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通过捕获式 Hi-C 解析高分辨率 3D 染色质结构 via Capture Hi-C

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DOI：

10.3791/64166

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2022年10月14日

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1EMBL: European Molecular Biology Laboratory, 2Institut Curie, 3Agilent Technologies, 4Genmab BV, 5Collège de France

本文内容

摘要

本方案描述了染色质捕获结合高通量测序（Capture Hi-C）方法，用于在高分辨率下表征数兆碱基大小的靶向基因组区域的三维结构，包括拓扑关联结构域（TADs）的边界以及调控元件与其他DNA序列元件之间的长程染色质相互作用。

摘要

基因组的空间组织在其功能和调控中发挥重要作用，涉及转录、复制、重组和修复等多种生物学过程。因此，明确基因组拓扑结构与功能之间的精确因果关系至关重要，也正日益成为深入研究的热点。染色体构象捕获技术（3C）通过测量基因组任意区域之间的相互作用频率，可推断染色质的三维结构。本文介绍了一种快速且简便的Capture Hi-C实验方案，该方法基于3C技术，通过靶向富集策略，能够在高分辨率下解析长达兆碱基规模的基因组靶区的等位基因特异性三维结构。在Capture Hi-C中，靶区域在后续高通量测序之前，由一组生物素标记的探针进行富集捕获，从而在提高技术时效性和经济性的同时，实现更高的分辨率和等位基因特异性。为展示该方法的优势，我们将Capture Hi-C应用于小鼠X染色体失活中心(Xic)，即X染色体失活（XCI）的核心调控位点。

引言

线性基因组包含了一个生物体进行胚胎发育并在成年期存活所需的所有信息。然而，指导遗传上完全相同的细胞执行不同功能，是精确调控在特定背景下（包括不同组织和/或发育阶段）使用哪些信息的基础。人们认为，基因组的三维结构通过促进或阻止在线性基因组中相距可达数百千碱基的调控元件之间的物理相互作用，参与了基因活性的这种精确时空调控（综述见1,2,3）。在过去的20年中，我们对基因组折叠与功能之间相互关系的理解迅速加深，这主要得益于染色体构象捕获技术（3C）的发展（综述见4,5,6,7）。这些方法通过检测基因组任意区域之间相互作用的频率，依赖于细胞核内空间上邻近的DNA序列的连接。最常见的3C实验流程首先使用甲醛等交联剂对细胞群体进行固定。接着，使用限制性内切酶消化交联的染色质，尽管也有研究采用MNase进行消化8,9。消化完成后，空间上邻近的游离DNA末端被重新连接，随后解除交联。此步骤产生3C“文库”或“模板”，即一种混合的杂交片段库，其中在细胞核内三维空间上邻近的序列更有可能被连接到同一DNA片段中。对这些杂交片段进行后续定量分析，可推断在线性基因组中相距数千个碱基对的基因组区域在三维空间中的构象。

已开发出多种不同的方法来表征3C文库，这些方法在所分析的连接片段子集以及用于下游定量的技术方面均有所不同。原始的3C方案依赖于选择两个感兴趣的区域，并通过PCR定量它们之间的“一对一”相互作用频率10,11。4C方法（环状染色体构象捕获）用于测量一个特定基因座（即“视角位点”）与基因组其余部分之间的相互作用（“一对全”）12,13,14。在4C中，3C文库经历第二轮酶切和重新连接，以生成小的环状DNA分子，随后使用特异性针对视角位点的引物进行PCR扩增15。5C技术（染色体构象捕获碳拷贝）能够表征更大区域内染色质的三维相互作用，从而揭示该区域内高级染色质折叠的信息（“多对多”）16。在5C中，3C文库与一组覆盖限制性酶切位点的寡核苷酸探针杂交，随后通过通用引物进行多重PCR扩增15。在4C和5C中，最初使用微阵列对有信息价值的DNA片段进行定量，之后转为使用高通量测序（NGS）17,18,19。这些策略可用于研究特定目标区域，但无法用于全基因组范围的相互作用图谱绘制。这一目标可通过Hi-C实现，Hi-C是一种基于3C的高通量策略，通过对3C模板进行大规模并行测序，无偏倚地在全基因组水平上表征染色质折叠（“全对全”）20。Hi-C方案包括在酶切后的片段末端引入生物素标记残基，随后利用链霉亲和素磁珠富集连接产物，以提高连接片段的回收率20。

Hi-C 技术揭示了哺乳动物基因组在三维细胞核中具有多层次的结构组织。在兆碱基尺度上，基因组被划分为活性染色质和非活性染色质区域，分别称为 A 和 B 区室20,21。后续研究还表明，存在由不同染色质状态和活性状态代表的进一步亚区室22。在更高分辨率下，基因组被进一步划分为亚兆碱基大小的自相互作用结构域，称为拓扑关联结构域（topologically associating domains, TADs），该结构域最初通过人类和小鼠基因组的 Hi-C 和 5C 分析被发现23,24。与具有组织特异性变化的区室不同，TADs 通常较为保守（尽管存在许多例外情况）。重要的是，TAD 边界在不同物种间具有保守性25。在哺乳动物细胞中，TADs 常包含共享相同调控环境的基因，并已被证明代表一种结构框架，有助于基因共调控，同时限制与邻近调控区域的相互作用（综述见3,26,27,28）。此外，在 TADs 内部，由于黏连蛋白挤出环底部的 CTCF 位点所介导的相互作用，可能增加启动子-增强子或增强子-增强子之间相互作用的概率（综述见29）。

在Hi-C技术中，可以在1 Mb至40 kb的分辨率下检测到染色质区室（compartments）和拓扑关联结构域（TADs），但通过提高分辨率，还可进一步表征更小尺度的染色质相互作用，例如在5–10 kb尺度上远端元件之间的成环互作。然而，为了高效检测此类成环结构而提高Hi-C分辨率，需要显著增加测序深度，从而导致测序成本大幅上升。若分析还需实现等位基因特异性，则这一问题将更加突出。实际上，分辨率提高X倍，所需的测序深度需增加X2倍，这意味着高分辨率且等位基因特异性的全基因组研究方法可能因成本过高而难以实施30。

为了在保持高分辨率的同时提高成本效益和可负担性，可在下游测序之前，通过互补的生物素标记寡核苷酸探针与全基因组范围的 3C 或 Hi-C 文库杂交，将目标兴趣区域从文库中物理性地富集下来。这类靶向富集策略被称为 Capture-C 方法，可实现对遍布基因组的数百个靶位点相互作用的检测（例如启动子捕获（PC）Hi-C；下一代（NG）Capture-C；低起始量（LI）Capture-C；细胞核滴定（NuTi）Capture-C；Tri-C）31,32,33,34,35,36,37,38,39,40，或跨越长达数兆碱基区域的相互作用（例如 Capture Hi-C；杂交捕获 Hi-C（Hi-C2）；Tiled-C）41,42,43。基于捕获的方法中存在两个可变方面：（1）生物素化寡核苷酸的性质与设计（例如 RNA 或 DNA，单个寡核苷酸用于捕获分散的基因组靶点，或多个寡核苷酸拼接覆盖某一特定区域）；（2）用于富集靶标的模板，可以是 3C 或 Hi-C 文库本身，后者由从 3C 文库中富集得到的生物素化限制性酶切片段组成。

