离体分析尿路上皮细胞中机械激活的Ca2+瞬变

摘要

本方案描述了一种利用荧光Ca²⁺成像技术评估天然尿路上皮细胞中机械激活离子通道功能的方法²⁺ 传感器 GCaMP5G

摘要

机械激活离子通道是一类生物换能器，可将拉伸或剪切力等机械刺激转化为电信号和生化信号。在哺乳动物中，机械激活通道在感知外部和内部刺激过程中发挥关键作用，涉及多种生理过程，如触觉感知、听觉、红细胞容积调节、基础血压调控以及膀胱充盈感的产生。尽管机械激活离子通道的功能已在 体外 使用膜片钳技术在体外研究离子通道功能时，评估其在天然环境中的作用仍是一项艰巨的任务，通常是因为难以接触到这些通道的表达部位（例如传入神经末梢、默克尔细胞、压力感受器和肾小管），或由于应用膜片钳技术存在困难（例如尿路上皮伞细胞的顶膜表面）。本方案描述了一种评估机械刺激诱发的Ca²⁺²⁺ 使用荧光传感器GCaMP5G检测瞬时钙信号 离体 尿路上皮制备，一种可轻松适用于机械刺激诱导的Ca²⁺反应研究的技术²⁺ 其他天然组织样本中的事件。

引言

当尿液滤过物流经肾单位，以及尿液从肾盂被泵出并经输尿管输送至膀胱储存时，泌尿道中的上皮细胞会受到机械力的作用。长期以来人们已认识到，体液对泌尿道上皮细胞施加的机械力（例如剪切应力和牵张力）可调控近端小管中蛋白质的重吸收以及远端肾单位中溶质的重吸收^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13}，同时也调控尿液在膀胱中的储存及排尿过程^14,15,16,17。

将机械刺激转化为电信号和生化信号的过程被称为机械转导，该过程由响应细胞结构或相关细胞外基质形变的蛋白质介导^18,19,20,21。机械激活离子通道的独特之处在于，它们能在膜张力、压力或剪切应力变化的刺激下，从关闭状态转变为开放且具有通透性的状态^{18,19,20,21,22}。此外，Ca²⁺瞬变可由 整合素介导的机械转导，或通过细胞间连接处的机械响应性黏附系统激活而引发^23,24,25,26。离子通道功能通常通过膜片钳技术进行评估，该技术需要在细胞膜与膜片钳电极之间形成吉欧姆级密封²⁷。然而，位于致密细胞外基质深层组织（如肾小管）中，或被物理屏障（如糖萼）包围的细胞，难以用玻璃微电极接触。同样，嵌入机械稳定性较差的组织中或作为其组成部分的细胞（如尿路上皮细胞），也不适合直接使用膜片钳技术进行研究。由于许多机械激活离子通道对Ca²⁺具有通透性，一种替代方法是利用Ca²⁺敏感性荧光染料或基因编码的钙指示蛋白（GECIs，如GCaMP），通过荧光显微镜检测其活性。近年来，蛋白质工程领域的进展显著提升了GECIs的动态范围、灵敏度和响应速度^28,29,30，同时遗传学技术的进步使得GECIs可在特定细胞群体中表达，使其成为研究机械转导的理想工具。

尿路上皮是覆盖膀胱内壁的复层上皮，其功能不仅是作为屏障，防止尿液溶质扩散至膀胱间质，同时还充当换能器，感知膀胱充盈状态，并将这些信号传递给下方的神经和肌肉组织¹⁶先前的研究表明，尿路上皮与下方组织之间的通讯需要机械激活的离子通道Piezo1和Piezo2³¹. 为评估机械诱导的 Ca²⁺ 尿路上皮细胞中的瞬时表达，一种利用腺病毒基因转导表达Ca²⁺ 在尿路上皮细胞中开发了传感器GCaMP5G。该技术采用黏膜片制备方法，可便捷地接触最外层的伞细胞层，并结合计算机辅助系统，利用封闭的玻璃微移液管对单个细胞进行同步机械刺激，同时记录随时间变化的荧光信号。

