本文介绍了一种将专为患者设计的商用连续血糖监测仪植入小鼠体内的简单方法，并提供了用于分析结果的脚本。
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本文内容
摘要
摘要
小鼠是研究糖尿病等代谢性疾病的常用模式生物。通常通过剪尾采血法测定血糖水平，该方法需要抓取小鼠，易引起应激反应，且无法获取小鼠在黑暗周期中自由活动状态下的数据。目前最先进的小鼠连续血糖监测技术需将探针插入小鼠主动脉弓，并配备专用遥测系统。这种技术操作复杂且成本高昂，大多数实验室尚未采用。本文介绍一种简便的实验方案，利用市面上可购得的连续血糖监测仪，将其应用于基础研究中对小鼠进行连续血糖监测，该类设备已在全球数百万患者中广泛使用。将血糖感应探针通过皮肤小切口植入小鼠背部皮下组织，并用数针缝合固定探针位置。监测设备本身也缝合固定于小鼠皮肤上，以确保其稳定就位。该设备可持续监测血糖水平长达两周，并将数据无线传输至附近的接收器，全程无需抓取或干扰小鼠。本文同时提供了血糖数据基本分析所用的脚本程序。从手术操作到计算分析，该方法成本低廉，在代谢研究中具有潜在的重要应用价值。
引言
糖尿病（DM）是一种以高血糖为特征的严重疾病。1型糖尿病可能是由于自身免疫系统攻击胰腺中产生胰岛素的β细胞所致。而2型糖尿病和妊娠期糖尿病则是由于β细胞无法在血糖升高时分泌足够的胰岛素所致1。小鼠是研究糖尿病常用的模式生物，因其生理机制与人类相似，且正常血糖水平与人类接近。此外，特定品系的小鼠可能因关键信号通路中的基因突变或在特定饮食暴露后发展为糖尿病，从而可用于疾病建模2,3,4。
通常使用为患者设计的血糖仪，通过从小鼠尾尖采集少量血液（1-2 µL）来测量小鼠的血糖水平。该方法会引起小鼠应激，并需要对小鼠进行抓取操作，从而影响血糖水平，且无法用于自由活动的小鼠或在研究人员不在场时进行血糖监测5。对小鼠采血可能引起同笼其他尚未采血小鼠的应激反应，尤其是同笼同伴，进而影响实验结果。小鼠对不同操作人员的反应存在差异，测量血糖的操作者本身也可能影响小鼠的血糖水平。这些局限性要求实验设计必须谨慎，并可能导致不同实验之间出现结果不一致的情况。
通过使用先进的遥测技术将葡萄糖传感器植入小鼠的主动脉弓，可以在不采血的情况下对自由活动的小鼠进行葡萄糖水平测量6。所获得的测量结果非常准确，且可长期持续，但这类传感器的植入操作具有挑战性，同时遥测系统成本高昂，导致该方法的应用范围有限，非专业实验室基本未采用。近年来已开发出针对小鼠体型及其生理特征优化的皮下或其他类型的葡萄糖传感器，但这些传感器在某些情况下仍需要由技术高度熟练的专家进行操作，且可能成本较高6,7,8,9,10。
最初为监测糖尿病（DM）患者血糖水平而开发的商用连续血糖监测仪（CGM），为在自由活动的小鼠中测量血糖提供了另一种选择，其成本和技术要求低于植入式探针。少数实验室已在基础研究中使用此类探针5,11,12,13,14,15 ，包括使用本方案的我们的同事16。这些设备通常包括一个传感器、一个固定装置、一个接收器和一个软件应用程序。传感器包含引导酶法葡萄糖传感器的套管、粘性胶带、电源、短期存储器以及用于存储数据并将其无线传输至接收器的通信模块。接收器可显示当前血糖水平，并将数据发送至服务器；该接收器可以是手机。软件应用程序为患者及其医疗团队提供患者的血糖数据。在患者中，传感器可通过固定装置轻松安装。通过将固定装置按压在皮肤上，即可将套管皮下插入，传感器则依靠粘性胶带固定在原位。
本方案详细介绍了如何改装商用连续血糖监测（CGM）设备以测量小鼠的血糖水平。本文描述了葡萄糖传感器的外科植入方法及其在小鼠体内的固定步骤。同时提供了基础数据分析与数据可视化的脚本。文中还列出了可能遇到的问题、故障排除方法以及典型实验结果的示例。以下方案针对某一特定型号的CGM设备，但随着其他类型商用CGM设备的出现，本方案可轻松适配于其他设备。
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方案
实验已获希伯来大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。
注意：所有工具必须灭菌，导管操作必须采用无菌技术。以下方案已针对特定连续血糖监测仪（CGM）优化，但可调整用于其他连续血糖监测仪。