本文描述了一种基于从3C文库中富集目标互作的Capture Hi-C实验方案。该方案依赖于定制的生物素化RNA探针平铺阵列的设计，从3C文库制备到高通量测序可在1周内完成。该方法快速、简便，能够在5 kb分辨率下表征兆碱基大小的目标区域的高级别三维基因组结构，同时在时间效率和成本效益方面优于其他3C类方法。本Capture Hi-C方案已应用于X染色体失活（XCI）的主调控位点——X失活中心（Xic），该区域包含Xist非编码RNA。此前，Xic已接受过广泛地结构与功能研究（综述见44,45）。在哺乳动物中，XCI通过转录沉默雌性细胞（XX）中两条X染色体之一的绝大部分基因，以平衡雌雄（XY）之间X连锁基因的剂量差异。Xic已成为研究三维基因组拓扑结构及其与基因调控关系的强大且被广泛认可的标准位点44。在小鼠胚胎干细胞（mESCs）中对Xic进行的5C分析促成了拓扑相关结构域（TADs）的发现与命名，首次揭示了基因组拓扑分区与基因共调控的功能意义24。后续研究表明，Xic的拓扑结构在Xist基因的适时上调及XCI的正常发育时序中起关键作用46，并且最近在Xic区域内还发现了可影响TAD内及TAD间基因活性的未知顺式调控元件47,48,49。将Capture Hi-C应用于跨越Xic的小鼠X染色体上约3 Mb的区域，展示了该方法在高分辨率下解析大规模染色质折叠结构的强大能力。本文提供了从目标区域每个DpnII限制性酶切位点处设计生物素化探针阵列，到全基因组3C文库构建、目标互作的杂交与富集，以及后续数据分析的详细且易于操作的实验流程。同时概述了适当的质控指标和预期结果，并结合现有类似方法，讨论了该技术的优势与局限性。

方案

本研究中使用的小鼠胚胎干细胞（mESCs）是根据法国居里研究所（巴黎）的动物护理指南51，通过将一只 TX/TX R26rtTA/rtTA 雌鼠50 与一只 Mus musculus castaneus 雄鼠杂交获得的。

1. 探针设计

  1. 设计一组覆盖目标区域的生物素标记探针（120个核苷酸长度的RNA寡核苷酸）。
    1. 以重叠的寡核苷酸对目标区域进行铺排，使目标区域内每个序列平均被两个独特的探针覆盖（2倍覆盖）（图1).
    2. 排除探针覆盖范围中的重复序列，以避免非特异性相互作用的富集。
      ​注意：为了最大程度富集具有信息量的连接片段，针对目标区域（ChrX: 102,475,000-105,475,000）内每个 DpnII 限制性位点上下游各 300 bp 的范围进行了界定，并基于 SureDesign 平台的 SureSelect DNA 目标富集技术，设计了 28,913 个生物素标记的探针。52根据该策略，每条寡核苷酸中最多允许含有40个碱基的重复序列，以最大限度减少非特异性相互作用的富集。探针阵列由Agilent公司合成。此处使用DpnII作为限制性内切酶基于两个原因：（1）它是一种四碱基切割酶， routinely用于多种基于3C的方法53；（2）与其他测试过的限制性内切酶相比，它能够最大限度地提高在切割位点附近捕获具有信息量的单核苷酸多态性（SNPs）的几率 计算机模拟 本研究中使用的F1杂交系（C57BL/6J × CAST/EiJ）。

