方法文章

机械节点孔传感:用于多参数单细胞粘弹性测量的快速、无标记平台

DOI：

10.3791/64665

⸱

2022年12月2日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Graduate Program in Bioengineering, University of California, Berkeley and University of California, San Francisco, 2Department of Mechanical Engineering, University of California, Berkeley, 3Department of Electrical Engineering and Computer Sciences, University of California, Berkeley

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这里介绍的是一种使用称为机械节点孔传感（mechano-NPS）的基于电子学的微流体平台对单个细胞进行机械表型分析的方法。该平台保持1-10个细胞/秒的中等通量，同时测量细胞的弹性和粘性生物物理特性。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

细胞力学特性涉及各种生物过程和疾病，从干细胞分化到癌症转移。测量这些特性的常规方法，如原子力显微镜（AFM）和微量移液器抽吸（MA），捕获了丰富的信息，反映了细胞的全粘弹性响应;但是，这些方法受到非常低的吞吐量的限制。实时变形性细胞术（RT-DC）等高通量方法只能测量有限的机械信息，因为它们通常仅限于仅反映细胞弹性特性的单参数读数。与这些方法相比，机械节点孔传感（mechano-NPS）是一种灵活的无标记微流体平台，可在实现中等通量的细胞的多参数粘弹性测量方面弥合差距。直流 （DC） 测量用于监测细胞通过微流体通道时，跟踪它们在被迫通过狭窄收缩之前、期间和之后的大小和速度。该信息（即大小和速度）用于量化每个细胞的横向变形、抗变形能力和变形恢复。通常，这种基于电子学的微流体平台提供多种粘弹性电池特性，从而更完整地了解电池的机械状态。由于它需要最少的样品制备，采用简单的电子测量（与高速相机相比），并利用标准的软光刻制造，因此该平台的实施简单易用，并且适用于下游分析。该平台的灵活性、实用性和灵敏度为各种细胞提供了独特的机械信息，在基础科学和临床诊断中具有更多应用的潜力。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

单细胞是动态的粘弹性材料1。许多内部和外部过程（例如，有丝分裂的发作或细胞外基质[ECM]的重塑）影响其结构和组成2，3，4，通常导致补充其当前状态的独特生物物理特性。特别是，机械性能已被证明是细胞发育，生理学和病理学的重要生物标志物，产生有价值的定量信息，可以补充规范的分子和遗传方法5，6，7。例如，Li等人最近描述了耐药性和药物反应性急性早幼粒细胞白血病细胞之间的机械差异，同时还使用RNA-seq揭示了差异表达的细胞骨架相关基因8。通过了解单细胞力学和细胞功能之间的复杂相互作用，机械分型在改变基础科学和临床诊断方面具有更广泛的应用9。

测量单细胞力学的最广泛采用的工具是原子力显微镜（AFM）。虽然AFM能够对细胞机械特性进行高分辨率的局部测量，但它仍然局限于<0.01个细胞/秒10的通量。或者，光学拉伸器使用两个发....

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 设计设备几何形状

  1. 选择大小调整和恢复段的宽度，使其宽于要测量的最大单元的直径，同时保持足够的信噪比（SNR）。有关各种细胞系的不同大小和回收段宽度的示例，请参阅 补充表2 。
  2. 选择收缩段宽度以将30%-40%的应变施加到要进行机械化处理的细胞的平均大小上。应变定义为 figure-protocol-1，其中 d 是细胞直径， wc 是收缩通道宽度2，8。有关不同细胞系的不同收缩段宽度，请参阅 补充表2 。
    注意:如果希望比较直径大不相同的细胞类型或条件，则应使用单独的设备设计，并针对每种细胞类型/条件使用收缩段宽度。
  3. 为每个唯一的设备几何图形设计一个参考设备。这对于确定 De，即微流体通道的定量孔段的有效直径是必要的。
    注: 参考设备使用与主设备相同的几何图形。唯一的修改是收缩段的宽度应等于施胶孔段的宽度，以便使用已知尺寸的聚苯乙烯珠进行....

