创新的 3D 打印插入物，旨在实现简单的 2D 和 3D 细胞培养

在体内，细胞直接（细胞接触）或间接（通过分子分泌）相互交流。为了研究细胞通讯，可以开发不同的共培养模型，例如直接共培养（不同的细胞类型在同一孔中直接相互作用）和区室共培养（不同的细胞类型在培养系统的不同隔室中间接相互作用）¹。此外，条件培养基可用于共培养系统，其中间接相互作用是通过将效应细胞类型的条件培养基中包含的分泌分子转移到¹型应答细胞来实现的。

在旁分泌细胞通讯研究的情况下，间接共培养系统提供了强烈反映体内细胞相互作用的模型。间接共培养系统已经开发并商业化，允许建立间接共培养模式^2,3。不幸的是，大多数间接共培养系统仅提供两个隔室。其他间接共培养系统提供多个隔室，但与本手稿中报告的系统相比，它们的可扩展性较差。其中一些不允许在显微镜下进行经典的可视化，并且它们通常提供特定的应用方法。在几项研究中，不同细胞类型之间的旁分泌通讯由条件培养基模型^4,5,6,7探测。与间接共培养系统相比，这是一种更简单的研究方法，因为它不需要建立特定的方法或材料¹.另一方面，条件培养基的制备非常耗时，并且仅提供有关单向细胞信号传导（效应器到应答器）的信息¹。

在本文中，提出了一种新的、简单的研究细胞通讯的方法。打印的插入物允许以直接或间接相互作用以及2D或3D格式组合多种细胞类型，为轻松建立共培养模型提供了许多优势。适合放置在6孔板的孔中，3D打印插入物是圆形的，可以将孔分成四个隔室（两个大隔室和两个小隔室; 图1A）。3D打印插件的特点是没有底部。因此，细胞与放置插入物的板直接接触。此外，每个隔间都可以独立于其他隔间进行涂层。此外，在光学显微镜下可以轻松跟踪细胞行为。插入物每壁中存在通信窗口，允许在最佳时间添加公共培养基以执行不同的共培养实验。可以进行多种共培养组合，以研究几种细胞类型之间的直接和/或间接通讯。例如，可以设计单层和/或3D（球状体）中四种不同细胞类型之间的间接共培养模型。直接和间接共培养模型的组合也可以通过在同一隔室中混合不同的细胞类型来进行。复杂结构（类器官、组织外植体等）对不同细胞类型的影响可能是可以建立模型的另一个例子。此外，3D打印插入片段与细胞生物学功能测定（增殖，迁移，假管形成，分化等）和生物化学测试（提取DNA，RNA，蛋白质，脂质等）兼容。最后，3D打印的插入物提供了广泛的共培养模型实验方案，可以在不同隔室的同一实验中同时组合不同的测定。

提出了3D打印插入物的一些容量，以验证它们是否是一种快速且易于使用的共培养模型。与先前发表的关于旁分泌细胞通讯的研究相比，3D打印插入物能够成为有价值的共培养模型。为了评估这一点，比较了3D打印插入系统和使用条件培养基的经典系统之间的角质形成细胞对内皮细胞增殖和迁移的调节。与使用条件介质的传统系统相比，3D打印的插入物可以快速获得类似的结果。事实上，3D打印的插入物提供了一个强大的模型来研究两个方向的细胞相互作用，而无需产生条件培养基，并且有可能在同一实验中并行进行增殖和迁移测定。

最后，本文提出了一种新的、即用型的细胞通讯研究模型。3D打印插入片段与所有贴壁细胞类型兼容，允许进行多种共培养组合，旨在更接近 体内 条件。

注意:3D插入物（图1A）是商业采购的，并使用与细胞培养和高压灭菌具有生物相容性的光敏聚合物树脂进行打印（参见 材料表）。在本节中，描述了通过插入片段建立共培养模型的详细协议（见 图1B）。还提供了一些应用程序示例。

