保护包封物质发挥作用。实现乳液消化性的定制化不仅取决于其初始组成，还需要监测其界面层在经历胃肠道消化不同阶段时的演变过程。采用多相下层交换的悬滴表面膜平衡系统可模拟 体外 通过应用定制的静态消化模型，研究油相中单个水相液滴内乳液的消化过程。通过将原始液滴本体溶液与模拟胃肠道各区段/阶段生理条件的人工介质进行亚相交换，模拟物质在胃肠道中的转运过程。实时记录界面张力的动态演变 原位 在整个模拟胃肠道消化过程中，分别在口腔、胃和小肠消化阶段后测定消化界面上的机械性能，如界面扩张弹性与黏度。各消化阶段的消化液组成可根据特定消化条件进行调整，包括胃肠道病理状态及婴幼儿消化液特性。通过该方法可识别影响蛋白质水解和脂质水解的具体界面作用机制，从而为通过乳液界面工程调控消化过程提供技术手段。所得结果可用于设计具有特定功能的新型食品基质，例如低致敏性、可控能量摄入以及降低消化率等特性。

引言

了解脂肪的消化过程（涉及乳液消化）对于合理设计具有特定功能的产品至关重要1。脂肪消化的底物是乳液，因为脂肪在摄入后会通过口腔和胃中的机械作用以及与生物表面活性剂的混合而发生乳化。此外，人类摄入的大部分脂肪本身就已处于乳化状态（如乳制品），而对于婴儿或部分老年人而言，这甚至是唯一的摄入形式。因此，设计具有特定消化特性的乳液基产品在营养学中具有重要意义1。此外，乳液还可用于包封并递送营养素、药物或亲脂性生物活性物质2，以应对不同的胃肠道状况，例如肥胖3、营养强化、食物过敏以及消化系统疾病。在水包油乳液中，脂质液滴被乳化剂的界面层所包围，这些乳化剂包括蛋白质、表面活性剂、聚合物、颗粒及其混合物4。乳化剂的作用具有双重性：一是稳定乳液5，二是保护和运输包封的化合物至特定作用部位。实现乳液的可控消化性不仅取决于其初始组成，还需要监测其在胃肠道中转运过程中界面的持续动态变化（图1）。

婴儿消化示意图；食物基质、消化机制、营养强化、过敏。
图 1：应用乳液界面工程应对主要胃肠道状况的示意图。 请点击此处查看此图的放大版本。

脂质消化最终是一种界面过程，因为它需要脂肪酶（胃脂肪酶或胰脂肪酶）通过乳化脂滴的油-水界面层吸附到界面上，从而接触并水解油相中的甘油三酯，生成游离脂肪酸和单酰基甘油6。这一过程如图2所示。在胃中，胃脂肪酶与胃蛋白酶及磷脂竞争油-水界面（图2，胃消化阶段）。随后，在小肠中，胰脂肪酶/辅脂酶与胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶、磷脂、胆盐及消化产物竞争界面。蛋白酶可改变界面覆盖状态，从而抑制或促进脂肪酶的吸附；而胆盐具有很强的表面活性，能够取代大部分残留乳化剂，促进脂肪酶的吸附（图2，肠消化阶段）。最终，脂解反应的速率和程度取决于初始或胃消化后乳液的界面特性，例如界面层的厚度、分子间/分子内连接方式以及静电和空间位阻相互作用。因此，监测消化过程中界面层的演变，可为识别影响脂肪酶吸附及脂质消化的界面机制与事件提供一个实验平台。

胃和肠道消化示意图，乳化脂质分解，消化酶作用。
图 2：胃肠道脂质消化中界面作用的示意图。 胃相期间，胃蛋白酶水解改变了界面组成，同时胃脂肪酶水解甘油三酯。在小肠中，胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶进一步水解界面膜，而脂解过程则通过胆盐/脂肪酶的吸附、甘油三酯的水解以及脂解产物在胆盐胶束/复合物中的增溶和解吸而进行。请点击此处查看该图的放大版本。