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这里介绍的机械分型平台是一种简单而通用的方法，用于测量具有中等通量的单个细胞的生物物理特性。使用恒压驱动流将细胞流过微流体通道（图1A）。当细胞过境时，使用数据采集硬件记录微流体通道的长度和产生的电流脉冲。然后使用MATLAB上的自定义软件处理采集的信号（图1B，C），以提取相关的单电池机械性能。 图1D 显示了实验方案的图形概述。

为了制造器件，首先创建一个负母模并用于铸造PDMS（图2）。成功的母模（ 如补充图3所示）包含光滑的垂直侧壁，并且在微流体通道中没有缺陷（图4Ai）。在制造这个初始主模具时应小心，因为在制造不良的晶圆中（补充图3），任何缺陷都会转移到所有后续的PDMS铸件（.......

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

使用这种机械分型技术测量单细胞的机械性能包括三个阶段:设备制造、数据采集和数据分析。在每个阶段中，都有可能显着影响实验结果的显着方面。在器件制造过程中，一致的通道几何形状和器件间均匀性对于准确和可重复的结果至关重要。具体来说，每个设备的侧壁应该相对光滑（图4Ai），并且复制设备的通道高度应该相当。任何具有部分阻碍细胞流动的缺陷的装置，特别是在收缩通道中（图4Aii）都应丢弃。使用通道几何形状中存在可识别缺陷的设备将导致不准确和不可重现的结果。在数据采集过程中，用户在数据收集期间能够识别通道中是否存在堵塞至关重要。示例脚本"NPS.m"（可在 https://github.com/sohnlab/node-pore-sensing-public 中找到）显示当前测量值，使用户能够实时监控通道条件和细胞传输事件。堵塞的脉冲特性如图4B所示。收缩通道内的堵塞仍然允许一些细胞流动，这一点特别重要，因为细胞在阻塞位置会经历增加的应变，导致 wCDIs不.......