1. 将灭菌插入物放置在 6 孔板中

1. 根据制造商的说明，以10:1（v / v）的比例混合试剂盒中提供的两种组分（见 材料表），食品硅（试剂A）和催化剂（试剂B）。（图1Ba）。使用70%乙醇灭菌刮刀将两种成分混合。
   注意:要制备的硅混合物的体积取决于要固定的插入件的数量。过量的催化剂会导致硅混合物凝固得太快。
2. 用镊子将插入物涂在硅混合物上，使混合物均匀分布在插入物的底部边缘（图1Bb）。将插入物放入6孔板的孔中，并在插入物上施加温和的压力，以确保插入物与板紧密接触，以避免细胞培养基泄漏（图1Bc）。
3. 将板置于37°C以支持硅的凝固过程1小时。
   注意:凝固时间取决于添加的催化剂的数量。
4. 凝固后，通过将嵌件浸入70%乙醇浴中30分钟至1小时，对板进行灭菌。
5. 通过移液丢弃酒精，让板在细胞培养罩中干燥（盖子打开）过夜。
   注意:在执行下一步之前，酒精必须完全蒸发，以避免细胞固定和毒性。包含插入物的即用型板可以在室温下在干燥和无菌条件下使用前储存数天。

2. 涂层，如聚-L-赖氨酸或聚血红素（可选步骤）

注意: 本实验中不进行涂层，并提供步骤以告知涂层刀片的可能性。

1. 根据制造商的说明制备涂层溶液。
2. 考虑最大隔室的体积为 200-400 μL，最小隔室的体积为 50-100 μL，用于插入物涂层。将涂层溶液添加到各个隔室中。
3. 在无菌条件下按照制造商的要求让涂层干燥。

3. 细胞接种

1. 按照制造商的建议培养外根鞘角质形成细胞 （KORS） 和人真皮微血管内皮细胞 （HDMEC）。一旦细胞达到汇合，准备细胞悬液。
   1. 从烧瓶中弃去培养基并加入5mL胰蛋白酶以分离细胞（参见 材料表）。
   2. 将含有KORS的烧瓶置于37°C，5%CO₂₅ 分钟。将含有HDMEC的烧瓶在室温下孵育5分钟。
   3. 将含有KORS的胰蛋白酶溶液与补充有5%胎牛血清（FBS）和生长因子的5mL间充质干细胞培养基（MSC_M）（基础培养基与补充剂试剂盒，参见 材料表）混合。将含有HDMEC的胰蛋白酶溶液与补充有5%FBS和生长因子的5mL内皮细胞培养基（EC_M）混合（参见 材料表）。
   4. 将细胞转移到 15 mL 无菌锥形管中。在室温下以200 ×g离心 KORS和HDMEC悬浮液5分钟。
   5. 弃去上清液并将细胞重悬于2mL相应培养基中。
   6. 将 10 μL 细胞悬液与 10 μL 台盼蓝染料混合（参见 材料表）。
   7. 将 10 μL 混合物加入计数载玻片的腔室中。
   8. 将计数载玻片插入细胞计数系统（参见 材料表）并检测细胞数量和活力。
   9. 在相应培养基中以0.5 x 10 5个细胞/ mL的浓度^{制备细胞悬} 液。
      注意:如果不同的细胞类型需要不同的粘附时间和/或达到理想的汇合度，则可以根据细胞类型在不同的时间点进行细胞接种。
2. 用移液器将 800 μL 至 1 mL 的细胞悬液分配到各个大隔室中，将 100-150 μL 分配到各个小隔室中。
   1. 在MSC_M中以1 x 10⁵个细胞/ mL接种KORS，并在其中一个大隔室中补充有5%FBS和生长因子。
   2. EC_M 中的种子 HDMEC 补充有 5% FBS 和生长因子，小隔室中为 2.5 x 10³ 个细胞/mL，另一个大隔室中补充有 1.25 x 10⁵ 个细胞/mL。
      注意:增殖测定可以在小隔室中进行，迁移和活力测定可以在大隔室中进行。接种的细胞浓度已根据制造商的建议进行了优化。该浓度允许孵育24-48小时后细胞的良好活力。
3. 将细胞培养板置于37°C，5%CO₂ 或通常在条件下，以使细胞粘附和/或成熟。
   注意:在不更换培养基的情况下孵育细胞24-48小时。如果需要，可以独立更换隔间的介质。