2. 实验步骤

  1. 细胞制备
    1. 将适量的细胞接种至一个或多个细胞培养板中，以获得总数≥5 x 10⁶的细胞7 固定当天的细胞
      注意：本研究使用了小鼠胚胎干细胞（mESCs）。mESCs 接种于经明胶包被（0.1% 明胶溶于 1× PBS，37 °C、5% CO2 培养箱中过夜）的细胞培养板中，培养基为含 2i + LIF 及批次验证的胎牛血清的 mESCs 培养基（DMEM，15% FBS，0.1 mM β-巯基乙醇，1,000 U/mL−1 白血病抑制因子（LIF），CHIR99021（3 µM）和 PD0325901（1 µM））。对于该细胞类型，一个 80% 汇合度的 10 cm 培养皿约含有 2 × 107 细胞
    2. 额外准备一个细胞培养板用于细胞计数。
      注意：可使用较小的细胞培养板以减少培养基用量。在此情况下，需相应调整接种到较小培养板中的细胞数量（例如，10 cm 培养板的接种细胞数应为 15 cm 培养板的三分之一）。
  2. 甲醛固定
    1. 估算需要交联的细胞总数。
      1. 在开始交联反应之前，使用胰蛋白酶消化专用于细胞计数的对照培养板中的细胞，并根据自动细胞计数仪的制造商说明，通过该仪器对细胞进行计数。
      2. 加入活力染色（例如台盼蓝）以确定活细胞的百分比54根据此细胞计数，估算用于交联处理的培养皿（板）中细胞的总数。
    2. 从用于交联的培养板中移除培养基，替换为适量的固定液（含2%甲醛的细胞培养基）。10 cm培养板使用10 mL固定液（例如，15 cm培养板使用约20 mL）。
      注意：加入固定液的精确体积。若无法对贴壁细胞进行固定，可将此步骤调整用于经胰蛋白酶消化的细胞，并在50 mL锥形离心管中加入30 mL固定液进行操作。甲醛使用期限不得超过1年，建议使用一次性小瓶装试剂。固定液使用前须恢复至室温（RT）。
      警告：甲醛具有危害性，须根据相应的健康与安全法规进行操作。
    3. 在摇床中于室温下轻柔混匀固定10分钟。
    4. 通过加入2.5 M甘氨酸-1x PBS将固定反应淬灭至终浓度0.125 M。在10 cm培养皿中加入530 µL 2.5 M甘氨酸-1x PBS至总体积10 mL（例如，在15 cm培养皿中加入1060 µL至总体积20 mL）。
      注意：如果细胞是在溶液中固定的，需用1590 µL的2.5 M甘氨酸-1x PBS淬灭固定反应。
    5. 室温孵育5分钟，轻轻振荡混匀。
    6. 将培养皿转移至冰上，同时在摇床上轻轻混匀，于冰上再孵育15分钟。
      注意：从此步骤开始，细胞必须始终置于冰上，缓冲液必须预先冰浴，以避免进一步交联。若需处理多块培养板，应转移至冷室操作。
    7. 将固定液倒入烧杯中，以快速处理细胞。
      注意：请根据相应的健康与安全法规处理含甲醛的液体废弃物。
    8. 用5 mL冷的0.125 M甘氨酸-1x PBS（15 cm培养皿使用8 mL）快速冲洗10 cm培养皿两次，以去除碎片和死细胞。将液体倒入烧杯中以快速处理并移除培养皿中的液体。
    9. 向10 cm培养皿中加入5 mL冰冷的0.125 M甘氨酸-1×PBS（15 cm培养皿加10 mL），用塑料细胞刮迅速刮下细胞。
    10. 使用血清移液管将细胞悬液转移至预冷的50 mL锥形离心管中。
    11. 用5 mL冰冷的0.125 M甘氨酸-1x PBS洗涤平板两次，并将细胞悬液加入锥形离心管中。
    12. 480 × g 离心 g 4 °C 下离心 10 分钟。
      注意：如果细胞是在溶液中固定的，需将细胞转移至预冷的锥形离心管中，在480 x g条件下离心沉淀 g 4 °C下孵育10分钟。将固定液倒入烧杯中弃去，用10 mL冷的0.125 M甘氨酸-1x PBS洗涤细胞3次。每次洗涤均需充分重悬细胞。
    13. 使用台式抽吸系统吸除上清液。按照每 1 × 10⁶ 个细胞加入 500 µL 1× PBS 的比例重悬细胞。7 使用P1000移液器轻轻吹打细胞悬液，上下吹吸以重悬细胞。为准确体积重悬细胞，请参考步骤2.2.1中获得的总细胞数估算值。
    14. 将500 µL细胞悬液分装至计算所需数量的1.5 mL微量离心管中（每管1 x 10⁶个细胞）7 细胞/管
    15. 480 × g 离心 g 4 °C 下离心 10 分钟。
    16. 使用台式抽吸系统去除上清液，并将细胞沉淀在液氮中速冻。将干燥的细胞沉淀于 -80 °C 保存。
      注意：样品可保存至少1年。
  3. 细胞裂解
    1. 将冻存的沉淀物置于冰上解冻。
    2. 在 H 中配制 1.5 mL 裂解缓冲液2每样品0：加入10 mM Tris-HCl（pH 8.0）、10 mM NaCl和0.2% NP40。
    3. 加入600 µL预冷的裂解缓冲液，冰上充分重悬。
    4. 冰上孵育15分钟，使细胞膨胀。
    5. 2655 × g 离心 g 在4 °C下离心5分钟，使用台式抽吸系统弃去上清液。
    6. 为去除碎片，将沉淀重悬于1 mL冷裂解缓冲液中，2655 x g离心 g 4 °C下离心5分钟，弃上清液。
    7. 再次短暂离心，2655 x g 在4 °C条件下，使用配有P200吸头的台式抽吸系统尽可能去除残留的上清液。
    8. 用 100 µL 0.5% (vol/vol) SDS 重悬。
    9. 在62 °C下于恒温混匀仪中孵育，以1400 rpm速度振荡10分钟。
    10. 加入 290 µL 的 H2加入50 µL 10% TritonX-100，充分混匀，避免产生气泡。
    11. 在37 °C下于恒温混匀仪中孵育，以1400 rpm速度振荡15分钟。
    12. 加入50 µL的10x DpnII缓冲液，轻轻翻转试管以混匀。
    13. 取50 µL未消化的DNA作为质控样本，放入单独的离心管中。切勿遗漏未消化的对照样品。
  4. DpnII 消化
    1. 加入10 µL DpnII高浓度酶（共500 U），通过倒置混匀。
    2. 将样品与未消化对照组置于37 °C的恒温混匀仪中孵育，以1400 rpm速度振荡混合 >4 h。
    3. 在当天结束时加入 10 µL 高浓度 DpnII（共 500 U）。
    4. 将样品与未消化对照组在37 °C、1400 rpm转速下振荡孵育过夜。
    5. 第二天开始时，向样品中加入10 µL DpnII高浓度酶（共500 U）。
    6. 将样品与未消化对照组置于37 °C的恒温混匀仪中，以1400 rpm振荡孵育4小时。
  5. 连接与交联逆转
    1. 将试管在65 °C、1400 rpm条件下孵育20分钟。
      注意：此时不要加入SDS。目的是保持细胞核的完整性，从而使连接反应在细胞核内进行，避免需要极低浓度条件。
    2. 将样品置于冰上冷却，时间不超过5-10分钟。为避免SDS析出，切勿将样品在冰上放置超过此时间。
    3. 取50 µL未连接的消化后DNA，置于另一管中用于质量控制。将未消化和未连接的对照样品于-20 °C保存。
      注意：切勿忘记取未连接的对照样品。
    4. 加入800 µL连接反应混合液：122 µL 10x连接酶缓冲液、8 µL T4连接酶（30 U/µL）和670 µL H₂O20.
    5. 16 °C 下孵育，以 1000 rpm 转速振荡过夜。
    6. 向样品中加入 7.5 µL 蛋白酶 K（20 mg/mL），向对照中加入 2 µL。
    7. 65 °C、1000 rpm 条件下孵育 4 小时。
  6. DNA纯化
    1. 将样品置于冰上转移至预冷的15 mL圆锥形离心管中，加入2 mL水、10.5 mL预冷的乙醇和583 µL 3 M NaAC。
      注意：额外添加的水旨在防止DTT被带入沉淀中。
    2. 向未消化且未连接的质控样本中加入 200 µL 冰冷的 EtOH、10.8 µL NaAC 和 1 µL 共沉淀剂。
    3. 在 -80 °C 下孵育至少 4 小时至过夜。
    4. 将15 mL离心管在2200 x g 4 °C 下孵育 45 分钟。
    5. 将1.5 mL对照管在20,500 x g 4 °C 下孵育 30 分钟
    6. 用 3 mL（样品）和 1 mL（对照）冰浴预冷的 70% EtOH 洗涤一次。
    7. 2200 x 离心 g （样品）或 20,500 × g （对照组）置于 4 °C 下 10 分钟。
    8. 小心移除乙醇，室温下晾干10–15分钟；切勿过度干燥。
    9. 将样品和对照分别重悬于 100 µL 和 20 µL 的 H2O 中。
    10. 加入1 µL RNaseA，在37 °C、1400 rpm振荡条件下孵育30分钟。
  7. 3C 模板制备的质量控制
    1. 使用高灵敏度DNA浓度测定用荧光计试剂盒对每个样本和对照进行定量。
    2. 在1%琼脂糖/1×TBE凝胶上每条泳道加样100–200 ng的各待测样本及对照样本。
    3. 通过比较对照组和3C模板的DNA片段大小差异，验证凝胶图像是否显示出预期结果，如图所示 图2A.
    4. 将样品和对照品在 -20 °C 下保存。
  8. 多重测序的杂交、捕获与样本处理
    1. 将生物素标记的RNA探针阵列与3C模板杂交，捕获目标连接片段，并根据本研究中用于双端多重测序的目标富集系统对样本进行测序前准备（参见 材料表）。按照制造商提供的说明书进行操作，同时引入以下细微修改：
      1. 制造商操作指南第2部分：样品制备
        1. 从3 µg基因组DNA起始，按照靶向富集的说明进行操作。
        2. 使用超声波破碎仪对DNA进行剪切，具体参数如下：10%占空比，强度4，200个循环/脉冲，持续130秒。每个捕获反应中，以4 µg 3C模板溶于130 µL水中作为起始材料，以确保获得足量产物，可用于后续实验中3 µg剪切后DNA的样本制备。
        3. 评估剪切后 DNA 的质量。按照高灵敏度方案，将 1 µL 剪切后的 DNA 在 DNA 生物分析仪上进行检测。预期片段大小分布在 150–700 bp 之间。图2).
        4. 使用固相可逆固定化（SPRI）磁珠纯化样品。向124 µL DNA样品中加入124 µL SPRI磁珠，按照制造商说明书进行1:1左侧片段大小选择，并用25 µL无核酸酶水洗脱。此纯化步骤可去除较短的片段，富集约300 bp的DNA片段图2).
          注意：此步骤中所用样本量和 SPRI 磁珠量已考虑在将样本转移至新管及在 Bioanalyzer 上进行质量控制过程中发生的体积损失。所有后续片段大小选择步骤均按照试剂盒生产商推荐的比例进行。SPRI 磁珠的 DNA 洗脱全程在室温下进行。
        5. 评估经片段大小筛选的剪切DNA质量。按照高灵敏度（HS）方案，将1 µL剪切后的DNA在DNA生物分析仪上进行检测。预期片段大小分布中，300 bp处富集程度最高。图2）。如果DNA剪切成功，则继续进行剪切后DNA的定量分析。
        6. 使用高灵敏度DNA浓度测定用荧光计试剂盒对剪切后的DNA进行定量。
          注意：如果DNA打断后获得的DNA产量低于 <3 µg，使用另外4 µg DNA进行第二轮DNA打断，并在第一次SPRI磁珠纯化步骤后合并打断的DNA样本，以获得总量为3 µg的打断DNA。
        7. 向经片段大小筛选并纯化的DNA样本（总量3 µg）中加入无核酸酶水，调整终体积至48 µL，随后按照试剂盒生产商的说明书进行末端修复反应。
        8. 连接成对末端接头后，根据试剂盒说明书进行5个循环的捕获前PCR扩增（PCR条件和引物信息由试剂盒提供）。
      2. 制造商方案第4部分：杂交与捕获
        1. 为了使制备的DNA样本与靶标特异性RNA探针杂交，将750 ng DNA样本稀释至终体积3.4 µL，使初始浓度为221 ng/µL。对于稀释体积较大的DNA样本，使用真空离心浓缩仪浓缩至终体积。真空离心浓缩（250 × g；对于重悬于10 µL中的样品，通常在≤45 °C条件下处理15–20分钟即可。在使用真空离心浓缩仪前，务必确保各样品的上样体积一致。
        2. 按照制造商说明，在65 °C下孵育杂交混合物16–18小时，加热盖温度设为105 °C。
      3. 制造商方案第5部分：多重测序的加索引与样本处理
        1. 根据制造商提供的说明，使用带索引的引物对捕获的文库进行12个循环的捕获后PCR扩增（PCR条件和引物信息在试剂盒中提供）。
  9. 下一代测序
    1. 为在同一张流动池上运行多个捕获型Hi-C文库，需制备等摩尔浓度的捕获文库混合物，并对每个文库测序100–120百万条读长。
    2. 若需进行等位基因特异性分析，应进行150 bp双端测序，以确保足够的SNP覆盖度。

