离体分析尿路上皮细胞中机械激活的Ca2+瞬变

摘要

本方案描述了一种利用荧光Ca²⁺成像技术评估天然尿路上皮细胞中机械激活离子通道功能的方法²⁺ 传感器 GCaMP5G

摘要

机械激活离子通道是一类生物换能器，可将拉伸或剪切力等机械刺激转化为电信号和生化信号。在哺乳动物中，机械激活通道在感知外部和内部刺激过程中发挥关键作用，涉及多种生理过程，如触觉感知、听觉、红细胞容积调节、基础血压调控以及膀胱充盈感的产生。尽管机械激活离子通道的功能已在 体外 使用膜片钳技术在体外研究离子通道功能时，评估其在天然环境中的作用仍是一项艰巨的任务，通常是因为难以接触到这些通道的表达部位（例如传入神经末梢、默克尔细胞、压力感受器和肾小管），或由于应用膜片钳技术存在困难（例如尿路上皮伞细胞的顶膜表面）。本方案描述了一种评估机械刺激诱发的Ca²⁺²⁺ 使用荧光传感器GCaMP5G检测瞬时钙信号 离体 尿路上皮制备，一种可轻松适用于机械刺激诱导的Ca²⁺反应研究的技术²⁺ 其他天然组织样本中的事件。

引言

当尿液滤过物流经肾单位，以及尿液从肾盂被泵出并经输尿管输送至膀胱储存时，泌尿道中的上皮细胞会受到机械力的作用。长期以来人们已认识到，体液对泌尿道上皮细胞施加的机械力（例如剪切应力和牵张力）可调控近端小管中蛋白质的重吸收以及远端肾单位中溶质的重吸收^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13}，同时也调控尿液在膀胱中的储存及排尿过程^14,15

方案

动物的饲养和处理均按照匹兹堡大学机构动物护理和使用委员会的规定进行。本研究使用2至4月龄的雌性C57Bl/6J小鼠。小鼠通过商业途径获得（见材料表）。

1. 仪器组装与设置

1. 进行 Ca²⁺ 使用配备高分辨率相机和稳定光源的直立显微镜进行成像（参见 材料表).
   1. 使用显微镜配套软件获取图像，该软件需能够直接控制相机、光源和压电驱动器 通过 一个USB数字输入/输出设备（参见 材料表).
      注意： 图1 示意图展示了实验装置。GCaMP5G 的峰值激发波长为 470 nm，峰值发射波长为 497 nm²⁸使用适用于 GCaMP5G 成像的滤光片组。
2. 为了刺激膀胱黏膜制备物中的单个尿路上皮细胞（见步骤2），使用由单通道开环压电控制器控制的压电致动器（见 材料清单将压电驱动器安装在显微操作器上。
   1. 将玻璃微量移液管安装在固定于压电驱动器上的移液管架中图1）。通过由电生理数据采集与分析程....

结果

本方案描述了一种用于评估机械刺激诱发的Ca²⁺反应的技术，该技术结合了压力施加系统与活细胞荧光成像，可对体外培养的感觉神经元进行高时间分辨率的动态Ca²⁺信号记录。通过使用微玻璃电极向单个神经元施加受控的机械刺激，同时利用Ca²⁺敏感荧光染料（如Fura-2或Fluo-4）监测细胞内Ca²⁺浓度变化，从而量化神经元对机械刺激的响应特性。该方法适用于研究机械敏感性离子通道的功能、感觉神经元的兴奋性调控机制，以及疼痛相关疾病模型中机械痛觉敏化的细胞基础。关键步骤包括：原代感觉神经元的分离与培养、荧光染料加载、机械刺激装置的校准与操作、实时荧光图像采集及数据后处理。本技术具有良好的可重复性与空间-时间分辨率，可与其他电生理或分子生物学方法联用，为深入解析机械感觉转导通路提供有力工具。 关键词：机械刺激，Ca²⁺成像，感觉神经元，机械敏感性，疼痛，Fura-2，Fluo-4，活细胞成像²⁺ 使用荧光Ca在伞细胞中检测瞬时变化²⁺ 传感器 GCaMP5G。由于腺病毒转导具有高效性且能产生较高水平的表达，因此采用该方法在尿路上皮细胞中表达 GCaMP5G。转导后膀胱染色冷冻切片的荧光图像如图所示