方案

动物的饲养和处理均按照匹兹堡大学机构动物护理和使用委员会的规定进行。本研究使用2至4月龄的雌性C57Bl/6J小鼠。小鼠通过商业途径获得（见材料表）。

1. 仪器组装与设置

1. 进行 Ca²⁺ 使用配备高分辨率相机和稳定光源的直立显微镜进行成像（参见 材料表).
   1. 使用显微镜配套软件获取图像，该软件需能够直接控制相机、光源和压电驱动器 通过 一个USB数字输入/输出设备（参见 材料表).
      注意： 图1 示意图展示了实验装置。GCaMP5G 的峰值激发波长为 470 nm，峰值发射波长为 497 nm²⁸使用适用于 GCaMP5G 成像的滤光片组。
2. 为了刺激膀胱黏膜制备物中的单个尿路上皮细胞（见步骤2），使用由单通道开环压电控制器控制的压电致动器（见 材料清单将压电驱动器安装在显微操作器上。
   1. 将玻璃微量移液管安装在固定于压电驱动器上的移液管架中图1）。通过由电生理数据采集与分析程序控制的模拟/数字转换器远程操作压电控制器（参见 材料表).
      注意：由成像软件启动的晶体管-晶体管逻辑（TTL）信号形式的外部触发器，用于触发电生理数据采集与分析软件中的刺激程序，从而驱动压电致动器图1).
3. 确保成像软件（参见 材料表) 与数字I/O设备连接。在USB数字I/O设备中配置一个数字输出通道，以将TTL信号发送至模数转换器，从而触发电生理软件中的协议，驱动压电执行器。
   1. 使用电缆将模拟/数字转换器上的Start BNC端口连接至接地（GND）以及USB数字I/O设备上的螺丝端子。
4. 在成像软件中设置记录程序。
   注意：以下步骤描述了如何生成一个协议，该协议将发送TTL信号，并在指定的时间间隔开始采集图像。
   1. 在成像软件中，通过点击来设置采集程序 实验管理器 并选择 新实验将打开一个新窗口。
   2. 选择该图标 延时循环 并将其拖动到新打开的窗口中；将循环次数设置为 2 并将时间间隔设置为该设置中允许的最快档位。
   3. 从图标 透射快门/手动快门，选择该图标 NI USB-6501 并将其拖入 延时循环 窗口，然后将 NI USB-6501 设置为关闭状态。拖拽另一个 NI USB-6501 从 透射快门/手动快门 进入 延时循环 窗口并将其设置为 开放将NI USB-6501闭合图标的侧边箭头拖动，拉至NI USB-6501打开图标处，两者接触后将出现一条连接线。
   4. 拖动另一个 延时循环 进入 实验管理器 窗口并拖动箭头将其与第一个窗口连接。设置记录参数。设置新循环的次数 延时循环 到 2400.
   5. 从 图像采集 图标，拖动 GFP滤光片 到最近开放的 延时循环 并设置曝光时间为 100 ms.
   6. 将相机图像类型设置为 8位，分辨率至 576 x 576 （4 x 4 分箱），像素时钟至 480 MHz，以及热点像素校正 标准.
      注意：参数可根据荧光传感器的表达水平、相机灵敏度和装置配置进行调整。
5. 在电生理学软件中设置实验台（参见 材料表).
   注意：这将定义模数转换器输出信号的单位为 mV。
   1. 前往 配置 在电生理学软件的菜单中选择 实验台. 在所得结果中 输出信号 窗口，选择 模拟输出 #1，按下 添加 信号，并为其命名（例如， "Piezo"）。设置 信号单元 到 mV 以及 缩放因子 （毫伏/伏）到 1.
6. 在电生理学软件中按照以下步骤生成刺激方案。
   1. 在电生理学软件中创建新的刺激方案时，请前往菜单项 获取 并选择 新方案.
   2. 设置 模式/速率 至 episodic stimulation, 运行/试验至 1, 扫描/运行 到 1，以及 扫描持续时间 （秒）到 150.
   3. 在 输出 菜单中，选择通道 #1 Piezo 作为模拟输出。
   4. 在 触发 菜单，将触发器设置为 数位化仪启动输入 和 内部计时器.
   5. 在 波形 菜单，选择通道 #1 和 带有时间片段的模拟波形设置 步骤 A 到 步骤, 第一级 到 0, Delta 水平 到 0, 首次持续时间 到 10000，以及 Delta 持续时间 到 0.
   6. 设置 步骤 B 到 步骤, 第一级 到 10, Delta 水平 到 0, 首次持续时间 到 1000，以及 Delta 持续时间 到 0设置 步骤 C 到 步骤, 第一级 到 0, Delta 水平 到 0, 第一持续时间 到 130000，以及 Delta 持续时间 到 0.
   7. 保存该实验方案并为其命名 刺激方案.
7. 使用BNC电缆连接 模拟输出 模拟/数字转换器的第1号端口 EXT INPUT 单通道开环压电控制器前方（参见 材料表).
8. 按照以下步骤，使用毛细玻璃管制备用于对伞细胞进行机械刺激的玻璃微电极。
   1. 将毛细玻璃管放入拉制仪中（参见 材料表）并使用毛细管固定旋钮进行调节。
   2. 将加热单元调至最高位置。调节拉制仪的第一个拉断终止位置滑块至5。
   3. 将第一个加热器旋钮设置为76.7，第二个旋钮设置为52.7。
   4. 通过按启动按钮，分两步拉制玻璃毛细管。
   5. 使用显微操作仪封闭微量移液器尖端（参见 材料表）将加热调节旋钮设为60。
      注意：本实验方案中，用于刺激单个细胞的微移液管尖端最终直径约为 1–3 µm。
9. 验证刺激微电极移动的距离是否符合刺激方案中指定的距离。
   注意：以下步骤旨在确保在电生理学软件中启动刺激程序 12.5 秒后，生成一个持续时间为 1 秒的电压脉冲，使压电驱动器移动 20 μm。 
   1. 将微量移液器安装在持器中，并连接至压电驱动器。
   2. 将压电驱动器及其连接的微移液管平行放置于显微镜载物台中心，并置于视野范围内。
   3. 聚焦移液管尖端并固定压电安装杆（参见 材料表用胶带固定。在明场照明下，调节相机参数以获得移液管尖端的清晰图像。
   4. 打开 刺激方案 在电生理学软件中设置并启动播放。
      注意：电生理记录程序将在接收到成像软件发送的TTL信号后才开始。
   5. 从 实验管理员 在成像软件中，按下 开始 开始数据采集。
      注意：这将触发电生理学软件中的程序，从而驱动压电驱动器。成像软件中的程序将生成包含实验图像的文件。
10. 按照以下步骤验证移液器移动的距离。
    1. 为了测量刺激程序期间移液管移动的距离，选择 计数与测量 成像软件中的项目。
    2. 从 测量 菜单，选择 测量与感兴趣区域 选项，随后将在视频窗口下方弹出一个新窗口。
    3. 从 测量 菜单，选择 任意线.
    4. 在视频窗口中，从移液管尖端开始绘制一条任意直线。注意，该任意直线的终点将在后续进行调整。
    5. 右键单击 任意直线 将该线条转换为感兴趣区域（ROI），该区域将在所有视频帧中可见。
    6. 检查视频，将任意线（ROI）的末端调整至移液管在刺激响应下最终移动到的位置。
       ​注意：移液器移动的距离（单位：µm）将显示在 测量与感兴趣区域 窗口。刺激方案可根据用户需求进行调整。