4. 实施共文化（图1Bd）

注意:共培养的实现对应于添加公共培养基的时间。由于存在通信窗口（3D打印插入物壁上的卵形孔），为不同隔室中的所有细胞类型添加独特的培养基提供了细胞之间旁分泌通信的可能性。要实现共同文化，请遵循步骤 4.1-4.3。

1. 使用移液管清空插入物不同隔室的培养基。如果是3D球状体细胞培养物，请非常轻柔地丢弃培养基。
2. 在大隔室中用1mL的37°C温PBS冲洗细胞，在小隔室中用200μL37°C温热的PBS冲洗细胞。确保温和洗涤，不要分离细胞。
3. 加入 3 mL 所选为所有细胞类型兼容的常用培养基。
   注意:在本研究中，使用基础EC_M （不含FBS和生长因子）。确保介质覆盖所有隔间（高于通信窗口[墙壁上的卵形孔]，如图 1A所示）。
4. 将含有共培养物的板置于37°C，5%CO 22下24-48小时。

5. 细胞观察、计数和刮擦

1. 孵育24-48小时后，在光学显微镜下观察形态并计数不同隔室的细胞数。
   注意:预期的细胞数量取决于使用的细胞类型（大小、形态等）和隔室大小。在本实验中，在大隔室中计数 0.5 x 10 6-10 6 KORS/mL 和 0.25 x 10 6-0.75 x 10 ⁶ HDMEC/mL。
2. 使用胰蛋白酶分离细胞以进行细胞悬液计数。
   注意:对于细胞分离溶液，考虑最大隔室的体积为 100-500 μL，最小隔室的体积为 10-50 μL。
3. 使用台盼蓝染色检查活性（见步骤3.1.6-3.1.8）。

6. 刀片清洗回收

1. 在实验结束时通过轻微扭转从6孔板中取出插入物（图1Be）。
2. 通过拉下硅将其从嵌件中取出。如有必要，使用刮刀去除粘在嵌件壁上的剩余硅（图1Bf）。
3. 用常规细胞培养洗涤剂和清洁材料清洗插入物（ 材料表中提供的示例）。
4. 对插入物进行灭菌以备将来在高压灭菌器中使用（固体循环，121°C20分钟）或将它们浸入70%乙醇浴中1小时。
   注意:从此步骤开始，使用3D打印插入物描述了两种可能的测定（增殖和迁移测定）示例（图1Bd）。

7. 细胞增殖测定 - WST-1 测定

1. 按照步骤1-3.1培养细胞。
   注意:按照本节中的步骤实施共培养系统，以研究KORS分泌组对HDMEC增殖的影响。KORS细胞用于比较之前发表的数据⁸。
   1. 在间充质干细胞培养基 （MSC_M） 中以 1 x 10 5 个细胞/mL 接种 KORS，并在大隔室中补充有⁵% FBS 和生长因子。
   2. 将细胞培养板置于37°C，5%CO₂ 下24小时。
   3. 将HDMEC接种在内皮细胞培养基（EC_M）中，在小隔室中以2.5 x 10^3个细胞 / mL补充有5%FBS和生长因子。
   4. 将细胞培养板置于37°C，5%CO₂ 下放置24-48小时。
   5. 丢弃所有隔室中的培养基，并通过添加 3 mL 未补充的基础 EC_M （3D 打印插入物所有隔室的通用细胞培养基）实施共培养系统。
2. 在EC_M 普通细胞培养基中稀释WST-1（1:10最终稀释）以制备WST-1溶液。
   注意:对于WST-1溶液的体积，请为空白准备至少500μL的额外溶液。
3. 通过移液从插入物中弃去细胞培养基。
4. 将 WST-1 溶液添加到所选隔室中（小隔室为 150 μL，大隔室为 600 μL）。将板置于37°C，含5%CO₂。
5. 在最佳 30 分钟细胞孵育时间后，在 96 孔板上从每种条件转移 100 μL 孵育培养基。
6. 使用酶标仪评估 420 nm 和 480 nm 之间的比色反应。
   1. 将板放在酶标仪上，然后单击 按钮编辑新方案。
   2. 选择所使用的96孔板（参见 材料表）的特定类型和450nm的波长。
   3. 点击按钮开始 测量。