3. 数据分析

  1. 应用 HiC-Pro 流程进行 Capture Hi-C 数据分析55。HiC-Pro 在处理的每个步骤中均提供质量控制，包括（图 3）：
    (i)参考基因组上的比对率，用于说明跨越连接位点的读段比例，以及成对读段和单端读段的数量。
    (ii)有效连接产物的比例以及无信息读段对（悬垂末端、自连接等）的比例。
    (iii)短程/长程以及染色体内/染色体间相互作用的比例。
    (iv)Capture Hi-C 的靶上相互作用比例。
    (v)若已指定，则包括等位基因特异性读段的比例。
    注意：HiC-Pro 支持多种实验方案，包括 in situ Hi-C 和 Capture Hi-C。在后一种情况下，用户只需在配置文件中指定目标区域（BED 格式）。数据处理完成后，HiC-Pro 的输出可轻松转换为 cooler 对象以进行下游分析56。在此步骤中，使用 Imakaev 及其同事先前描述的 ICE 方法对不同分辨率的相互作用图谱进行标准化57。随后可运行多种分析以识别染色体区室、拓扑关联结构域（TADs）或染色质环（综述见58）。该实验方案的工作流程如 图 4 所示。此处应用“cooltools”工具包计算绝缘分数和 TAD 边界，如 图 5 和 图 6 所示59。

结果

所描述的Capture Hi-C方案基于使用四碱基切割酶（DpnII）制备全基因组范围的3C模板。随后通过一组连续覆盖目标基因组区域的RNA探针进行杂交，并利用本研究中所用目标富集系统的链霉亲和素介导捕获方法，实现对目标区域连接片段的富集图1）。选择生物素标记的RNA探针，因为与DNA探针相比，其对靶标的结合亲和力更强52,60捕获的文库随后进行加索引和混合，用于多重高通量测序。捕获型Hi-C数据可被可视化为高分辨率的Hi-C相互作用图谱，也可呈现为类似4C的单视角接触图谱，以特异性展示整个捕获区域内较小序列（如启动子或增强子）的相互作用。本方案的工作流程如图所示。 图4测序前质量控制如图所示 图2 并包括对3C模板的适当消化与重新连接，以及在方案不同步骤中对其有效剪切和纯化的评估。剪切后的3C模板DNA片段大小应在150至700 bp之间，且无片段富集现象 >应检测到 2 kb。在后续步骤中，将进行若干基于磁珠的 DNA 纯化和片段大小选择步骤，分别在片段打断后、捕获前 PCR 后以及捕获后 PCR 后进行。经纯化的文库在高灵敏度 DNA 生物分析仪上可观察到明显的片段富集图谱图2。在文库构建过程中，由于接头、测序引物和索引引物的连接，片段的平均长度逐渐增加。测序后的质量控制数据可获得 通过 Hi-C Pro 并展示于 图3已有多种不同的生物信息学软件被提出用于 3C 类数据的处理与分析。其中，HiC-Pro 分析流程是最为流行的解决方案之一，能够将原始测序数据处理生成不同分辨率的最终互作图谱55HiC-Pro 采用两步映射策略，将测序读段比对到参考基因组上。随后重建并过滤 3C 产物，以去除无信息量的接触对，并生成接触图谱。此外，该工具能够利用已知多态性位点列表进行等位基因特异性分析，将来自两个亲本等位基因的接触信号分别分配到不同的接触图谱中。最近，HiC-Pro 已被纳入并扩展至 nf-core 框架（nf-core-hic），形成了一个高度可扩展、可重复且由社区驱动的分析流程。61,62.

为了捕获小鼠 Xic 区域，设计了一组包含 28,913 个 RNA 探针的芯片，覆盖 X 染色体上 3 Mb 的区域。该区域包括 X 染色体失活（XCI）的关键基因——长链非编码基因 Xist 及其已知的约 800 kb 的调控区域（图 5）。这约 800 kb 的区域被划分为两个拓扑关联结构域（TAD）：其中一个包含 Xist 启动子及其已知的正向调控因子（即非编码转录本 Ftx、Jpx、Xert 以及蛋白编码基因 Rnf12），另一个相邻的 TAD 则包含 Xist 的负向顺式调控因子（即其反义转录本 Tsix、增强子元件 Xite 和非编码转录本 Linx）（综述见44,45）。

通过将所述的捕获Hi-C（Capture Hi-C）技术应用于Xic，获得了该基因座前所未有的高分辨率拓扑结构（图6 和 图7）。当将捕获Hi-C图谱与先前发表的5C47（图6 和 图7；补充表1）以及Hi-C61（图6 和 图7；补充表1）图谱进行比较时，这一优势尤为明显。例如，亚拓扑关联结构域（sub-TAD）的结构更加清晰——包含Xist启动子的TAD（Xist-TAD）被明确划分为两个更小的结构域（图6A，蓝色箭头）。此前，仅能从5C图谱中视觉上“推测”该区域存在边界（图6B），尽管绝缘评分算法（insulation score algorithm）已可检测到该区域的边界。同样，捕获Hi-C图谱的分辨率使得在邻近的TAD中也能识别出两个更小的结构域（图6A、B），该TAD包含Tsix基因座的启动子（Tsix-TAD）；而此前使用5C技术未能实现这一分辨（图6B）。值得注意的是，基于捕获Hi-C和5C数据通过绝缘评分所确定的拓扑边界，通常在位置上略有差异，且相对强度也有所不同。

此外，从Capture Hi-C数据中还可以清晰地观察到其他亚TAD结构，例如Xist与Ftx之间的染色质环（图7A），该结构此前已通过Capture-C技术被鉴定63；以及Xist与Xert之间的染色质环（图7B），该结构最近利用类似的Capture Hi-C实验方案被发现48。由于Capture Hi-C图谱分辨率的提高，其他染色质相互作用也可被更精确地定位，例如在Tsix-TAD区域内Linx、Chic1和Xite位点之间形成的已知相互作用热点（图7A）。

与图7所示的Hi-C数据相比，Capture Hi-C 的分辨率提高了四倍，但仅需四分之一的测序深度（即 126 M 条序列读长对比 571 M）（补充表1）。分辨率的提高使得能够检测到在图6和图7所示测序深度下通过Hi-C无法检测到的亚拓扑关联结构域（subTADs）以及染色质环互作。因此，本研究所描述的Capture Hi-C 实验方案相较于以往方法，能够对感兴趣的较大基因组区域进行更为详细和高分辨率的表征。

X染色体图谱，显示DpnII位点、探针1-8、上下游300 bp区域及基因分析示意图。
图1：探针设计。探针设计策略的示意图。 在3 Mb目标区域内的每个DpnII限制性酶切位点上下游各300 bp的区域被选中，并用重叠的生物素化RNA探针进行覆盖。图中显示其中一个选定区域，chrX: 102,474,805-102,475,500。每个探针中重复序列长度不得超过40个碱基。请点击此处查看该图的放大版本。