2. 原位 膀胱黏膜的转导与分离

1. 转导雌性小鼠膀胱 原位 使用编码CGaMP5G cDNA的腺病毒，按照病毒转导实验方案中所述步骤进行操作³¹.
   1. 转导尿路上皮细胞以进行钙²⁺ 成像实验中，向膀胱内灌注含有 2 x 10 的溶液 50 µL⁷ 感染性病毒颗粒（IVP）。
      注意：该技术 tends to restrict 将CGaMP5G的表达限定于伞细胞层。或者，也可使用从转基因小鼠中获取的尿膀胱进行实验，这些转基因小鼠的尿路上皮细胞（即由uroplakin-2启动子驱动GCaMP5G表达）或其他特定细胞类型中表达CGaMP5G。
2. 转导后24-72小时，通过CO₂ 窒息后，用剪刀打开胸腔进行胸廓切开术，使肺部塌陷。
3. 使用24 G导管插入尿道。通过皮肤和肌肉做约1.5 cm的腹部切口暴露膀胱，并使用6.0缝线（参见 材料表) 以将导管固定在尿道上。
4. 收获膀胱和尿道³² 并固定在硅橡胶支架垫上（参见 材料表) 浸泡在含有（单位：mM）135 NaCl、5.0 KCl、1 MgCl 的记录液中₂，2.5 CaCl₂，10 葡萄糖，10 HEPES，pH 7.4，并用 100% O₂ 饱和₂ (图2A).
5. 用精细镊子按照先前发表的文献报道，将膀胱黏膜与下方的肌层分离³² (图2B).
6. 切开膀胱黏膜，将其尿路上皮面朝上固定在直径35 mm的组织培养皿底部的硅胶弹性体插件上（图2C).

