本文介绍了一种新设计的3D打印插入式装置，作为共培养模型，并通过研究内皮细胞与角质形成细胞之间的旁分泌细胞间通讯对其进行了验证。
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摘要
摘要
对不同类型细胞间间接通讯的经典分析通常需要使用条件培养基。此外，条件培养基的制备过程耗时，且与生理和病理条件相差较远。尽管目前已有少数商用共培养模型，但这些模型仍局限于特定检测，且大多仅适用于两种细胞类型。
本研究中使用了与多种功能检测兼容的3D打印插件。该插件可将6孔板中的一个孔分为四个独立的区域，支持多种组合方式。此外，每个区域的侧壁上均设计有窗口，使得各区域之间可通过培养基以体积依赖的方式实现潜在的细胞间通讯。例如，可在单层培养、三维（球状体）培养或两者结合的条件下，研究四种不同类型细胞之间的旁分泌细胞间通讯。同时，也可在同一区域中以二维或三维（类器官）形式共接种多种不同类型的细胞。3D打印插件无底部结构，因此可在培养板上维持常规的培养条件，允许对含有插件的培养板进行包被处理，并可通过光学显微镜直接观察。多个独立区域的设计使得能够分别收集不同类型的细胞，或在每个区域中使用不同的试剂进行RNA或蛋白质提取。本研究提供了详细的实验方法，用于将新型3D打印插件作为共培养系统使用。为展示该模型灵活且简便的多种应用能力，已在新型3D打印插件中重复了先前已发表的细胞通讯功能检测实验，并证实其结果具有可重复性。使用3D打印插件与传统条件培养基培养方法获得的结果相似。综上所述，该3D打印插件是一种结构简单、可适配于多种贴壁细胞共培养模型的实验装置。
引言
体内，细胞通过直接方式（细胞接触）或间接方式（分泌分子）相互交流。为了研究细胞间通讯，可以建立不同的共培养模型，例如直接共培养（不同类型的细胞在同一孔中直接相互作用）和区室化共培养（不同类型的细胞在培养系统的不同区室中进行间接相互作用）1。此外，还可使用条件培养基构建共培养系统，其中效应细胞类型分泌的分子存在于条件培养基中，并被转移至反应细胞类型，从而实现间接相互作用1。
在旁分泌细胞通信研究中，间接共培养系统可提供高度模拟细胞间相互作用的模型 体内间接共培养系统已被开发并实现商业化，可用于建立间接共培养模型2,3遗憾的是，大多数间接共培养系统仅提供两个区室。其他一些间接共培养系统虽具备多个区室，但其可扩展性较本论文所报道的系统差。其中某些系统无法在显微镜下进行常规观察，且通常具有特定的应用方法。在多项研究中，不同细胞类型之间的旁分泌通讯是通过条件培养基模型来探究的。4,5,6,7这比间接共培养系统更易于研究，因为它不需要建立特定的方法或材料。1另一方面，条件培养基的制备耗时较长，且仅能提供单向细胞信号传导（效应细胞至反应细胞）的信息。1.