电泳图谱与色谱图、DNA文库构建及分析。
图 2：Capture Hi-C 测序前质量控制。（A）3C 模板质量控制的代表性示例。将 200 ng DNA 上样至 1% 琼脂糖凝胶。第 1 泳道：1 kb DNA 标准分子量标记。第 2 泳道：未消化、交联且完整的染色质以一条清晰条带迁移，大小为 >10 kb。第 3 泳道：经 DpnII 消化后的交联染色质，呈弥散条带，大小在 1 kb 至 3 kb 之间。第 4 泳道：最终的 3C 文库或模板；消化后的交联 DNA 片段的游离末端被重新连接。低分子量的 DNA 弥散条带几乎不可见，连接产物表现为一条大小为 >10 kb 的条带。（B）高灵敏度生物分析仪 DNA 谱图的代表性示例。左上图：成功剪切的 3C 文库，片段大小分布在 150 bp 至 700 bp 之间。右上图：剪切效果不理想的 3C 文库。未剪切的 DNA 表现为片段大小 >2 kb 的宽峰富集。（C）左下图：使用 SPRI 磁珠进行 1:1 左侧片段大小选择后的剪切 DNA 样品，~300 bp 的片段得到富集。中下图：按照试剂盒说明书连接双端接头后的捕获前 PCR 谱图。右下图：最终的 Capture Hi-C 文库，包含接头、测序引物和用于多重测序的索引引物。缩写：bp = 碱基对，FU = 荧光相对单位。请点击此处查看该图的放大版本。

HiC-Pro 映射、配对、过滤、等位基因特异性、相互作用、捕获统计；柱状图比较。
图 3：使用 HiC-Pro 进行染色质捕获 Hi-C 测序后的质量控制。 （A）测序双端读段中第一端在参考基因组上的比对率示例。浅蓝色部分表示由 HiC-Pro 比对并跨越连接位点的读段。因此，该指标可用于验证实验中的连接步骤。（B）当测序配对读段在基因组上完成比对后，仅保留唯一比对的读段对用于后续分析。（C）无效配对（红色部分），如悬垂末端、自环化或再连接产物，将从分析中剔除。有效配对所占比例是评估连接效率和富集效率的良好指标。（D）有效配对可进一步划分为染色体内/染色体间以及短距离/长距离相互作用。可能代表 PCR 扩增伪影的重复读段对将被剔除。（E）在等位基因特异性分析中，HiC-Pro 报告支持每个亲本基因组（即 C57BL/6J × CASTEi/J）中单个或两个配对读段的等位基因读段数量。预期分配至母源和父源等位基因的读段比例相近。（F）最后，仅选择覆盖捕获区域的有效配对用于构建相互作用图谱。捕获-捕获配对代表靶向区域内的相互作用，而捕获-报告配对则涉及靶向区域与非靶向区域之间的相互作用。请点击此处查看该图的放大版本。

染色质交联至Hi-C数据分析；测序、消化、DNA纯化的示意图。
图4：Capture Hi-C 实验流程图。 不同实验步骤的示意图。为构建全基因组范围的3C模板，首先使用甲醛交联染色质，随后用DpnII限制性内切酶进行消化。接着将游离的DNA末端重新连接，逆转交联，并纯化DNA。为了富集包含目标区域的DNA片段，使用一组生物素标记的RNA探针与3C模板杂交，并通过链霉亲和素介导的pull-down方法进行捕获。捕获文库经多重测序处理后，通过定量有效的连接片段来推断目标区域内染色质相互作用的频率，并以高分辨率的相互作用图谱形式呈现。 请点击此处查看该图的放大版本。

小鼠X染色体图谱、基因定位、着丝粒到端粒、基因组位点分析。
图5：小鼠X染色体上包含Xic区域的概览。小鼠X染色体的示意图及所捕获的3 Mb区域（ChrX: 102,475,000-105,475,000）的放大图。目标区域包含约800 kb的DNA，对应于X染色体失活中心（Xic），即X染色体失活（XCI）的主调控位点。Xic包含长链非编码基因Xist（XCI的关键因子）及其调控区域。Xist的正向调控因子以绿色表示，负向调控因子以紫色表示。请点击此处查看该图的放大版本。

染色体接触图谱及其边界和绝缘分数；多分辨率下的 Hi-C 数据。
图 6：跨越 3 Mb 捕获区域的染色体捕获 Hi-C、5C 和 Hi-C 相互作用图谱。 （A）本研究中以 10 kb 分辨率绘制的小鼠 Xic 所在 3 Mb 目标区域的染色体捕获 Hi-C 相互作用图谱。（B）与（A）中相同目标区域的 6 kb 分辨率 5C 相互作用图谱（数据来自文献47的重新处理）。分析中未包含的重复区域以白色遮蔽。5C 数据需独立的生物信息学处理流程（参见文献47）。在完成数据清洗与比对后，基于引物分辨率的 5C 图谱通过滑动中位数法（窗口大小 = 30 kb，步长 = 5）进行分箱，最终达到 6 kb 分辨率。（C）与（A）和（B）相同基因组区域的 40 kb 分辨率 Hi-C 相互作用图谱（数据来自文献64的重新处理）。所有相互作用图谱均来源于小鼠胚胎干细胞（ESCs）。绝缘分数使用 cooltools 计算，并以直方图形式展示，TAD 边界对应于绝缘分数的最小值。TAD 边界在图谱下方以垂直线表示，每条线的高度反映边界的强度。基因以指示转录方向的箭头表示。仅在染色体捕获 Hi-C 图谱中特异性检测到或定位更精确的亚 TAD 边界，分别用洋红色和蓝色箭头标出，分别对应 Tsix 和 Xist 所在的 TAD 内的亚 TAD。 请点击此处查看该图的放大版本。

不同分辨率下的捕获 Hi-C 和 5C 图谱，显示边界强度和绝缘得分。
图 7：在捕获区域内跨越 1 Mb 的捕获 Hi-C、5C 和 Hi-C 相互作用图谱。（A）包含小鼠 Xic 的 1 Mb 基因组区域在 5 kb 分辨率下的捕获 Hi-C 相互作用图谱（本研究）。（B）与（A）相同基因组区域在 6 kb 分辨率下的 5C 相互作用图谱（数据来自文献47的重新处理）。分析中未包含的重复区域以白色遮蔽。需要注意的是，5C 数据需要独立的生物信息学处理（参见文献47）。在完成数据清洗和比对后，以引物分辨率为单位的 5C 图谱通过滑动中位数法进行分箱（窗口大小 = 30 kb，步长 = 5），最终达到 6 kb 的分辨率。（C）与（A）和（B）相同基因组区域在 20 kb 分辨率下的 Hi-C 相互作用图谱（数据来自文献64的重新处理）。所有相互作用图谱均来源于小鼠胚胎干细胞（mESCs）。绝缘得分使用 cooltools 计算，并以直方图形式展示，TAD 边界处对应绝缘得分的最小值。TAD 边界在图谱下方以垂直线表示，每条线的高度反映边界的强度。基因以指示转录方向的箭头表示。仅在捕获 Hi-C 中特异性检测到或定位更精确的染色质互作环，在 Tsix 和 Xist TAD 中分别用洋红色和蓝色星号标出。请点击此处查看该图的放大版本。

补充表 1：本论文所用数据集的测序后统计信息：染色质相互作用捕获测序（本研究）、Hi-C64 和 5C47。 请点击此处下载该文件。

讨论

本文介绍了一种相对快速且简便的染色质捕获技术（Capture Hi-C），用于在5–10 kb分辨率下表征兆碱基大小的基因组区域的高级空间组织结构。Capture Hi-C属于Capture-C技术家族，旨在从全基因组范围的3C或Hi-C文库中富集特定目标染色质相互作用。迄今为止，大多数Capture-C应用主要用于绘制遍布整个基因组的较小调控元件的染色质互作图谱。在首个Capture-C实验方案中，研究人员使用多个重叠的生物素化RNA探针，从红系细胞构建的3C文库中捕获了>400个预先选定的启动子31。该策略随后在下一代（NG）和核滴定（NuTi）Capture-C中得到改进，通过使用跨越单一限制性酶切位点的120 bp DNA捕获探针，并进行两轮连续捕获，以最大化富集具有信息量的连接片段，从而实现了对>8,000个启动子的高分辨率互作分析32,40。这些方法已在多种生物学背景下推动了对顺式作用元件的功能解析，包括小鼠胚胎发育、细胞分化、X染色体失活以及病理条件下基因表达失调等过程46,63,65,66,67,68,69,70,71。