3. 单个尿路上皮细胞的机械刺激与 Ca²⁺ 成像

1. 将带有固定膀胱黏膜的组织培养皿安装在配备有电阻加热元件的显微镜载物台上（图2E）。按照制造商说明（见材料表），使用在线加热器将约37 °C的记录液以1.7 mL/min的流速持续灌注至细胞培养皿中。
2. 使用双通道双极温度控制器（见材料表）维持组织培养皿孵育腔及溶液温度在约37 °C。在进行后续实验操作前，通过持续灌注使组织在腔室内平衡至少15分钟。
3. 为记录机械诱导的Ca²⁺瞬变，将微移液管浸入组织培养皿中浸泡固定膀胱黏膜的溶液内。借助低倍扫描物镜（4x）在明场照明下，将微移液管 移至视野中央。
   1. 通过协调调节显微操作器在垂直方向的移动和焦距，将微移液管移近尿路上皮组织表面。
   2. 切换至高数值孔径（NA）的高倍物镜（20x），适用于免疫荧光成像。
   3. 将显微操作器设为精细模式，并将微移液管 移至目标细胞顶部附近。
   4. 切换至相机视野，并在成像软件中点击实时。
      注：此操作必须打开反射快门，以便在计算机上观察到来自组织的荧光信号。
   5. 调节焦距以清晰观察细胞顶部，并根据需要调整移液管位置。
   6. 在电生理软件中打开刺激程序，并设置为播放。
      注：电生理软件中的程序将在接收到成像软件发送的TTL信号后才开始运行。
   7. 在成像软件的实验管理器中点击开始，以启动数据采集。该操作将触发电生理软件中的程序，驱动压电致动器，并生成包含实验图像的文件。刺激程序可根据用户需求进行修改。

4. 数据分析

1. 按照以下步骤随时间量化荧光强度。
   1. 在成像软件中打开图像文件，选择计数与测量窗口。选择多边形工具，并在被刺穿细胞的边界上绘制一个感兴趣区域（ROI）。
   2. 进入测量窗口，选择强度轮廓，将测量模式设为随时间变化，结果设为平均值，背景扣除设为无，然后点击执行。系统将随时间计算平均荧光强度（图3）。
   3. 要导出强度轮廓数据，请点击强度轮廓结果窗口中的Excel图标。这将允许用户选择目标文件夹和文件名，并以 .xlsx 格式保存数据。
2. 使用科学绘图与数据分析软件进行数据分析（参见材料表）。
   注意：通过刺击诱导的 Ca²⁺ 峰值幅度以荧光强度变化（ΔF/F）表示，其中 F 为时间 0 时 GCaMP5G 的荧光强度，ΔF 为荧光强度峰值与时间 0 时基础值之间的差值。Ca²⁺ 反应的衰减过程也可进行计算（未显示）。

