小鼠颅内套管植入术用于局部序贯输注嵌合抗原受体（CAR）T细胞

摘要

中枢神经系统（CNS）肿瘤是儿童癌症相关死亡的首要原因，目前针对患者的局部区域免疫疗法正在越来越多地进入临床试验。本方案描述了在小鼠中进行局部区域导管植入的方法，用于临床前评估靶向中枢神经系统肿瘤的免疫治疗药物输注效果。

摘要

儿童中枢神经系统（CNS）肿瘤是导致儿童癌症相关死亡的主要原因，尽管化疗和放疗技术已取得进展，但其预后仍然较差。由于许多肿瘤缺乏有效的治疗方法，迫切需要开发更具前景的治疗策略，例如免疫疗法；其中，针对中枢神经系统肿瘤的嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法 尤其受到关注。B7-H3、IL13RA2以及双唾液酸神经节苷脂GD2等细胞表面靶点在多种儿童及成人中枢神经系统肿瘤表面高表达， 为利用CAR T细胞疗法靶向这些及其他表面抗原提供了可能。为了在临床前小鼠模型中评估CAR T细胞的重复局部区域递送效果，研究人员建立了一种留置导管系统，该系统模拟了目前在人类临床试验中正在使用的留置导管装置。与立体定向注射不同，该留置导管系统可在无需多次手术的情况下实现重复给药。本实验方案描述了一种固定导向套管的瘤内植入方法，该方法已成功用于儿童脑肿瘤原位小鼠模型中连续CAR T细胞输注的测试。在小鼠中原位注射并成功植入肿瘤细胞后，使用立体定向仪将固定导向套管植入肿瘤内，并用螺钉和丙烯酸树脂固定。随后，治疗用套管可通过该固定导向套管插入，以实现CAR T细胞的重复递送。通过调整导向套管的立体定向位置，可将CAR T细胞直接递送至侧脑室或脑内其他部位。该平台为临床前评估针对这些严重儿童肿瘤的重复颅内输注CAR T细胞及其他新型治疗手段提供了一种可靠的机制。

引言

尽管化疗、放疗和手术治疗已取得进展，中枢神经系统（CNS）肿瘤仍是儿科中最致命的恶性肿瘤¹，凸显出开发具有更佳疗效新疗法的重要需求。随着免疫治疗领域的显著进展，过继性细胞治疗（ACT）在多种癌症中展现出良好疗效，尤其是在血液系统恶性肿瘤中表现突出²。嵌合抗原受体（CAR）T细胞治疗是一种特定类型的ACT，其利用免疫系统识别并清除有害细胞的天然能力，通过重定向T细胞的特异性，生成可靶向肿瘤的T细胞³。CAR T细胞治疗在白血病和淋巴瘤的治疗中已取得显著成效⁴，使其成为一种极具前景的免疫治疗策略，并推动其在实体瘤中的研究探索。然而，迄今为止，CAR T细胞治疗在实体瘤中的临床疗效仍十分有限，并面临诸多挑战，如肿瘤穿透效率低、可靶向抗原有限以及免疫抑制性肿瘤微环境等⁵。

近期的临床试验已开始评估CAR T细胞疗法在儿童中枢神经系统（CNS）肿瘤中的应用，在初步报告中提供了概念验证以及T细胞活性的早期证据^6,7,8。尽管大多数早期的临床前研究集中于CAR T细胞的静脉输注，但近期的临床前证据表明，将CAR T细胞直接递送至中枢神经系统局部区域的效果更优^9,10，该方法也已在多项临床试验中成功应用^6,7,8,11。迄今为止，采用中枢神经系统局部区域递送CAR T细胞的临床前研究均依赖于通过立体定向技术单次颅内注射CAR T细胞^9,10。然而，人体临床试验表明需要在中枢神经系统内多次重复输注CAR T细胞^6,7,8,11，这凸显了在临床前研究中评估多次重复输注的必要性。本实验方案的目标是利用导管在儿童脑肿瘤的原位小鼠模型中成功实施系列CAR T细胞输注。该技术的优势在于避免了为实现多次中枢神经系统内治疗而反复进行外科手术。目前，导管系统主要应用于神经科学和行为学研究中，用于啮齿类动物神经递质的微透析取样以及神经活性物质的递送¹²，其用于递送抗肿瘤治疗药物的报道较为有限。本方案在既往研究基础上，采用立体定向植入的留置导管系统，在中枢神经系统肿瘤的异种移植小鼠模型中递送CAR T细胞。该方案也可用于测试其他治疗药物在神经系统或神经肿瘤类疾病小鼠模型中的疗效，尤其适用于那些需要绕过血脑屏障以实现治疗效果的新药评估。