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披露

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L. L. S 持有美国专利号 11，383，241:"机械节点孔隙传感"，J. Kim、S. Han 和 L. L. Sohn，于 2022 年 7 月 12 日发布。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项研究得到了NIBIB 1R01EB024989-01和NCI 1R01CA190843-01的资助。A.L.和R.R.得到了H2H8协会研究生研究奖学金的支持。K. L. C. 得到了美国国家科学基金会研究生研究奖学金和 Siebel 学者奖学金的支持。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
丙酮J.T. Baker5356-05纯度（GC）  ≥ 99.5%（https://us.vwr.com/store/product/6057739/acetone-99-5-vlsi-j-t-baker）
铝箔n/an/a
模拟低通滤波器ThorLabsEF504≤240 kHz 通带，同轴 BNC 馈通 （https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=EF504#ad-image-0）
活检打孔器Integra Miltex33-31AA-P/251mm，一次性，带柱塞 （https://mms.mckesson.com/product/573313/Miltex-33-31AA-P25）
刀片n/an/a
BNC 电缆Pomona Electronics2249-C-12https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/2249-C-12/603323?utm_adgroup=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&utm_source=google&utm_
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mCWdePrG6SdEJMF3X6ubUaAs
w-EALw_wcB
洁净室聚酯棉签Thermo Fisher Scientific18383https://www.fishersci.com/shop/products/texwipe-cleantip-alpha-polyester-series-swabs-6/18383
电流前置放大器DL仪器1211https://www.brltest.com/index.php?main_page=product_info&products_
id=1419
定制PCB（带组件）n/an/a，参见补充文件4和5
DAQ接线端子National InstrumentsBNC-2120https://www.ni.com/en-in/support/model.bnc-2120.html
DAQ转BNC-2110电缆 National InstrumentsSHC68-68-EPMhttps://www.ni.com/en-in/support/model.shc68-68-epm.html
数据采集板（DAQ）National InstrumentsPCI-6251
https://www.ni.com/docs/en-US/bundle/pci-6251-feature/page/overview.html DessicatorThermo Fisher Scientific5311-0250https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/5311-0250
母头BNC 转香蕉插头适配器Pomona Electronics72909https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/72909/1196318
牛血清 （FBS）VWR89510-186https://us.vwr.com/store/product/18706419/avantor-seradigm-select-grade-usda-approved-origin-fetal-bovine-serum-fbs
玻璃切割ChemglassCG-1179-21https://chemglass.com/plate-glass-cutters-diamond-tips
Gold Etchant TFATranseneNC0977944https://www.fishersci.com/shop/products/NC0977944/NC0977944
热板ThermoFisher ScientificSP131825 
异丙醇光谱化学I1056-4LTPL纯度 （GC）  ≥99.5% （https://www.spectrumchemical.com/isopropyl-alcohol-99-percent-fcc-i1056）
金属硬件外壳Hammond 制造EJ12126https://www.digikey.com/en/products/detail/hammond-manufacturing/EJ12126/2423415
甲醇Sigma-Aldrich34860纯度 （GC）  ≥99.8% （https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/substance/methanol320467561）
MF-321 显影Kayaku Advanced Materialsn/ahttps://kayakuam.com/products/mf-321/
MICROPOSIT S1813 正性光刻胶杜邦n/ahttps://kayakuam.com/products/microposit-s1800-g2-series-photoresists/
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）Thermo Fisher Scientific10010049https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010049?SID=srch-hj-10010049
PhotomaskFineline Imagingn/aPhotomask是从我们的CAD设计中定制订购的（https://www.fineline-imaging.com/）
普通玻璃显微镜载玻片Fisher Scientific12-553-5B材料：钠钙，L75 x W50毫米，厚度：0.90–1.10 毫米 
等离子清洗器Harrick PlasmaPDC-001https://harrickplasma.com/plasma-cleaners/expanded-plasma-cleaner/
塑料培养皿Thermo Fisher ScientificFB0875712100 mm （https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-raised-ridge-100-x-15mm/FB0875712）
压力控制器FluigentMFCS-EZhttps://www.fluigent.com/research/instruments/pressure-flow-controllers/mfcs-series/
压力控制器软件FluigentMAESFLO
编程 &用于数据采集和分析的计算软件MATLABR2021b（https://www.mathworks.com/products/matlab.html）
PTFE 管Cole Parmer06417-310.032" ID x 0.056" （https://www.coleparmer.com/i/masterflex-transfer-tubing-microbore-ptfe-0-032-id-x-0-056-od-100-ft-roll/0641731）
Scepter 2.0 手持式自动细胞计数器Millapore SigmaPHCC20060https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/product/mm/phcc20060
硅片Wafer World288576.2 mm，单面抛光 （https://www.waferworld.com/product/2885）
旋涂机n/an/a
SU-8 3025 负光刻胶Kayaku Advanced Materialsn/ahttps://kayakuam.com/products/su-8-2000/
SU8 显影Kayaku Advanced Materialsn/ahttps://kayakuam.com/products/su-8-developer/
Sygard 184 聚二甲基硅氧烷陶氏化学4019862https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/
胶带苏格兰威士忌810-341296https://www.staples.com/Scotch-Magic-Tape-810-3-4-x-36-yds-1-Core/product_130567?cid=PS:GS:SBD:PLA:OS&gclid=
Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO
2sErRwzrrgjU0NjFkDkne1xm
vT7ekS3tdzvAgiMDwPoxocgH
VTQZi7vJgaAvQZEALw_wcB
钛、铂、金n/a n/a
重输出电源KeysightE36311Ahttps://www.newark.com/keysight-technologies/e36311a/dc-power-supply-3o-p-6v-5a-prog/dp/15AC9653
UV 口罩对准器Karl Suss AmericaMJB3 口罩对准器 
胎机 剂 剂 三

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pegoraro, A. F., Janmey, P., Weitz, D. A. Mechanical properties of the cytoskeleton and cells. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (11), 022038(2017).
  2. Kim, J., et al. Characterizing cellular mechanical phenotypes with mec....

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