获得性甲状旁腺功能减退症（HypoPT）的动物模型对于理解HypoPT如何影响矿物质离子稳态以及验证新型治疗方法的有效性至关重要。本文介绍了一种利用碳纳米颗粒进行甲状旁腺切除术（PTX）以建立获得性甲状旁腺功能减退症（AHypoPT）大鼠模型的技术。
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方法文章
低甲状旁腺大鼠的制备 通过 碳纳米颗粒辅助甲状旁腺切除术
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
甲状旁腺功能减退症（HypoPT）是一种累及甲状旁腺的罕见疾病，其特征是甲状旁腺激素（PTH）分泌减少或活性降低，导致血清磷水平升高和血清钙水平降低。HypoPT 最常见于甲状腺或其他颈部前路手术过程中意外损伤或切除甲状旁腺所致。近年来，甲状腺/甲状旁腺手术日益普遍，术后发生 HypoPT 的病例也随之增加。目前迫切需要建立一种 HypoPT 动物模型，以深入理解 HypoPT 对矿物质离子稳态影响的机制，并验证新型治疗方法的疗效。本文报道了一种利用碳纳米颗粒进行甲状旁腺切除术（PTX）在雄性大鼠中建立获得性 HypoPT 的技术。该大鼠模型相较于小鼠模型具有显著优势。 重要的是，人 PTH 受体结合区与大鼠的序列相似性为 84.2%，高于与小鼠的 73.7%。此外，雌激素对 PTH/PTHrP 受体信号通路可能产生影响，但在雄性大鼠中的作用尚未充分研究。碳纳米颗粒是一种淋巴示踪剂，可将甲状腺淋巴结染成黑色而不影响其功能，但不会染色甲状旁腺，从而便于识别和切除。本研究中，PTX 后血清 PTH 水平无法检测到，并由此引发显著的低钙血症和高磷血症。因此，该大鼠模型能够很好地模拟术后 HypoPT 的临床状态。综上所述，碳纳米颗粒辅助的 PTX 可作为研究 HypoPT 发病机制、治疗及预后的极为有效且易于实施的模型。
引言
甲状旁腺激素（PTH）由甲状旁腺分泌，是钙平衡的主要调节因子，可维持磷代谢，并参与骨转换1,2。甲状旁腺功能减退症（HypoPT）表现为PTH分泌减少或功能丧失，是一种罕见的内分泌疾病，患病率约为每10万人年9–37例3,4,5。HypoPT的特征是血清PTH和钙水平降低，同时伴有血清磷升高6,7。根据病因不同，HypoPT可分为获得性甲状旁腺功能减退症（AHypoPT）和特发性甲状旁腺功能减退症（IHypoPT）8。在临床实践中，AHypoPT更为常见，约75%的AHypoPT病例是由于甲状腺手术或其他头颈部手术过程中甲状旁腺被切除或意外损伤所致。其他病因包括头颈部肿瘤的放疗和化疗以及药物毒性1,8。随着诊断技术的进步以及甲状腺相关疾病筛查的增加，甲状腺手术的数量不断上升，从而导致相关的甲状旁腺并发症相应增加9
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方案
本研究经四川大学口腔疾病研究国家重点实验室动物护理与使用委员会批准。实验前已获得相关地方机构的许可。本研究使用八只8至10周龄的雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，平均体重为200–250 g。动物购自商业来源（见 材料表）。提供食物和水 随意摄取 在整个实验期间。
1. 制备碳纳米颗粒辅助的PTX大鼠的术前准备
- 使用2.0%-2.5%异氟烷吸入麻醉8-10周龄大鼠，随后按10 mL/kg体重剂量腹腔注射（i.p.）三溴乙醇。通过检测瞳孔对光反射消失来确认麻醉深度充分。麻醉期间使用兽用眼膏涂抹眼睛，防止角膜干燥。
注意：8-10周龄大鼠被认定为成年大鼠。然而，该建模方法也可用于低至7日龄的大鼠。 - 将麻醉后的SD大鼠置于仰卧位，剃除颈部腹侧区域的毛发以准备手术。使用聚维酮碘棉球对术区进行消毒（参见材料表）。
- 用手术巾覆盖动物（参见材料表），仅暴露手术区域，以尽量减少微生物污染。
2. 甲状旁腺切除术（PTX）
- 使用手术刀从两耳之间的中点开始，沿纵轴向尾部做一条2 cm的切口。依次使用尖头、弯曲、带齿镊....