格拉纳达大学（UGR）采用了一种专利技术——同轴双毛细管，用于实现体相溶液的亚相交换7。用于固定悬滴的毛细管由两个同轴排列的毛细管组成，分别独立连接至双通道微量注射器的两个通道。每个微量注射器可独立操作，从而通过流动实现液滴内容物的更换7。因此，亚相交换过程包括：利用内层毛细管以相同的流速注入新溶液，同时利用外层毛细管抽出体相溶液。该过程可在不扰动界面面积或液滴体积的情况下完成体相溶液的替换。此后，该方法进一步升级为多步亚相交换，可对液滴的体相溶液连续进行多达八次的亚相更换8。这使得可在脂质介质中悬浮的单个水相液滴内模拟消化过程，通过依次更换为模拟不同消化腔室（口腔、胃、小肠）的人工消化液来实现。整个装置示意图见图3，其中包含各组件的详细结构。微量注射器中的注射器连接至八个通道阀，每个通道连接一个微量离心管，管中装有图2所述成分的人工消化液。

显微注射装置，包含光源、微操纵器、CCD 相机，用于精确的细胞操作。
图 3：OCTOPUS 系统的总体结构示意图，展示所有组件。 包括 CCD 相机、显微镜、微操纵器、恒温控制的细胞腔室，以及通过两个独立连接管连接至双通道微注射仪的双毛细管；双通道微注射仪的两个注射器分别连接八通阀。每个注射器连接一根毛细管、四个样品用微量离心管和一个排液通道。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4A 展示了如何通过双毛细管的亚相交换将每种人工消化液注入悬滴中。每种消化成分详见 图2 可同时或依次应用，模拟通过胃肠道的过程。人工消化液含有不同的酶和生物表面活性剂，可改变初始乳化剂的界面张力，如图示所示。 图4B. 软件 DINATEN（参见 材料清单），同样由格拉纳达大学（UGR）开发，可实时记录初始界面层被消化过程中界面张力的变化 体外此外，每次消化阶段后，通过向已稳定的界面层施加周期性的体积/界面面积振荡，并记录界面张力的响应，计算界面层的膨胀弹性。振荡的周期/频率和振幅可进行调节，利用 CONTACTO 软件进行图像处理，可获得膨胀流变学参数。8.

酶消化过程；界面张力图；蛋白质水解，脂肪水解，脱附装置。
图4消化谱示例。 (A通过将不同溶液依次置换进入悬滴，使初始乳化剂层暴露于置于微量离心管中的人工消化介质。B) 初始乳化剂在消化过程中界面张力（y轴）随时间（x轴）变化的总体趋势 体外 通过人工培养基中的各种酶/生物表面活性剂作用。最后用普通肠液进行亚相置换，以测定消化后脂质在混合胶束中的溶解度及其解吸程度。 请点击此处以查看此图的放大版本。

本研究介绍了用于测量的通用实验方案 体外 使用悬滴设备消化界面层9初始界面层依次经受模拟通过胃肠道条件的处理，如图所示。 图2将含有不同溶液的微量离心管中的各消化介质通过置换下相的方式注入悬滴中（图4A）。这些培养基的组成可根据拟评估的胃肠道条件（即胃/肠蛋白水解/脂肪水解）进行定制，从而可测量累积效应及协同作用10用于模拟各消化阶段消化过程的实验条件遵循INFOGEST发布的国际共识方案，其中详细说明了pH值、电解质和酶的用量11基于悬滴法的实验装置可用于记录界面张力 原位 在整个模拟消化过程中。每个消化步骤结束时，计算界面层的膨胀流变学特性。通过这种方式，每种乳化剂均提供一个消化谱，用以说明消化后界面的性质，如图所示 图4B这可以提取出关于其对消化过程不同阶段敏感性或抗性的结论。通常，人工消化介质包含酸性/碱性 pH 环境、电解质、蛋白酶（胃和肠）、脂肪酶（胃和肠）、胆盐和磷脂，这些成分分别溶解于相应的消化液（胃液或肠液）中。 图 4B 展示了乳化剂界面张力演化的典型特征，首先经历蛋白酶作用，随后受到脂肪酶作用。通常情况下，界面层的蛋白水解会促使水解肽段脱附，从而导致界面张力升高9,12，而脂解作用由于胆盐和脂肪酶的吸附，导致界面张力急剧下降13. 最终用肠液进行一次亚相置换，可去除体相溶液中未吸附/未消化的物质，并促进可溶性化合物的解吸以及消化后脂质在混合胶束中的增溶。这一过程通过记录到的界面张力升高得以量化（图 4B).

总之，通过悬滴实验设计模拟 体外 单个液滴中的消化过程可实现对累积效应和协同作用的测量，因为消化过程按顺序作用于初始界面层10每种消化液的组成均可根据消化条件的特殊性进行调整，包括胃肠道病理状况或婴儿消化液的特点。14然后，可通过乳液界面工程调控消化过程，其依据是识别影响蛋白质水解和脂质水解的界面作用机制。所得结果可应用于设计具有定制功能的新型食品基质，例如低致敏性、可控能量摄入以及降低的消化率。15,16,17,18,19.