在启动子捕获 Hi-C（PCHi-C）技术中，通过在限制性酶切片段的一端或两端杂交单链 120-mer 生物素化 RNA 探针，从 Hi-C 文库中富集了超过 22,000 个已注释的含有限制性酶切片段的启动子>22,00034,72。该方法使得在越来越多的细胞类型中解析数千个启动子的相互作用组成为可能，包括小鼠胚胎干细胞、胎肝细胞和脂肪细胞34,35,72,73，以及人类淋巴母细胞系、造血祖细胞、表皮角质形成细胞和多能细胞37,74,75,76,77。

与这些靶向富集技术相比，Capture Hi-C 可靶向连续的基因组区域，范围可达兆碱基（megabase）尺度，从而跨越一个或多个拓扑关联结构域（TAD），并涵盖基因的调控区域。目标区域内所有 DpnII 限制性酶切位点均需被一系列生物素标记的探针覆盖，以实现对整个目标区域的完整铺排。生物素化探针阵列与 3C 模板的杂交、随后基于链霉亲和素的捕获以及用于多重测序的处理，均通过适用于Illumina双端多重测序的目标富集系统完成。整个实验流程快速，从 3C 文库构建到下一代测序（NGS）可在 1 周内完成，且仅需少量调整或针对特定情况的故障排查。

与其它基于3C的方法相比，该方案还具有优势。为了获得5-10 kb分辨率的相互作用图谱，我们测序了1亿至1.2亿条成对末端读长。作为对比，本研究中使用了一个包含5.71亿条读长的Hi-C数据集以达到20 kb的分辨率64（GSM2053973），而若要通过全染色体范围的Hi-C达到5 kb分辨率，则至少需要10亿条读长22。

本研究中使用的Capture Hi-C技术相比先前基于6-bp切割限制性内切酶的5C方法具有更高的分辨率47（补充表1）。重要的是，5C技术中用于富集和扩增目标相互作用的策略无法实现染色质相互作用的等位基因特异性分析。相反，Capture Hi-C数据可进行等位基因特异性比对，从而能够解析同源染色体对的三维结构图谱，例如在人类细胞或通过遗传背景不同的小鼠品系杂交获得的F1杂合细胞系中78。为了在5 kb分辨率下生成等位基因特异性的Capture Hi-C相互作用图谱，我们对150 bp的双端测序读长进行测序，以提高单核苷酸多态性（SNP）的覆盖度。类似等位基因特异性的方法也可应用于已有SNP注释的人类细胞系22。

重要的是，尽管染色质相互作用捕获测序（Capture Hi-C）通常能在提高测序成本效益的同时保证高分辨率，但定制化的生物素化寡核苷酸的合成确实会影响该方法的整体成本。因此，针对不同应用场景，最合适的 3C 方法的选择会有所不同，具体取决于所研究的生物学问题、所需的分辨率以及目标区域的大小。其他已开发的 Capture Hi-C 方案与本文所述方案具有关键共性。例如，已有研究采用 Capture Hi-C 策略对与乳腺癌和结直肠癌风险相关的非编码变异区域（跨度约为 50 kb 至 1 Mb）进行表征；在该方案中，通过使用覆盖目标区域达 3 倍深度的 120-mer RNA 捕获探针，从 Hi-C 文库中富集目标区域33,38,79。类似地，杂交捕获 Hi-C（HYbrid Capture Hi-C，Hi-C2）被用于靶向富集最大达 2 Mb 的目标区域内的染色质相互作用80。在这两种方案中，利用富含生物素的 Hi-C 模板对连接片段进行富集，从而提高了总有效读段的比例，相较于本方案更具优势。例如，在本研究用于比较的 Hi-C 数据集64（GSM2053973）中，去除重复后有效配对读段的比例比本文所述 Capture Hi-C 实验获得的有效配对读段高出 4.8 倍（见图 3和补充表 1）。然而，连续进行生物素化连接片段和杂交探针的富集步骤显著增加了实验的复杂性和耗时，同时可能降低捕获区域的文库复杂度。

另一种可用于通过平铺探针富集3C模板的方法是Tiled-C，该方法已被应用于研究小鼠红系分化过程中具有高空间和时间分辨率的染色质结构43。在Tiled-C中，使用一组70 bp的生物素化探针，通过连续两轮捕获来富集大范围区域内的相互作用，从而生成靶向相互作用的极高分辨率图谱43,81。双重捕获富集也使得该实验流程相较于Capture Hi-C更长且更复杂。然而，与靶向单个限制性酶切位点的Capture-C策略不同，在Tiled-C中第二轮捕获似乎并未显著提高捕获效率，因此可能可以省略43。最后，一种类似的平铺探针策略基于本研究中所使用的相同靶向富集方法，已被应用于解析先天性畸形患者中描述并在转基因小鼠中重建的结构变异所涉及的调控区域41,42。在该研究中，探针的平铺阵列设计覆盖了整个靶区域，而非局限于DpnII限制性酶切位点附近41。尽管如此，这项工作具有开创性意义，突显了该策略在不同背景下实现大片段基因组区域高分辨率表征的灵敏度与强大能力41,42,48。

综上所述，本文所述方案代表了一种简便、稳健且功能强大的策略，可用于对任何感兴趣的基因组区域进行高分辨率的三维表征。将该方法应用于不同的模式系统、细胞类型、发育调控的染色质景观以及健康与疾病状态下的基因调控，有望促进我们对基因组拓扑结构与基因调控之间相互作用及其因果关系的理解，这是表观遗传学领域中一个根本性的未解问题。此外，应用Capture Hi-C技术来绘制全基因组关联研究（GWAS）所鉴定的风险变异位点的长程相互作用和高级染色质折叠结构，有望揭示与人类疾病相关的非编码基因组位点在不同背景下的功能意义，从而为潜在致病机制的解析提供新的见解。