本文提出了一种研究细胞间通讯的全新且简便的方法。该方法允许多种细胞类型以直接或间接相互作用的方式，在二维或三维体系中进行组合，而打印的插入式培养装置在建立共培养模型方面具有诸多优势。该3D打印插入装置经过设计，可适配于6孔板的孔内，呈圆形结构，并能将每个孔分隔为四个独立的区域（两个大区域和两个小区域；图1A）。3D打印插入装置的特点在于无底部结构，因此细胞可直接与插入装置所放置的培养板表面接触。此外，各个区域可独立进行包被处理。同时，细胞行为可通过光学显微镜方便地进行观察。插入装置的每一侧壁上均设有通讯窗口，可在合适的时间加入共用培养基，从而开展多种类型的共培养实验。该系统支持多种共培养组合，可用于研究多种细胞类型之间的直接和/或间接通讯。例如，可构建包含四种不同细胞类型的间接共培养模型，且可在单层和/或三维（类球体）条件下进行。通过在同一区域中混合不同细胞类型，也可实现直接与间接共培养模型的组合。此外，还可构建用于研究复杂结构（如类器官、组织外植体等）对不同类型细胞影响的模型。同时，3D打印插入装置兼容多种细胞生物学功能检测（如增殖、迁移、假管形成、分化等）以及生物化学检测（如DNA、RNA、蛋白质、脂质等的提取）。最后，该3D打印插入装置为共培养模型提供了广泛的实验设计可能性，能够在同一实验的不同区域中同时整合多种检测方法。
本文展示了3D打印插入式培养装置的某些性能，以验证其作为一种快速且易于使用的共培养模型的有效性。与先前关于旁分泌细胞通讯的研究相比，本研究证明了3D打印插入式装置作为有价值的共培养模型的能力。为评估这一点，比较了3D打印插入式系统与使用条件培养基的经典系统在角质形成细胞对内皮细胞增殖和迁移调控方面的作用。与使用条件培养基的传统系统相比，3D打印插入式装置能够更快地获得相似的结果。事实上，该3D打印插入式装置提供了一种稳健的模型，可用于研究双向细胞相互作用，无需制备条件培养基，并可在同一实验中平行开展增殖和迁移检测。
总之，本文提出了一种新颖且即用型的细胞通讯研究模型。该3D打印插入装置适用于所有贴壁细胞类型，可实现多种共培养组合，旨在更接近 体内 条件。
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方案
注意：3D 插件（图 1A）为商业采购，采用与细胞培养和高压灭菌兼容的光敏聚合物树脂打印而成（参见材料表）。本节详细描述了通过插件建立共培养模型的实验方案（参见图 1B），并提供了一些应用示例。
1. 将灭菌后的插入物放置于6孔板中
- 根据制造商说明，按10:1（v/v）的比例混合试剂盒中提供的两种组分（见材料表）：食品级硅胶（试剂A）和催化剂（试剂B）。（图1Ba）。使用经70%乙醇灭菌的刮刀混合两种组分。
注意：所需配制的硅胶混合物体积取决于待固定的插件数量。催化剂过量可能导致硅胶混合物固化过快。 - 用镊子将插件放置在硅胶混合物上，使混合物均匀分布在插件的底缘（图1Bb）。将插件放入6孔板的孔中，并轻轻按压插件，确保插件与板紧密贴合，以避免细胞培养基泄漏（图1Bc）。
- 将板置于37 ˚C条件下，促进硅胶固化，持续1小时。
注意：固化时间取决于所添加催化剂的量。 - 固化完成后，将含插件的板浸入70%乙醇溶液中30分钟至1小时，进行灭菌处理。
- 用移液器吸除乙醇，并将板在细胞培养超净台中开盖过夜晾干。
注意：进行下一步操作前，必须确保乙醇完全挥发，以避免细胞固定和毒性。含有插件的板在室温下干燥、无菌条件下可保存数天，待用。
2. 包被（如多聚-L-赖氨酸或聚-HEMA）（可选步骤）
注意：本实验未进行包被操作，提供这些步骤是为了说明小室包被的可能性。
- 根据制造商的说明配制包被液。
- 对于插入物的包被，最大孔室使用 200–400 µL 体积，最小孔室使用 50–100 µL 体积。将包被液分别加入各个孔室中。
- 按照制造商指示，在无菌条件下使包被液干燥。
3. 细胞接种
- 按照制造商的建议培养外根鞘角质形成细胞（KORS）和人真皮微血管内皮细胞（HDMECs）。当细胞达到汇合状态时，制备细胞悬液。
- 弃去培养瓶中的培养基，并加入 5 mL 胰蛋白酶以消化细胞（参见材料表）。
- 将含有 KORS 的培养瓶置于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 5 分钟；将含有 HDMECs 的培养瓶在室温下孵育 5 分钟。
- 将含有 KORS 的胰蛋白酶溶液与 5 mL 添加了 5% 胎牛血清（FBS）和生长因子（基础培养基加补充剂套装，参见材料表）的间充质干细胞培养基（MSCM）混合；将含有 HDMECs 的胰蛋白酶溶液与 5 mL 添加了 5% FBS 和生长因子的内皮细胞培养基（ECM）混合（参见材料表）。
- 将细胞转移至 15 mL 无菌锥形管中。在室温下以 200 x g 离心 5 分钟，分别收集 KORS 和 HDMEC 悬液。
- 弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于 2 mL 相应的培养基中。