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方案

1. 表面科学研究中所用全部玻璃器皿的清洗流程

  1. 用浓清洁液（见材料表）按10%比例稀释于水中，彻底刷洗玻璃器皿。
  2. 依次用自来水、丙醇、蒸馏水和超纯水充分冲洗。在干燥柜中干燥后，存放于密闭柜中备用。

2. 样品制备

  1. 根据 INFOGEST 标准化方案11,20 制备人工消化介质（参见材料表）。具体细节见表1，并根据界面实验的要求进行少量调整，以防止表面活性物质污染和样品稀释（1:10）10。
  2. 按照以下步骤制备乳化剂溶液。
    1. 在初始缓冲液（表1）中制备0.01 L浓度为（1 kg·L−1）的乳化剂或乳化剂混合物溶液（参见材料表），并在轻微搅拌下静置过夜。
    2. 稀释至0.1 kg·L−1（或按需稀释）以饱和界面；在恒定界面面积下吸附1小时后，界面张力达到准平台期，参照先前发表的报告21。
    3. 使用前继续在轻微搅拌下保存15分钟。
  3. 纯化油相。
    1. 在大烧杯中按2:1 w/w的比例制备植物油（葵花籽油、橄榄油、三油酸甘油酯等）与偏硅酸镁树脂的混合物（参见材料表），并在轻微机械搅拌下持续至少3小时。
    2. 将混合物在商用离心机中以8,000 x g离心30分钟，室温操作（参见材料表）。
    3. 在真空条件下使用注射器滤器（孔径0.2 µm）过滤油混合物（参见材料表）。将滤液储存于洁净的棕色瓶中，密封并通入氮气，直至使用。

OCTOPUS 的校准与清洁

  1. 通过设置清洗程序，用超纯水冲洗所有管路，清洗两个注射器以及通过毛细管（6/4号阀门）和外部出口（8号阀门，蓝色）的所有阀门。在左侧对话框中点击clean按钮执行此操作（补充图1A）。
  2. 通过形成水滴并实时测量5分钟，检测室温下水的表面张力7（补充图1B, C）。
    1. 在左侧对话框中将密度差设置为空气-水（0.9982 kg·L−1），见补充图1B。
  3. 将洁净的比色皿（光学玻璃）中加入0.002 L洁净的植物油，并将其放入恒温池中的比色皿支架内（图3）。
  4. 设置恒温装置，使温度在37 °C下达到平衡。
  5. 检测室温下水-油界面的界面张力7。
    1. 在左侧对话框中将密度差设置为植物油-水（橄榄油：0.800 kg·L−1）（补充图1C）。
    2. 以0.5 µL·s−1的速率注入40 µL，并在注射过程中每秒实时测量一次，直至注射结束。这是一个简单的动态过程（补充图1B, D）。
    3. 在数据表中绘制界面张力随液滴体积变化的曲线。
    4. 确认液滴体积范围所提供的界面张力值与液滴体积无关。绘制界面面积随液滴体积变化的曲线。
    5. 编程设置一个包含两个步骤的过程（补充图1B和补充图2A），步骤如下：
      1. 使用内注射器注入处于该恒定界面张力范围内的某一液滴体积。
      2. 将界面面积维持在步骤3.5.4中选定的数值，并记录5分钟内的界面张力7。