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结果
在解剖显微镜下首次观察了大鼠甲状旁腺的位置和数量。注射碳纳米颗粒前，甲状腺呈半透明红色，在显微镜下几乎无法分辨甲状旁腺（图1A）。注射纳米颗粒后，甲状腺被染成黑色，而甲状旁腺未被染色（图1B）。通过仔细分离颜色较浅的甲状旁腺，可保持甲状腺不受影响（图1C）。通常，甲状旁腺分布在甲状腺的外侧或后缘。
图 1：手术过程中甲状腺与甲状旁腺的外观。
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讨论
流行病学报告表明，甲状腺疾病的检出率显著上升，相关手术的数量也随之增加19,20。术后甲状旁腺功能减退症的发病率为约7.6%8,21，而获得性甲状旁腺功能减退症发病率的上升使得这一罕见疾病获得了更多的研究关注。因此，建立一个合适的动物模型以研究该疾病的发病机制并评估新型治疗方法的效果显得尤为重要。然而，目前可用的动物模型十分有限，且在构建模型过程中，手术的成功率、动物的存活率以及操作难度仍存在诸多问题。本课题组此前曾报道了两种小鼠甲状旁腺功能减退症（HypoPT）模型。在PTHcre+/Rosa-mTmG小鼠中，甲状旁腺被荧光标记，有助于精确分离甲状旁腺，该方法也有助于发现解剖位置异常的甲状旁腺，从而提高手术成功率14。另一种建模方法采用转基因小鼠，其甲状旁腺细胞可被白喉毒素靶向，随后通过系统性给予白喉毒素即可破坏甲状旁腺，无需实施手术.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作得到国家自然科学基金资助项目81800928、四川大学华西口腔医学院/医院科研经费（编号：RCDWJS2021-1）以及口腔疾病研究国家重点实验室开放基金项目SKLOD-R013的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.9% 氯化钠溶液 | Kelun Co. 四川，中国 | ||
| 10 µL 30G NanoFil 注射器 | WPI | ||
| 带针 6-0 聚乳酸-910 缝合线 | Ethicon, Inc | J510G | |
| 钙 LiquiColor 检测试剂 | EKF | 0155-225 | 用于 Ca2+ 分析 |
| 碳纳米颗粒混悬注射液 | Lummy，重庆，中国 | H20073246 | 1 mL : 50 mg |
| 肌酐（Cr）检测试剂盒（肌氨酸氧化酶法） | 建城，南京，中国 | C011-2-1 | 用于肌酐分析 |
| 一次性手术刀 | 新华，中国 | ||
| Dumstar 生物镊 | 新华，中国 | ||
| 微型解剖弹簧剪 | 新华，中国 | ||
| MicroVue 大鼠完整甲状旁腺激素 ELISA 试剂盒 | Immunotopics | 30-2531 | 用于测定大鼠血清中的 PTH |
| 持针器 | 新华，中国 | ||
| 磷 Liqui-UV 检测试剂 | EKF | 0830-125 | 用于无机磷（Pi）分析 |
| 多层纱布 | 维安，河南，中国 | ||
| 聚维酮碘 | 永安制药有限公司，成都，中国 | ||
| Prism 9.0（统计与绘图软件） | GraphPad Software, Inc.，加利福尼亚州圣地亚哥，美国 | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ | |
| 大鼠 I 型胶原 C-端肽（CTX-I）ELISA 试剂盒 | CUSABIO，武汉，中国 | CSB-E12776r | 用于 CTX-I 分析 |
| 大鼠骨钙素/骨 Gla 蛋白（OT/BGP）ELISA 试剂盒 | CUSABIO，武汉，中国 | CSB-E05129r | 用于骨钙素分析 |
| 安全单刃剃须刀片 | American Safety Razor Company | 66-0089 | |
| Sprague-Dawley 大鼠 | 8 至 10 周龄 | ||
| 手术切口巾 | 良友，四川，中国 | ||
| 尿素检测试剂盒 | 建城，南京，中国 | C013-2-1 | 用于尿素分析 |
参考文献
- Bilezikian, J. P., et al. Hypoparathyroidism in the adult: Epidemiology, diagnosis, pathophysiology, target-organ involvement, treatment, and challenges for future research. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (10), 2317-2337 (2011).
- Bilezikian, J. P.
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