- 取 10 µL 细胞悬液与 10 µL 台盼蓝染液混合（参见材料表）。
- 取 10 µL 混合液加入细胞计数板的计数室中。
- 将计数板插入细胞计数系统（参见材料表），检测细胞数量和活率。
- 用相应的培养基将细胞悬液调整至浓度为 0.5 x 105 个细胞/mL。
注：若不同类型的细胞需要不同的贴壁时间和/或达到理想汇合度的时间，可根据细胞类型在不同时间点进行接种。
- 使用移液器将 800 µL 至 1 mL 的细胞悬液加入各个大腔室，将 100–150 µL 的细胞悬液加入各个小腔室。
- 在其中一个大腔室中，以 1 x 105 个细胞/mL 的密度将 KORS 接种于添加了 5% FBS 和生长因子的 MSCM 培养基中。
- 在小腔室中以 2.5 x 103 个细胞/mL 的密度、在另一个大腔室中以 1.25 x 105 个细胞/mL 的密度，将 HDMEC 接种于添加了 5% FBS 和生长因子的 ECM 培养基中。
注：增殖实验可在小腔室中进行，迁移和活率实验可在大腔室中进行。接种细胞的浓度已根据制造商的建议优化，该浓度可确保细胞在孵育 24–48 小时后具有良好的存活率。
- 将细胞培养板置于 37 ˚C、5% CO2 条件下，或在常规培养条件下孵育，以促进细胞贴壁和/或成熟。
注：在不更换培养基的情况下孵育细胞 24–48 小时。如有需要，各腔室的培养基可独立更换。
4. 共培养的实施（ 图1Bd）
注意：共培养的实施对应于添加共同培养基的时间。通过为不同隔室中的所有细胞类型添加同一种培养基，由于存在通讯窗口（3D打印插入件壁上的椭圆形孔），可实现细胞间的旁分泌通讯。要实施共培养，请遵循步骤4.1-4.3。
- 使用移液器吸出插入式培养板各区室中的培养基。若为三维球状细胞培养，需非常轻柔地弃去培养基。
- 用1 mL 37 °C预热的PBS冲洗大区室，用200 µL 37 °C预热的PBS冲洗小区室。确保轻柔洗涤，避免细胞脱落。
- 加入3 mL适用于所有细胞类型的通用培养基。
注意：本研究中使用基础ECM（不含FBS和生长因子）。确保培养基覆盖所有区室（液面高于通道窗[壁上的椭圆形孔]，如图1A所示）。 - 将含有共培养细胞的培养板置于37 ˚C、5% CO2的培养箱中培养24–48小时。
5. 细胞观察、计数与刮取
- 在培养24-48小时后，通过光学显微镜观察实验过程中不同区域的细胞形态并计数细胞数量。
注意：预期的细胞数量取决于所使用的细胞类型（大小、形态等）以及区域的尺寸。在本实验中，大区域内的KORS细胞数量为0.5 × 106-1 × 106/mL，HDMECs细胞数量为0.25 × 106-0.75 × 106/mL。 - 使用胰蛋白酶消化法使细胞脱离，以便进行细胞悬液计数。
注意：对于细胞脱离溶液，建议最大区域使用100-500 µL，最小区域使用10-50 µL。 - 通过台盼蓝染色法检测细胞活力（参见步骤3.1.6-3.1.8）。
6. 插入清洁以进行回收
- 实验结束时，通过轻微扭转从6孔板中取出插件（图1Be）。
- 通过拉扯将硅胶从插件上移除。如有必要，使用刮刀清除残留在插件壁上的硅胶（图1Bf）。
- 使用常规的细胞培养用洗涤剂和清洁材料清洗插件（示例见材料表）。
- 将插件在高压灭菌器中进行灭菌处理（固体循环，121 ˚C，20 分钟），或将其浸入70%乙醇溶液中1小时，以备后续使用。
注意：从本步骤起，将使用3D打印插件描述两个可能的实验示例（增殖和迁移实验）（图1Bd）。
7. 细胞增殖检测——WST-1 检测
- 按照步骤 1–3.1 培养细胞。
注意：请按照本节中的步骤建立共培养系统，以研究KORS分泌组对HDMEC增殖的影响。使用KORS细胞以与先前发表的数据进行比较8.- 将KORS以1 x 10接种5 细胞/mL，在间充质干细胞培养基（MSCM在大隔室中加入含5% FBS和生长因子的培养基。
- 将细胞培养板置于37 ˚C、5% CO₂的培养箱中2 24小时。
- 将HDMECs接种于内皮细胞培养基（ECM) 加入5% FBS和生长因子的培养基，细胞密度为2.5 × 103 细胞/mL，在小隔室中。
- 将细胞培养板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中2 24–48 小时。
- 弃去所有隔室中的培养基，通过加入 3 mL 未添加补充物的基础 EC 培养基建立共培养系统M （3D打印插件所有区域的通用细胞培养基）
- 将 WST-1 在 EC 中稀释M 普通细胞培养基（1:10 最终稀释度）配制 WST-1 溶液。
注意：WST-1 溶液的体积需额外准备至少 500 µL 用于空白对照。 - 用移液器吸弃插入式培养皿中的细胞培养基。
- 向选定的孔中加入 WST-1 溶液（小孔加 150 µL，大孔加 600 µL）。将培养板置于 37 ˚C、5% CO₂ 条件下孵育。2.