1. 操作前镇痛给药
- 皮下注射5%葡萄糖和0.45%生理盐水，并按每公斤体重5 mg的剂量给予美洛昔康。
2. 麻醉给药
- 将小鼠放入诱导室中，紧密关闭盖子。在诱导室内设置麻醉诱导条件：异氟烷浓度为3%，气流速为500 mL/min。
- 当小鼠失去反应后，将其从诱导室中取出，并为小鼠佩戴鼻罩。通过趾间夹捏法确认麻醉深度。对于体重为30 g的小鼠，将异氟烷浓度调整至1%–1.5%，气流速调整至100 mL/min。
- 在小鼠眼睛上涂抹眼用软膏，以防止麻醉期间角膜干燥。
3. 传感器制备
- 将传感器安装到传感器固定装置上，以暴露传感器的胶带和套管一侧（图 1A）。请注意，针头已插入套管中并暴露在外，操作时需谨慎。
- 在套管两侧的胶带上各缝合一根5-0圆锥头缝线（图 1A）。
4. 脱毛与消毒
- 在小鼠背部中线区域剃除约 4 cm × 4 cm 的毛发。
- 在剃毛区域涂抹脱毛膏，以确保完全去除毛发。
- 擦拭皮肤，并使用含有 2% 葡萄糖酸氯己定和 70% 异丙醇的抗菌溶液进行消毒。
5. 背部皮肤制备
- 使用锋利的剪刀在脊柱上方剃毛区域的中心做一个2 mm的切口（图1B）。
- 简要地，将带有钝边的小型镊子插入皮肤下方，形成一个较小的皮下囊袋，以便导管能够顺利插入皮下囊袋中（图1B）。
- 将步骤3.2中的缝线穿过切口两侧的皮肤（图1C）。
6. 传感器插入
- 将传感器完全从传感器固定装置上取下（套管已脱离针头），并用镊子夹住传感器，以防止周围的胶带粘连在一起。
- 小心地将套管插入皮下囊袋中。
- 拉紧两侧缝线，打结并牢固固定传感器，从而防止随着时间推移胶带松动后套管从皮下囊袋中滑出。
7. 传感器安装与缝合
- 通过绑紧内层缝线并使用环绕传感器的胶带，将传感器牢固地固定在背部。
- 在传感器周围做八个间断缝合，将传感器胶带的边缘固定到皮肤上（图1D）。
8. 激活读取器
- 传感器插入后，通过打开读取器、按下启动新传感器，并按照制造商的说明滑动传感器，以激活读取器。
- 连续血糖监测仪（CGM）安装数分钟后方可进行首次读数。对于本款CGM，首次读数可在60分钟后获取。
9. 结果读取
- 将读取器放置在小鼠附近（无需接触）。传感器中存储的所有数据将传输至读取器。
注意：不同的连续血糖监测（CGM）设备在历史数据存储时长方面可能有所不同。本例中的 CGM 设备在两次读数之间最多可存储 8 小时的数据。
10. 移除传感器
- 麻醉小鼠（参见第2节）。
- 使用锋利的剪刀剪断将传感器连接至小鼠背部的缝线。
- 轻轻取出传感器，并剪除切口处的缝线。
- 如有必要，可使用单根缝线缝合小鼠背部的切口。
11. 数据分析
- 数据下载：根据连续血糖监测仪（CGM）制造商提供的说明下载数据。
注意：每种CGM的数据格式不同，用户可能难以获取。在选择CGM时，这一点是需要重点考虑的因素。 - 若使用配套软件进行分析，请按照Github上的readme文件中的说明（https://github.com/mika-littor/CGM-in-Mice-Analysis.git）对数据进行格式化处理。
图1将传感器固定在小鼠身上。 (A底部的连续血糖监测传感器（由白色箭头标记）的套管两侧，由红色箭头标记的两条缝线穿过传感器胶带。B在剃毛区域沿脊柱中线用锋利的剪刀做一个约2 mm的小切口。使用钝头小镊子短暂插入皮下，形成一个小的皮下囊袋，以便将套管插入皮下。C) 来自同一缝线的 A 在切口两侧皮下穿过缝线。红色箭头标示了连接到传感器上的缝线，如 A，蓝色箭头标示缝线穿过小鼠背部皮肤的位置，黑色箭头显示切口位置。D导管插入后，应收紧并结扎靠近切口处的内层缝线，以固定连续血糖监测仪（CGM）。随后将传感器缝合至皮肤。 请点击此处以查看此图的放大版本。
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结果
手术结果
展示了8只喂食高脂高蔗糖饮食（HFHS）18周的肥胖HSD:ICR小鼠（8周龄）和5只瘦型HSD:ICR小鼠（12周龄）的结果。我们使用的设备最多可存储8小时的数据。由于本地动物设施的进入时间限制为07:00至19:00，因此无法在晚上较晚时段（即小鼠活跃时段）进行数据采集。因此，小鼠在手术前被放置于反向光照的房间中适应7天，使其黑暗时段为8:30至20:30。此步骤并非所有设备或动物设施均需执行，我们建议使用能够存储超过12小时数据的设备。