8.细胞迁移测定-两个迁移室装置

1. 按照步骤1-3.1培养细胞。
   注意:按照本节中的步骤实施共培养系统，以研究KORS分泌组对HDMEC增殖的影响。
   1. 在MSC_M中以1 x 10⁵个细胞/ mL接种KORS，并在其中一个大隔室中补充有5%FBS和生长因子。
   2. 将细胞培养板置于37°C，5%CO₂ 下24小时。
   3. 将两个迁移室装置放入另一个大的插入物隔间中。
   4. 在补充有5%FBS和生长因子的EC_M 中接种HDMEC，两个迁移室装置的7 x 10⁵ 细胞/孔。
   5. 将细胞培养板置于37°C，5%CO₂ 下24小时。
   6. 根据迁移的细胞类型，在24小时后或最佳时间丢弃培养基和两个迁移室装置。通过添加 3 mL 未补充的基础 EC_M 来实施共培养系统。
      注:请小心操作，不要分离电池。如果细胞对加入共性培养基诱导的分离非常敏感，请在加入共性培养基后拉下两个迁移室装置。
2. 在相差显微镜下以10倍放大倍率观察并拍摄不同时间点细胞覆盖的表面的照片。
   注意:照片是用相差显微镜拍摄的（见 材料表）。图片保存在USB密钥中，然后通过软件的伤口愈合工具插件进行分析（见 材料表）。
3. 使用经典的定量分析软件测量未覆盖的表面。
   1. 打开软件上的图像并激活宏列表中可用的伤口愈合工具。
   2. 单击 m 按钮以测量迁移图像的未覆盖表面。
   3. 未覆盖的表面根据以下公式计算:
      覆盖率 = （[T0 处无像元的平均面积 − 时间 T 处无像元的面积]/T0 处无像元的平均面积）× 100。
      注意:3D打印插入片段完全适用于大多数细胞生物学技术（例如假管形成测定，3D培养）和生物化学实验（例如提取DNA，RNA，蛋白质）。

在这项工作中，描述了一种优化的共培养系统，以通过使用条件培养基获得与传统方法相当的稳健、可靠和重要的数据。3D打印插入物通过克服实验上游条件培养基的困难和耗时的生产，模拟不同细胞类型相互作用的体内微环境条件。先前发表的一项研究已被重新进行，以分析毛囊中存在的两种细胞类型之间的间接相互作用:人微血管内皮细胞（HDMECs）和人外根鞘角质形成细胞（KORS）8。在这里，与使用条件培养基研究HDMEC和KORS之间间接相互作用的经典方法相比，使用3D打印插入物获得的结果具有可重复性。先前在研究8中描述的细胞培养条件与本工作中相同。考虑到3D打印插入物的尺寸，它们进行了调整（见协议）。首先，对于所有细胞类型，两种条件（条件培养基与.3D打印插入物）之间的表型和细胞活力相当（图2）。事实上，在6孔板的孔中观察到90%的活力（图2A和表1），在KORS的3D打印插入物（图2B和表1）中观察到91%的活力。HDMEC在6孔板的孔中的活力为85%（图2C和表2），而在3D打印插入物中为86%（图2D和表2）。 细胞活力数据由自动细胞计数器（材料表）计算如下:活细胞数除以总细胞数（死细胞+活细胞）。通过计算在六个独立实验中获得的活力百分比获得平均数据，其中进行了两次重复（见表1和表2）。