- 在最佳的30分钟细胞孵育时间后，从每种条件的96孔板中转移100 µL孵育液。
- 使用微孔板读数仪在420 nm至480 nm波长范围内检测比色反应。
- 将酶标板放入酶标仪中，然后点击按钮 编辑新方案.
- 选择特定类型的96孔板（参见 材料表使用的波长为 450 nm。
- 点击按钮 开始测量.
8. 细胞迁移实验——双迁移室装置
- 按照步骤1-3.1进行细胞培养。
注意：请按照本节中的步骤操作，以建立共培养系统，从而研究KORS分泌组对HDMEC增殖的影响。- 将KORS以1 × 10接种5 细胞/mL，在MSC中M 添加5% FBS及生长因子至其中一个较大的隔室中。
- 将细胞培养板置于37 ˚C、5% CO₂的培养箱中2 24 小时。
- 将两个迁移室装置放入插入物的另一个大隔室中。
- 将HDMECs接种于EC中M 添加5% FBS和生长因子，细胞密度为7 x 105 双迁移室装置中每孔的细胞数。
- 将细胞培养板置于37 °C、5% CO₂条件下培养2 24 小时。
- 24 小时后或根据迁移细胞类型确定的最佳时间点弃去培养基和两个迁移室装置。通过加入 3 mL 未添加补充物的基础 EC 培养基实施共培养系统M.
注意：操作需谨慎，避免细胞脱落。如果细胞对加入常规培养基后引起的脱落特别敏感，可在加入常规培养基后立即取下两个迁移室装置。
- 在不同时间点，使用10倍放大倍数的相差显微镜观察并拍摄细胞覆盖表面的照片。
注意：图片使用相差显微镜拍摄（参见 材料表）。图片保存在U盘中，随后使用软件的伤口愈合分析插件进行分析（参见 材料表). - 使用经典的定量分析软件测量未覆盖的表面。
- 在软件中打开图像，并激活宏列表中可用的伤口愈合工具。
- 点击 m 按钮用于测量迁移图像中未覆盖的表面区域。
- 未覆盖表面面积根据以下公式计算：
覆盖率百分比 = [（T0 时刻无细胞区域的平均面积 − T 时刻无细胞区域的面积）/ T0 时刻无细胞区域的平均面积] × 100
注意：3D打印插入物完全适用于大多数细胞生物学技术（如假管形成实验、3D培养）以及生物化学实验（如DNA、RNA、蛋白质提取）。
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结果
在本研究中，描述了一种优化的共培养系统，通过使用条件培养基，可获得与经典方法相当的稳健、可靠且具有显著性的数据。3D打印的插入式培养装置模拟了 体内 通过克服实验前期制备条件培养基的困难及耗时问题，实现对不同类型细胞相互作用下微环境条件的分析。一项先前发表的研究已被重新开展，以分析毛囊中两种细胞类型之间的间接相互作用：人真皮微血管内皮细胞（HDMECs）和人毛囊外根鞘角质形成细胞（KORS）。8在此，通过使用3D打印插入物与传统条件培养基方法相比，验证了研究HDMECs与KORS之间间接相互作用所得结果的可重复性。本研究先前所述的细胞培养条件8 与本研究中的条件相同。根据3D打印插入物的尺寸对实验条件进行了调整（见实验方案）。首先，对于所有细胞类型，两种条件（条件培养基与3D打印插入物）之间的表型和细胞活力具有可比性（图2）。事实上，在6孔板的孔中观察到90%的细胞存活率（图2A 和 表1<...