4. 为每个消化步骤在DINATEN中编程一个实验流程

注意：有关工艺参数，请参见补充图1B。

  1. 执行初始控制。
    1. 进行液滴形成时，将 10 µL (±5 µL) 乳化剂溶液注入毛细管（阀 6）中（补充图 2A）。
    2. 在恒定界面面积21为 20 mm2 (±10 mm2) 的条件下记录 1 小时的吸附过程（补充图 2B）。
    3. 记录膨胀流变学8（补充图 2C）。
      1. 设定振荡振幅为 1.25 µL，周期为 10 s。
      2. 在选定的界面面积（步骤 4.1.2）下记录 10 s 的吸附过程。
      3. 在不同周期下重复步骤 4.1.3：5 s、20 s、50 s 和 100 s。
  2. 记录胃消化过程。
    1. 在选定的界面面积下记录 10 s 的吸附过程21。
    2. 使用阀 2 中的液体（sSGF）和胃酶进行亚相交换7（表 1）（补充图 2D）。
      1. 从阀 2 吸取左端注射器液体。以 5 µL·s−1 的速度通过左注射器将 125 µL 注入阀 6-毛细管中。
      2. 以 5 µL·s−1 的速度用右注射器从毛细管中抽出 125 µL。将右注射器卸载至阀 8 出口。重复步骤 4.2.2.1–4.2.2.2 共 10 次，以确保完全交换。
    3. 在步骤 4.1.2 中选定的界面面积下记录 1 小时的吸附过程21（补充 图 2B）。
    4. 记录膨胀流变学8（补充图 2C）。
      1. 设定振荡振幅为 1.25 µL，周期为 10 s。
      2. 在步骤 4.1.2 中选定的界面面积下记录 10 s 的吸附过程。在不同周期下重复：5 s、20 s、50 s、100 s。
  3. 记录肠消化过程。
    1. 在步骤 4.1.2 中选定的界面面积下记录 10 s 的吸附过程21（补充图 2B）。
    2. 使用阀 3 中的液体（sSIF）和肠酶/胆盐/磷脂进行亚相交换7（表 1）（补充图 2D）。
      1. 从阀 2 吸取左端注射器液体。以 5 µL·s−1 的速度通过左注射器将 125 µL 注入阀 6-毛细管中。以 5 µL·s−1 的速度从毛细管中用右注射器抽出 125 µL。
      2. 将右注射器卸载至阀 8 出口。重复步骤 4.3.2.1–4.3.2.2 共 10 次，以确保完全交换。
    3. 在步骤 4.1.2 中选定的界面面积下记录 1 小时的吸附过程21。
    4. 记录膨胀流变学8（补充图 2C）。
      1. 设定振荡振幅为 1.25 µL，周期为 10 s。
      2. 在步骤 4.1.2 中选定的界面面积下记录 10 s 的吸附过程。
      3. 在不同周期下重复：5 s、20 s、50 s、100 s。
  4. 按以下步骤记录解吸过程。
    1. 在步骤 4.1.2 中选定的界面面积下记录 10 s 的吸附过程21（补充图 2B）。
    2. 使用阀 5 中的液体（sSIF）进行亚相交换7（表 1，补充图 2D）。
      1. 从阀 5 吸取左端注射器液体。以 5 µL·s−1 的速度通过左注射器将 125 µL 注入阀 5-毛细管中。
      2. 以 5 µL·s−1 的速度从毛细管中用右注射器抽出 125 µL。将右注射器卸载至阀 8 出口。重复步骤 4.4.2.1–4.4.2.2 共 10 次，以确保完全交换。
    3. 在步骤 4.1.2 中选定的界面面积下记录 1 小时的吸附过程21（补充图 2B）。
    4. 记录膨胀流变学8（补充图 2C）。
      1. 保持振幅为 1.25 µL，周期为 10 s。
      2. 在步骤 4.1.2 中选定的界面面积下记录 10 s 的吸附过程。
      3. 在不同周期下重复步骤 4.4.4：5 s、20 s、50 s、100 s。

5. 实验设置

  1. 将人工消化介质加入微量离心管中，并通过相应的管路将每根管连接至对应的阀门。
  2. 通过从阀门2、阀门3、阀门4和阀门5依次向外部出口（阀门8）清洗的方式，填充阀门2-5中的管路（补充图1A）。
  3. 通过从阀门1向毛细管方向反复清洗5次，填充阀门1中的管路。
  4. 将毛细管置于油相中。使用阀门1加载左侧注射器（初始溶液，表1）。
  5. 依次进行步骤4.1-初始、4.2-胃相、4.3-肠相和4.4-解吸，并在每个过程结束时保存数据。

6. 使用图像处理软件 CONTACTO 计算膨胀流变参数8

注意：详见 Maldonado-Valderrama 等人8。

  1. 加载对应于给定频率和振幅下面积振荡的图像（补充图 3A）。
  2. 点击 流变学（补充图 3B），获取扩张流变参数（补充图 3C）。
  3. 将结果复制粘贴到数据电子表格中。

7. 绘制实验结果

  1. 在消化过程的每一步中，通过将上一步的时间数据累加，重新计算时间列。
  2. 针对所用消化过程的每一步，绘制界面张力随累积时间的变化曲线。
  3. 绘制每一步结束时获得的最终界面张力/膨胀弹性模量和黏度随消化阶段的变化关系：初始阶段、胃消化阶段、十二指肠消化阶段和解吸阶段。