讨论

所有生物体以及看似大多数细胞类型均表达能够响应机械刺激的离子通道^{20,33,34,35,36,37}这些机械激活通道的功能主要通过膜片钳技术进行评估。然而，由于可及性问题，膜片钳技术对机械激活离子通道的研究在很大程度上局限于分离细胞和细胞系。鉴于许多机械激活离子通道对Ca²⁺具有通透性²⁺，我们利用了显微镜技术、生物传感以及微操作技术的最新进展，开发了一种成像方法，用于评估机械激活通道在其中的功能 离体 尿路上皮细胞制备。在本方案中，尿路上皮细胞被携带编码GCaMP5G的腺病毒转导。腺病毒载体非常适合用于研究Ca²⁺ 尿路上皮中信号传导的研究，因为它们在尿路上皮细胞中能够实现高转导效率以.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
20倍物镜	Olympus	UMPlanFL N
24 G ¾” 导管	Medline	Suresite IV 滑动式导管
4倍物镜	Olympus	UPlanFL N
模数转换器	Molecular Devices	Digidata 1440A
抗GFP抗体	Abcam	Ab6556
分光镜	Chroma	T495lpxr
双极温度控制器	Warner Instruments	TC-344B
CaCl2	Fluka	21114-1L	1 M 溶液
cellSens 软件	Olympus		成像软件
CMOS 相机	Hamamatsu	ORCA fusion
与Alexa Fluor 488偶联的驴抗兔二抗	Jackson ImmunoResearch	711-545-152
Excel	Microsoft Corporation
滤光片	Chroma	ET470/40X
玻璃毛细管 Corning 8250 玻璃	Warner Instruments	G85150T-4
葡萄糖	Sigma	G8270
HEPES	Sigma	H4034
在线加热器	Warner Instruments	SH-27B
KCl	Sigma	793590
光源	Sutter Instruments	Lambda XL
多通道泵管	Fisherbrand	14-190-510	内径 1.52 mm
多通道泵管	Fisherbrand	14-190-533	内径 2.79 mm
MgCl2	Sigma	M9272
小鼠	Jackson Lab	664	2-4月龄雌性C57BL/6J
显微操作仪	Narishige	MF-830
显微操作器	Sutter Instruments	MP-285
显微镜	Olympus	BX51W
含DAPI的封片剂	Invitrogen	S36964	Slowfade Diamond 抗荧光淬灭封片剂含DAPI
NaCl	Sigma	S7653
pClamp 软件	Molecular Devices	Version 10.4	膜片钳电生理数据采集与分析软件
蠕动泵	Gilson	Minipuls 3
压电驱动器	Thorlabs	PAS005
移液电极 holder	World Precision Instruments
移液电极拉制仪	Narishige	PP-830
快速交换加热底座，带灌流系统和适配环套件	Warner Instruments	QE-1	适用于35 mm培养皿的快速交换平台
罗丹明-鬼笔环肽	Invitrogen	R415
Sigma-Plot	Systat Software Inc	Version 14.0	科学绘图与数据分析软件
硅橡胶弹性体	Dow	Sylgard 184
单通道开环压电控制器	Thorlabs	MDT694B
方格支架垫片	Ted Pella	10520
缝合线	AD Surgical	S-S618R13	6-0 Sylk
特氟龙安装杆	定制		用于将压电驱动器安装至显微操作器
管路	Fisher Scientific	14171129	Tygon S3 内径1/16英寸，外径1/8英寸
USB数字I/O设备	National Instruments	NI USB-6501