披露

Kai Hauschulz 是安捷伦科技公司诊断与基因组学部门的现场应用科学家。其他所有作者均声明不存在竞争利益。

致谢

Heard 实验室的工作得到了欧洲研究理事会高级研究员奖（XPRESS - AdG671027）的支持。A.L. 受欧盟玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里行动计划个体奖学金（IF-838408）资助。A.H. 受玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里资助协议 813327 项下的创新与跨学科网络 ChromDesign（ITN）支持。作者感谢 Daniel Ibrahim（柏林马克斯·普朗克分子遗传学研究所）提供的有益技术建议，感谢巴黎居里研究所 NGS 平台，以及感谢 Vladimir Benes 和欧洲分子生物学实验室（海德堡）基因组核心设施提供的支持与协助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10x PBS，pH 7.4Gibco10010-023
37%（体积比）多聚甲醛溶液Electron Microscopy Sciences15686一次性玻璃小瓶；禁止重复使用
50 mL 聚丙烯锥形管Falcon352070
琼脂糖SigmaA9539-500g
生物分析仪（Bioanalyzer）AgilentG2939BA
细胞刮刀 - 25 cm 手柄，3.0 cm 刀片Falcon353089
CHIR99021Axon Medchem BVAxon 1386
cOmplete Mini 蛋白酶抑制剂混合物（无EDTA）Merck11836170001
Countess 细胞计数板载玻片InvitrogenC10228
Countess II FLInvitrogenZGEXSCCOUNTESS2FL全自动细胞计数仪
Covaris S2Covaris500217超声破碎仪
DNA LoBind 管，1.5 mLEppendorf30108051
DpnII（50000 单位/mL）New England BiolabsR0543M
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）MerckD6429
乙醇（100%）Merck1.00983.2500
胎牛血清（FBS）Thermo Scientific10270106
猪皮明胶SigmaG1890
GeneRuler 1 kb Plus DNA MarkerThermo ScientificSM0313
GlycoBlueThermo ScientificAM9516共沉淀剂
高灵敏度 Bioanalyzer 芯片Agilent5067-4626
大型冷冻离心机 5920 REppendorf5948000018
白血病抑制因子（LIF）MerckESG1107
LiquiportKNFNF300台式抽吸系统
低吸附滤芯吸头BiozymVT0260U, VT0240, VT0220, VT0200U
分子生物学级水MerckW3500-6x500ML
Next Seq 500IlluminaSY-415-1001
Next Seq 500 高输出 v2 试剂盒（300 个循环）IlluminaFC-404-2004
Nonidet P40 替代物（NP40）Merck11332473001
PD0325901Axon Medchem BVAxon 1408
蛋白酶抑制剂混合物（无EDTA）Merck11873580001
蛋白酶K - 重组，PCR级（20 mg/mL）Thermo ScientificEO0491
Qubit 2.0Thermo ScientificQ32871
Qubit 检测管Thermo ScientificQ32856
Qubit dsDNA 高灵敏度检测试剂盒Thermo ScientificQ32851
RNase A（10 mg/mL）Thermo ScientificEN0531
乙酸钠 pH 5.2（3 M）MerckS7899
真空离心浓缩仪EppendorfEP5305000100-1EA
Agencourt AMPureXPBeckman CoulterA63881SPRI 磁珠
SureSelect 靶向富集试剂盒 1Agilent5190-8645
SureSelect 靶向富集试剂盒 ILM 索引杂交模块 2Agilent5190-4455
SureSelect XT 文库制备试剂盒 ILMAgilent5500-0132
T4 连接酶（30 单位/µL）Thermo ScientificEL0013
台式离心机 5427 REppendorf5409000012
Triton-X-100（500 mL）MerckX100-500ML
台盼蓝InvitrogenT10282
胰蛋白酶Thermo Scientific25300054
UltraPure 甘氨酸Thermo Scientific15527013
β-巯基乙醇Thermo Scientific31350010