这些结果表明，与6孔板上的常规培养物相比，3D打印的插入物不会改变细胞行为或活力。因此，3D打印的插入物被验证为一种新的共培养模型。

分析了先前证明的间接小区通信参数8 。对于所有实验，根据经典培养条件按照协议实现了3D打印插入物共培养的实施（参见之前的工作8）。

首先，通过分析细胞增殖并与使用条件培养基的经典方法进行比较，评估3D打印插入物中KORS和HDMEC之间的间接细胞通讯（图3）。在插入物（+ KORS）中存在KORS的情况下，与没有KORS（对照）的对照条件相比，HDMEC增殖在24小时后显着增加1.5倍，在48小时后显着增加3.1倍（图3A）。这些结果与条件培养基实验获得的结果一致（图3B）。事实上，KORSCM 在24小时后显着增加HDMEC增殖1.5倍，在48小时后显着增加2.1倍。

测试了3D打印插入物共培养模型，以确定KORS对HDMEC迁移的影响。这种效果先前已在使用条件培养基的 经典共培养系统中得到证明8（图4）。在没有KORS（对照）的对照条件下，HDMEC迁移并在24小时后覆盖约44%的伤口区域（图4A）。在存在KORS（+KORS）的情况下，观察到HDMEC迁移的强劲而显着增加。事实上，伤口愈合的动力学表明，HDME分别在3小时，12小时和24小时后覆盖了43%，67%和99%的伤口区域。这些结果与之前获得的结果一致8，其中 KORSCM 以类似的方式增加 HDMEC 迁移（图 4B）。

图 1:显示从清洁到回收插入 物的 3D 打印插入物共培养的实施的工作流程。 （A）3D打印插件的代表性图片。（B）说明了本手稿中提出的分析的代表性示例。请注意，可以在3D打印插入物的一个隔室中进行增殖测定，并使用放置在3D打印插入物的其他隔室中的两个迁移室装置在另一个隔室中进行迁移测定。 请点击此处查看此图的大图。

图2:KORS和HDMEC的可行性。 （A，B）KORS形态（10x）在（A）6孔板的孔和（B）在3D打印插入物中。（中，四）（C）6孔板孔和（D）3D打印插入物中的HDMEC形态（10x）。比例尺:200 μm。 请点击这里查看此图的大图。

图3:KORS对HDMEC增殖的影响 。 （A）在没有KORS（对照= CTRL）或存在KORS（+ KORS）的情况下，在3D打印插入物中使用WST-1染料比色测定HDMEC增殖24小时或48小时。 （B）在ECM 基底细胞培养基或KORSCM 存在下，使用WST-1染料通过比色测定法测量HDMEC增殖24小时或48小时。结果表示为SEM±平均值，n = 8重复，并进行两个独立实验。*p < 0.05、***p < 0.001、****p < 0.0001 和 *****p < 0.00001。KORS在不含FBS和生长因子的ECM 中孵育。48小时后，收集该条件培养基并储存在-80°C进行实验。此图已从 8 修改并经许可转载。 请点击此处查看此图的大图。

图 4:KORS 对 HDMEC 迁移的影响。 （A）在没有KORS（对照= CTRL）或存在KORS（+ KORS）的情况下，HDMEC在3D打印插入物中的迁移被显示并量化为恢复的百分比。（B）显示并量化了ECM或KORSCM中HDMEC的迁移，并将其量化为恢复的百分比。结果表示为SEM的平均值±，n=3个重复，每个重复分析三个场，进行两个独立的实验。**p<0.01， *****p<0.00001.比例尺:200 μm。KORS在不含FBS和生长因子的ECM中孵育。48小时后，收集该条件培养基并储存在-80°C进行实验。此图已从 8 修改并经许可转载。请点击此处查看此图的大图。

表1:KORS活性测量。 KORS活性在6孔板的孔和3D打印插入物中使用台盼蓝染色和自动计数进行测量。

表 2:HDMEC 活性测量。 HDMEC活性在6孔板的孔中和3D打印的插入物中使用台盼蓝染色和自动计数进行测量。

作者声明没有相互竞争的经济利益。