术后未出现死亡情况。手术导致实验期间体重下降约10%（图2A）。因此，术后体重下降期间最初几天的测量结果应谨慎解读。体重下降并非由于小鼠无法触及食物和水所致。连续血糖监测（CGM）测量值与尾尖采血血糖测量值在空腹和非空腹状态下的比较显示良好一致性（图2B）。CGM平均持续工作11天（图2C）。此类设备最长可使用14天。当设备提前失活时，并非由于CGM脱落所致。
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讨论
本方案提供了一种简单且低成本的小鼠血糖水平监测方法，无需进行复杂的显微手术，也不涉及采血或频繁抓取小鼠。该方法易于在各类实验设施中实施，且不会导致小鼠死亡、疼痛或明显不适。方案中最关键的步骤是将血糖传感器的套管插入小鼠皮下。添加数针缝线可使套管更长时间保持原位。由于传感器体积较小，在小鼠活动过程中可能堵塞或移位。因此，必须通过内部缝线固定传感器，并用几针缝线将其固定在小鼠背部。该方案可适配多种商用连续血糖监测（CGM）系统。
小鼠在手术后出现体重下降，这是术后预期之内的现象，可能与手术和麻醉带来的应激、携带设备的负担以及本研究采用的特定实验方案所要求的单只饲养有关。随着连续血糖监测（CGM）设备变得越来越轻便且精确，这些影响预计会逐渐减小。我们观察到携带CGM的小鼠在笼内活动自如，能够攀爬以获取食物颗粒。该方法的局限性在于每种CGM设备随时间推移维持正常功能的能力。研究人员应密切监测体重变化，并权衡该方法相较于传统替代方案的优缺点——后者需要频繁抓取和采血，且默认对一只小鼠采血对其同笼小鼠的血糖水平影响甚微，但测量过程是在白天应激状态下进行的。
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
感谢 Dvir Mintz 兽医学博士以及动物实验中心的兽医和饲养人员，同时感谢我们团队成员的有益讨论。本研究由以色列科学基金会授予 D.B.Z. 的项目资助，资助编号为 1541/21。D.B.Z. 是 Zukerman 科学、技术、工程和数学（STEM）教员。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2% 葡萄糖酸氯己定和 70% 异丙醇 | 3M | ID 7000136290 | |
| 5% 葡萄糖和 0.45% 氯化钠注射液，USP | Braun | L6120 | |
| Castroviejo 持针器 | FST | 12061-02 | |
| 超精细 Bonn 剪刀 | FST | 14084-08 | |
| FreeStyle Libre 1 读取器 | Abbott | ART27543 | |
| FreeStyle Libre 传感器 | Abbott | ART36687 | |
| FreeStyle Libre 传感器敷贴器 | Abbott | ART36787 | |
| 纱布垫 | Sion medical | PC912017 | |
| Graefe 镊子 | FST | 11052-10 | |
| 脱毛膏 | Veet | 3116523 | |
| 高脂高蔗糖饮食 | Envigo Teklad 饲料 | TD.08811 | |
| 异氟烷，USP Terrell | Piramal | 26675-46-7 | |
| 美洛昔康 5 mg/mL | Chanelle Pharma | 08749/5024 | |
| MiniARCO 推剪套装 | Moser | CL8787-KIT | |
| PROLENE 聚丙烯缝线 5-0 | Ethicon | 8725H | |
| Puralube 眼科软膏 | Perrigo | 574402511 | |
| Q-tips | B.H.W | 271676 | |
| SomnoSuite 低流量麻醉系统 | Kent Scientific | SOMNO |
参考文献
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重印与许可