参考文献

  1. Ibrahim, D. M., Mundlos, S. The role of 3D chromatin domains in gene regulation: a multi-facetted view on genome organization. Current Opinion in Genetics & Development. 61, 1-8 (2020).
  2. Bolt, C. C., Duboule, D. The regulatory landscapes of developmental genes. Development. 147 (3), (2020).
  3. Glaser, J., Mundlos, S. 3D or not 3D: Shaping the genome during development. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 14 (5), 040188(2021).
  4. Denker, A., De Laat, W. The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization. Genes & Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).
  5. Kempfer, R., Pombo, A. Methods for mapping 3D chromosome architecture. Nature Reviews Genetics. 21 (4), 207-226 (2020).
  6. McCord, R. P., Kaplan, N., Giorgetti, L. Chromosome conformation capture and beyond: Toward an integrative view of chromosome structure and function. Molecular Cell. 77 (4), 688-708 (2020).
  7. Jerkovic, I., Cavalli, G. Understanding 3D genome organization by multidisciplinary methods. Nature ReviewsMolecular Cell Biology. 22 (8), 511-528 (2021).
  8. Hsieh, T. -H. S., et al. Mapping nucleosome resolution chromosome folding in yeast by Micro-C. Cell. 162 (1), 108-119 (2015).
  9. Krietenstein, N., et al. Ultrastructural details of mammalian chromosome architecture. Molecular Cell. 78 (3), 554-565 (2020).
  10. Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. Capturing chromosome conformation. Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).
  11. Naumova, N., Smith, E. M., Zhan, Y., Dekker, J. Analysis of long-range chromatin interactions using Chromosome Conformation Capture. Methods. 58 (3), 192-203 (2012).
  12. Simonis, M., et al. Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C). Nature Genetics. 38 (11), 1348-1354 (2006).
  13. Zhao, Z., et al. Circular chromosome conformation capture (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra-and interchromosomal interactions. Nature Genetics. 38 (11), 1341-1347 (2006).
  14. Würtele, H., Chartrand, P. Genome-wide scanning of HoxB1-associated loci in mouse ES cells using an open-ended Chromosome Conformation Capture methodology. Chromosome Research. 14 (5), 477-495 (2006).
  15. De Wit, E., De Laat, W. A decade of 3C technologies: insights into nuclear organization. Genes & Development. 26 (1), 11-24 (2012).
  16. Dostie, J., et al. Chromosome Conformation Capture Carbon Copy (5C): a massively parallel solution for mapping interactions between genomic elements. Genome Research. 16 (10), 1299-1309 (2006).
  17. Splinter, E., et al. The inactive X chromosome adopts a unique three-dimensional conformation that is dependent on Xist RNA. Genes & Development. 25 (13), 1371-1383 (2011).
  18. Ferraiuolo, M. A., Sanyal, A., Naumova, N., Dekker, J., Dostie, J. From cells to chromatin: capturing snapshots of genome organization with 5C technology. Methods. 58 (3), 255-267 (2012).
  19. Kim, J. H., et al. 5C-ID: Increased resolution Chromosome-Conformation-Capture-Carbon-Copy with in situ 3C and double alternating primer design. Methods. 142, 39-46 (2018).
  20. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
  21. Zhang, Y., et al. Spatial organization of the mouse genome and its role in recurrent chromosomal translocations. Cell. 148 (5), 908-921 (2012).
  22. Rao, S. S. P., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
  23. Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
  24. Nora, E. P., et al. Spatial partitioning of the regulatory landscape of the X-inactivation centre. Nature. 485 (7398), 381-385 (2012).
  25. Krefting, J., Andrade-Navarro, M. A., Ibn-Salem, J. Evolutionary stability of topologically associating domains is associated with conserved gene regulation. BMC Biology. 16 (1), 87(2018).
  26. Galupa, R., Heard, E. Topologically associating domains in chromosome architecture and gene regulatory landscapes during development, disease, and evolution. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 82, 267-278 (2017).
  27. Tena, J. J., Santos-Pereira, J. M. Topologically associating domains and regulatory landscapes in development, evolution and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 702787(2021).
  28. Lupiáñez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. Breaking TADs: How alterations of chromatin domains result in disease. Trends in Genetics. 32 (4), 225-237 (2016).
  29. Davidson, I. F., Peters, J. -M. Genome folding through loop extrusion by SMC complexes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (7), 445-464 (2021).
  30. Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).
  31. Hughes, J. R., et al. Analysis of hundreds of cis-regulatory landscapes at high resolution in a single, high-throughput experiment. Nature Genetics. 46 (2), 205-212 (2014).
  32. Davies, J. O. J., et al. Multiplexed analysis of chromosome conformation at vastly improved sensitivity. Nature Methods. 13 (1), 74-80 (2016).
  33. Jäger, R., et al. Capture Hi-C identifies the chromatin interactome of colorectal cancer risk loci. Nature Communications. 6, 6178(2015).
  34. Schoenfelder, S., et al. The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements. Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).
  35. Sahlén, P., et al. Genome-wide mapping of promoter-anchored interactions with close to single-enhancer resolution. Genome Biology. 16, 156(2015).
  36. Joshi, O., et al. Dynamic reorganization of extremely long-range promoter-promoter interactions between two states of pluripotency. Cell Stem Cell. 17 (6), 748-757 (2015).
  37. Mifsud, B., et al. Mapping long-range promoter contacts in human cells with high-resolution capture Hi-C. Nature Genetics. 47 (6), 598-606 (2015).
  38. Dryden, N. H., et al. Unbiased analysis of potential targets of breast cancer susceptibility loci by Capture Hi-C. Genome Research. 24 (11), 1854-1868 (2014).
  39. Oudelaar, A. M., Davies, J. O. J., Downes, D. J., Higgs, D. R., Hughes, J. R. Robust detection of chromosomal interactions from small numbers of cells using low-input Capture-C. Nucleic Acids Research. 45 (22), 184(2017).
  40. Oudelaar, A. M., et al. Single-allele chromatin interactions identify regulatory hubs in dynamic compartmentalized domains. Nature Genetics. 50 (12), 1744-1751 (2018).
  41. Franke, M., et al. Formation of new chromatin domains determines pathogenicity of genomic duplications. Nature. 538 (7624), 265-269 (2016).
  42. Despang, A., et al. Functional dissection of the Sox9-Kcnj2 locus identifies nonessential and instructive roles of TAD architecture. Nature Genetics. 51 (8), 1263-1271 (2019).
  43. Oudelaar, A. M., et al. Dynamics of the 4D genome during in vivo lineage specification and differentiation. Nature Communications. 11 (1), 1-12 (2020).
  44. Galupa, R., Heard, E. X-chromosome inactivation: A crossroads between chromosome architecture and gene regulation. Annual Review of Genetics. 52, 535-566 (2018).
  45. Loda, A., Collombet, S., Heard, E. Gene regulation in time and space during X-chromosome inactivation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 23 (4), 231-249 (2022).
  46. van Bemmel, J. G., et al. The bipartite TAD organization of the X-inactivation center ensures opposing developmental regulation of Tsix and Xist. Nature Genetics. 51 (6), 1024-1034 (2019).
  47. Galupa, R., et al. A conserved noncoding locus regulates random monoallelic Xist expression across a topological boundary. Molecular Cell. 77 (2), 352-367 (2020).
  48. Gjaltema, R. A. F., et al. Distal and proximal cis-regulatory elements sense X chromosome dosage and developmental state at the Xist locus. Molecular Cell. 82 (1), 190-208 (2022).
  49. Galupa, R., et al. Inversion of a topological domain leads to restricted changes in its gene expression and affects inter-domain communication. Development. 149 (9), (2022).
  50. Savarese, F., Flahndorfer, K., Jaenisch, R., Busslinger, M., Wutz, A. Hematopoietic precursor cells transiently reestablish permissiveness for X inactivation. Molecular and Cellular Biology. 26 (19), 7167-7177 (2006).
  51. Schulz, E. G., et al. The two active X chromosomes in female ESCs block exit from the pluripotent state by modulating the ESC signaling network. Cell Stem Cell. 14 (2), 203-216 (2014).
  52. Gnirke, A., et al. Solution hybrid selection with ultra-long oligonucleotides for massively parallel targeted sequencing. Nature Biotechnology. 27 (2), 182-189 (2009).
  53. Akgol Oksuz, B., et al. Systematic evaluation of chromosome conformation capture assays. Nature Methods. 18 (9), 1046-1055 (2021).
  54. Piccinini, F., Tesei, A., Arienti, C., Bevilacqua, A. Cell counting and viability assessment of 2D and 3D Cell cultures: Expected reliability of the trypan blue assay. Biological Procedures Online. 19 (1), 8(2017).
  55. Servant, N., et al. HiC-Pro: an optimized and flexible pipeline for Hi-C data processing. Genome Biology. 16, 259(2015).
  56. Abdennur, N., Mirny, L. A. Cooler: scalable storage for Hi-C data and other genomically labeled arrays. Bioinformatics. 36 (1), 311-316 (2020).
  57. Imakaev, M., et al. Iterative correction of Hi-C data reveals hallmarks of chromosome organization. Nature Methods. 9 (10), 999-1003 (2012).
  58. Forcato, M., et al. Comparison of computational methods for Hi-C data analysis. Nature Methods. 14 (7), 679-685 (2017).
  59. Venev, S., et al. open2c/cooltools: v0.4.1. , (2021).
  60. Wages, J. M. NUCLEIC ACIDS | Immunoassays. Encyclopedia of Analytical Science. , Elsevier. 408-417 (2005).
  61. Ewels, P. A., et al. The nf-core framework for community-curated bioinformatics pipelines. Nature Biotechnology. 38 (3), 276-278 (2020).
  62. Servant, N., Peltzer, A. nf-core/hic: Initial release of nf-core/hic. Zenodo. , (2019).
  63. Furlan, G., et al. The Ftx noncoding locus controls X chromosome inactivation independently of its RNA products. Molecular Cell. 70 (3), 462-472 (2018).
  64. Giorgetti, L., et al. Structural organization of the inactive X chromosome in the mouse. Nature. 535 (7613), 575-579 (2016).
  65. Simon, C. S., et al. Functional characterisation of cis-regulatory elements governing dynamic Eomes expression in the early mouse embryo. Development. 144 (7), 1249-1260 (2017).
  66. Williams, R. M., et al. Reconstruction of the global neural crest gene regulatory network in vivo. Developmental Cell. 51 (2), 255-276 (2019).
  67. Godfrey, L., et al. DOT1L inhibition reveals a distinct subset of enhancers dependent on H3K79 methylation. Nature Communications. 10 (1), 2803(2019).
  68. Hanssen, L. L. P., et al. Tissue-specific CTCF-cohesin-mediated chromatin architecture delimits enhancer interactions and function in vivo. Nature Cell Biology. 19 (8), 952-961 (2017).
  69. Larke, M. S. C., et al. Enhancers predominantly regulate gene expression during differentiation via transcription initiation. Molecular Cell. 81 (5), 983-997 (2021).
  70. Oudelaar, A. M., et al. A revised model for promoter competition based on multi-way chromatin interactions at the α-globin locus. Nature Communications. 10 (1), 5412(2019).
  71. Long, H. K., et al. Loss of extreme long-range enhancers in human neural crest drives a craniofacial disorder. Cell Stem Cell. 27 (5), 765-783 (2020).
  72. Schoenfelder, S., Javierre, B. -M., Furlan-Magaril, M., Wingett, S. W., Fraser, P. Promoter Capture Hi-C: High-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions. Journal of Visualized Experiments. (136), e57320(2018).
  73. Siersbæk, R., et al. Dynamic rewiring of promoter-anchored chromatin loops during adipocyte differentiation. Molecular Cell. 66 (3), 420-435 (2017).
  74. Rubin, A. J., et al. Lineage-specific dynamic and pre-established enhancer-promoter contacts cooperate in terminal differentiation. Nature Genetics. 49 (10), 1522-1528 (2017).
  75. Freire-Pritchett, P., et al. Global reorganisation of cis-regulatory units upon lineage commitment of human embryonic stem cells. eLife. 6, 21926(2017).
  76. Javierre, B. M., et al. Lineage-specific genome architecture links enhancers and non-coding disease variants to target gene promoters. Cell. 167 (5), 1369-1384 (2016).
  77. Miguel-Escalada, I., et al. Human pancreatic islet three-dimensional chromatin architecture provides insights into the genetics of type 2 diabetes. Nature Genetics. 51 (7), 1137-1148 (2019).
  78. Keane, T. M., et al. Mouse genomic variation and its effect on phenotypes and gene regulation. Nature. 477 (7364), 289-294 (2011).
  79. Baxter, J. S., et al. Capture Hi-C identifies putative target genes at 33 breast cancer risk loci. Nature Communications. 9 (1), 1028(2018).
  80. Sanborn, A. L., et al. Chromatin extrusion explains key features of loop and domain formation in wild-type and engineered genomes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (47), 6456-6465 (2015).
  81. Owens, D. D. G., et al. Dynamic Runx1 chromatin boundaries affect gene expression in hematopoietic development. Nature Communications. 13 (1), 773(2022).

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