结果

本方案描述了一种用于评估机械刺激诱发的Ca²⁺反应的技术，该技术结合了压力施加系统与活细胞荧光成像，可对体外培养的感觉神经元进行高时间分辨率的动态Ca²⁺信号记录。通过使用微玻璃电极向单个神经元施加受控的机械刺激，同时利用Ca²⁺敏感荧光染料（如Fura-2或Fluo-4）监测细胞内Ca²⁺浓度变化，从而量化神经元对机械刺激的响应特性。该方法适用于研究机械敏感性离子通道的功能、感觉神经元的兴奋性调控机制，以及疼痛相关疾病模型中机械痛觉敏化的细胞基础。关键步骤包括：原代感觉神经元的分离与培养、荧光染料加载、机械刺激装置的校准与操作、实时荧光图像采集及数据后处理。本技术具有良好的可重复性与空间-时间分辨率，可与其他电生理或分子生物学方法联用，为深入解析机械感觉转导通路提供有力工具。 关键词：机械刺激，Ca²⁺成像，感觉神经元，机械敏感性，疼痛，Fura-2，Fluo-4，活细胞成像²⁺ 使用荧光Ca在伞细胞中检测瞬时变化²⁺ 传感器 GCaMP5G。由于腺病毒转导具有高效性且能产生较高水平的表达，因此采用该方法在尿路上皮细胞中表达 GCaMP5G。转导后膀胱染色冷冻切片的荧光图像如图所示

讨论

所有生物体以及看似大多数细胞类型均表达能够响应机械刺激的离子通道^{20,33,34,35,36,37}这些机械激活通道的功能主要通过膜片钳技术进行评估。然而，由于可及性问题，膜片钳技术对机械激活离子通道的研究在很大程度上局限于分离细胞和细胞系。鉴于许多机械激活离子通道对Ca²⁺具有通透性²⁺，我们利用了显微镜技术、生物传感以及微操作技术的最新进展，开发了一种成像方法，用于评估机械激活通道在其中的功能 离体 尿路上皮细胞制备。在本方案中，尿路上皮细胞被携带编码GCaMP5G的腺病毒转导。腺病毒载体非常适合用于研究Ca²⁺ 尿路上皮中信号传导的研究，因为它们在尿路上皮细胞中能够实现高转导效率以...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
20倍物镜	Olympus	UMPlanFL N
24 G ¾” 导管	Medline	Suresite IV 滑动式导管
4倍物镜	Olympus	UPlanFL N
模数转换器	Molecular Devices	Digidata 1440A
抗GFP抗体	Abcam	Ab6556
分光镜	Chroma	T495lpxr
双极温度控制器	Warner Instruments	TC-344B
CaCl2	Fluka	21114-1L	1 M 溶液
cellSens 软件	Olympus		成像软件
CMOS 相机	Hamamatsu	ORCA fusion
与Alexa Fluor 488偶联的驴抗兔二抗	Jackson ImmunoResearch	711-545-152
Excel	Microsoft Corporation
滤光片	Chroma	ET470/40X
玻璃毛细管 Corning 8250 玻璃	Warner Instruments	G85150T-4
葡萄糖	Sigma	G8270
HEPES	Sigma	H4034
在线加热器	Warner Instruments	SH-27B
KCl	Sigma	793590
光源	Sutter Instruments	Lambda XL
多通道泵管	Fisherbrand	14-190-510	内径 1.52 mm
多通道泵管	Fisherbrand	14-190-533	内径 2.79 mm
MgCl2	Sigma	M9272
小鼠	Jackson Lab	664	2-4月龄雌性C57BL/6J
显微操作仪	Narishige	MF-830
显微操作器	Sutter Instruments	MP-285
显微镜	Olympus	BX51W
含DAPI的封片剂	Invitrogen	S36964	Slowfade Diamond 抗荧光淬灭封片剂含DAPI
NaCl	Sigma	S7653
pClamp 软件	Molecular Devices	Version 10.4	膜片钳电生理数据采集与分析软件
蠕动泵	Gilson	Minipuls 3
压电驱动器	Thorlabs	PAS005
移液电极 holder	World Precision Instruments
移液电极拉制仪	Narishige	PP-830
快速交换加热底座，带灌流系统和适配环套件	Warner Instruments	QE-1	适用于35 mm培养皿的快速交换平台
罗丹明-鬼笔环肽	Invitrogen	R415
Sigma-Plot	Systat Software Inc	Version 14.0	科学绘图与数据分析软件
硅橡胶弹性体	Dow	Sylgard 184
单通道开环压电控制器	Thorlabs	MDT694B
方格支架垫片	Ted Pella	10520
缝合线	AD Surgical	S-S618R13	6-0 Sylk
特氟龙安装杆	定制		用于将压电驱动器安装至显微操作器
管路	Fisher Scientific	14171129	Tygon S3 内径1/16英寸，外径1/8英寸
USB数字I/O设备	National Instruments	NI USB-6501