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结果

本节展示了使用OCTOPUS测得的不同消化谱示例。模拟消化谱的一般形态如图4B所示。消化谱中通常以界面张力随时间的变化来表示。不同阶段/消化步骤以不同颜色表示。第一阶段形成初始层，对应乳化剂或蛋白质/表面活性剂/聚合物的吸附阶段，具体取决于不同情况。随后，通过下层相交换，将不同的消化液注入含有新培养基的体相溶液中。新的下层相会引起初始乳化剂层界面张力的变化，并影响每个消化步骤结束时测得的膨胀流变学性质。消化过程最多可包含八个消化步骤。

表面张力随时间变化图；人血清白蛋白吸附/解吸，胃蛋白酶作用，脂肪分解分析。
图5

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讨论

本文描述了一种用于测量的通用实验方案 体外 利用悬滴设备消化界面层。通过调节基于INFOGEST的消化缓冲液的组成，该方案可针对实验的具体需求进行优化。11,20 协调一致的实验方案，以方便与文献进行比较。消化酶和生物表面活性剂可以单独、依次或同时添加。后一种方式需谨慎操作，因为界面层的饱和会通过仅提供极低的界面张力而阻碍不同的界面现象，并可能导致液滴脱落。为了能够分析每种消化成分的作用，不同的消化酶被依次以不同浓度添加。通过这种方式，可对各组分的作用进行分析和系统化，并通过顺序添加评估其协同效应。此外，为防止液滴脱落，部分浓度溶液需进行稀释9所得结果不能直接外推至乳化体系，因为实验条件针对简化体系进行了调整。然而，界面张力的变化反映了界面层在消化过程中界面覆盖程度的演变。10同样，随着消化过程的进行，膨胀流变学的演变可提供有关界面力学性质的一些信息。9这些结果...

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披露

作者声明，他们不存在任何已知的可能影响本文所报告工作的竞争性经济利益或个人关系。

致谢

本研究由项目 RTI2018-101309-B-C21 和 PID2020-631-116615RAI00 资助，资助机构为 MCIN/AEI/10.13039/501100011033 以及"ERDF A way of making Europe"。本工作得到了格拉纳达大学（西班牙）生物胶体与流体物理研究组（参考编号：PAI-FQM115）的部分支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
牛胰α-糜蛋白酶Sigma-AldrichC4129酶
β-乳球蛋白Sigma-AldrichL0130乳化剂
牛血清白蛋白Sigma-Aldrich9048-46-8乳化剂
CaCl2Sigma-Aldrich10043-52-4电解质
离心机Kronton instrumentsCentrikon T-124用于分离油和树脂
柑橘果胶Sigma-AldrichP9135乳化剂
猪胰辅脂酶SigmaC3028酶
CONTACTO格拉纳达大学（UGR）https://core.ugr.es/dinaten/, 最后访问时间：2022年7月18日
DINATEN格拉纳达大学（UGR）https://core.ugr.es/dinaten/, 最后访问时间：2022年7月18日
胃脂肪酶LipolytechRGE15-1G酶
人血清白蛋白Sigma-Aldrich70024-90-7乳化剂
INFOGESThttp://www.proteomics.ch/IVD/
猪胰脂肪酶，II型Sigma-AldrichL33126酶
偏硅酸镁树脂Fluka1343-88-0用于纯化油的树脂
Micro 90International productsM-9051-04清洁剂
NaClSigma7647-14-5电解质
NaH2PO4Scharlau10049-21-5用于配制缓冲液
OCTOPUSProducciones Científicas y Técnicas S.L. (Gójar, Spain)配备多相交换系统的悬滴装置
橄榄油Sigma-Aldrich1514油
猪胰酶SigmaP7545-25 g酶
胃蛋白酶Sigma-AldrichP6887酶
Pluronic F127SigmaP2443乳化剂
Pluronic F68SigmaP1300乳化剂
脱氧胆酸钠Sigma胆盐
甘氨脱氧胆酸钠SigmaC9910胆盐
牛磺脱氧胆酸钠Sigma86339胆盐
注射器滤器Millex-DPSLGP033R 孔径0.22 µm 聚醚砜注射器滤器
胰蛋白酶Sigma-AldrichT1426酶

参考文献

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体外 单液滴乳液的消化 通过 模拟胃肠液的多步亚相交换
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