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讨论
间接细胞通讯通常通过条件培养基或共培养系统装置进行研究。条件培养基的制备在实验上游耗时较长，且该方法仅限于单向效应分析。Colin-Pierre 等8此前利用条件培养基开展的研究，探讨了两种细胞类型（HDMECs 和 KORS）之间的间接细胞通讯。该前期研究的数据表明，KORS 条件培养基对 HDMEC 的增殖具有影响，并且还影响 HDMEC 的迁移、假管形成以及 GPC1 表达8。本研究描述了一种更简便、更快速的间接细胞通讯研究方法。事实上，3D 打印插入装置可灵活设计实验方案，并实现多种细胞培养组合。为验证这些 3D 打印插入装置作为共培养模型的有效性，本文对细胞增殖和细胞迁移进行了分析，并与前期使用条件培养基的研究进行了比较8。在两项研究中，均采用双迁移室装置（置于含或不含插入物的孔中的 µ-Dish 35 mm 2 Well 培养插件）进行伤口愈合实验。这种迁移检测装置9,
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
本研究由巴斯夫美容护理解决方案公司（BASF Beauty Care Solutions）合作完成。Charlie Colin-Pierre 女士是由巴斯夫与法国国家科学研究中心（CNRS）资助的博士研究生。
我们感谢 Mehdi Sellami 先生设计了3D打印插件。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 高压灭菌器 | Getinge | APHP | 固体循环，121 °C 灭菌 20 分钟 |
| Biomed Clear 树脂 | Formlabs | RS-F2-BMCL-01 | 由法国兰斯 3D-Morphoz 公司完成打印 |
| 细胞培养用清洁剂 | Tounett | A18590/0116 | |
| 细胞增殖试剂 WST-1 | Roche | 11,64,48,07,001 | |
| 细胞计数板 | NanoEnTek | EVE-050 | |
| 35 mm μ-皿双孔培养插件 | Ibidi | 80206 | 双迁移腔装置 |
| 内皮细胞培养基 | ScienCell | 1001 | 基础培养基，添加 25 mL 胎牛血清（FBS, 0025）、5 mL 内皮细胞生长补充剂（ECGS, 1052）和 5 mL 青霉素/链霉素溶液（P/S, 0503）。 |
| EVE 全自动细胞计数仪 | NanoEnTek | NESCT-EVE-001E | |
| EVOS XL Core 显微镜 | Fisher Scientific | AMEX1200 | 10 倍放大倍数 |
| 食品级硅胶试剂与催化剂套装 | Artificina | RTV 3428 A 和 B | （10:1） |
| FORM 3B 打印机 | Formlabs | PKG-F3B-WSVC-DSP-BASIC | 由 3D-Morphoz 公司完成打印 |
| 人真皮微血管内皮细胞（HDMEC） | ScienCell | 2000 | |
| 毛囊外根鞘角质形成细胞（KORS） | ScienCell | 2420 | |
| 宏创面愈合分析软件 | ImageJ | 用于测量未覆盖区域面积（适用于细胞迁移实验） | |
| 间充质干细胞培养基 | ScienCell | 7501 | 基础培养基，添加 25 mL 胎牛血清（FBS, 0025）、5 mL 间充质干细胞生长补充剂（MSCGS, 7552）和 5 mL 青霉素/链霉素溶液（P/S, 0503） |
| 微孔板读数仪 SPECTRO star NANO | BMG Labtech | BMG LABTECH 软件 | |
| PBS | Promocell | C-40232 | 不含 Ca2+ / Mg2+ |
| 台盼蓝染色液 | NanoEnTek | EBT-001 | |
| 胰蛋白酶/EDTA | Promocell | C-41020 | KORS 细胞在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 5 分钟；HDMEC 细胞在室温下孵育 5 分钟 |
| 96 孔 Nunclon Delta 表面培养板 | Thermoscientific | 167008 |
参考文献
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