方案

所有实验方案均经费城儿童医院机构动物照护与使用委员会（IAC 19-000907）批准，该机构已获得AAALAC认证。本研究使用了6至12周龄的NOD scid gamma（NSG）小鼠，其体内移植有原位异种移植肿瘤；然而，该方案可适用于任何小鼠品系。 NSG小鼠饲养于无菌屏障环境中，手术操作在无菌生物安全柜内进行。当使用人类来源材料（如肿瘤细胞或T细胞）时，所有操作和处理必须在ABSL-2级生物安全柜中完成。

1. 手术前小鼠的准备

1. 在诱导室中使用异氟烷（2-4%）进行麻醉，氧气流速为1 L/min 直到达到适当的麻醉平面（约5分钟）。
2. 使用天平称量小鼠体重，精确至0.1 g，并皮下注射缓释型（SR）丁丙诺啡（1 mg/kg）或其他镇痛剂。
   注意：缓释型丁丙诺啡可提供长达72小时的镇痛作用。
3. 使用电动剃毛器或脱毛剂去除小鼠头部顶部的毛发。
4. 使用刮铲轻轻打开立体定位臂的底部，用镊子夹取导向套管并插入。拧紧立体定位臂上的螺丝以固定套管，使套管约1/2至2/3长度的白色塑料部分连同整个5 mm金属部分从开口底部伸出。
5. 将小鼠的上门齿插入立体定位仪的咬合杆中并固定。向前拉动鼻罩并拧紧，确保小鼠正在吸入异氟烷。
6. 将小鼠固定在预热的立体定位仪上，使用耳杆或耳杯，注意避免施加过大压力。
   注意： 应将直肠温度计插入保温板中，保温板需调节以维持小鼠在实验过程中的正常体温。
7. 使用棉签将无菌眼膏涂抹于双眼。
8. 用棉垫或涂抹器蘸取聚维酮碘擦拭手术部位，随后使用酒精棉片擦拭。此步骤共重复进行三次。
9. 在开始操作前，使用镊子进行足趾夹捏，以评估镇静是否充分。

2. 手术步骤

注意：手术过程的所有步骤均使用灭菌器械并采用无菌技术。小鼠在手术期间（约10-20分钟）持续通过异氟烷（2-4%）维持麻醉状态。

1. 用镊子轻轻夹起两耳之间的头皮。使用无菌 剪刀，沿颅骨平行方向剪开被提起的头皮，移除一块椭圆形皮瓣（长度为 0.75–1 cm），以暴露颅骨。
   注意：相比手术刀，更推荐使用剪刀，以获得干净的椭圆形开口，并防止对周围皮肤和组织造成不必要的损伤。 
2. 使用手术刀或棉签以及止血棉球推开筋膜，必要时帮助减缓过度出血。
   注意：使用无菌棉签的木质端也可推开筋膜，并有助于避免过度出血。
3. 确定颅骨上的定位标志——前囟（bregma）和后囟（lambda），即颅骨骨板相接处的前部和后部标志¹³。
   注意：可通过用过氧化氢擦拭暴露的颅骨顶部来辅助识别这些标志。
4. 用手术刀在颅骨表面轻轻划痕，为丙烯酸树脂的附着提供粗糙面。划痕应包括多条长度约为 0.5–1 cm、相互呈 90° 角的直线。
5. 利用立体定位仪臂，将套管针定位至目标标志点（前囟或后囟）。定位完成后，将套管针尖端抬高至颅骨表面以上 1–2 mm，然后移动至目标坐标。对于瘤内注射，该坐标应与肿瘤植入时的前后（A/P）和内外（M/L）坐标相同。
6. 在暴露的颅骨上，避开套管针进入区域，使用 18 G 针头或外科钻头钻出两个螺钉孔。确保孔间距足够，以便容纳套管针。使用钻头在螺钉孔处旋转，直至螺钉能够固定于颅骨。使用平头螺丝刀将两枚螺钉插入并拧紧至孔中，然后轻轻上提螺钉，确认其已牢固固定。
   注意：切勿将螺钉完全拧至与颅骨齐平，否则可能损伤下方的小鼠脑组织。螺钉与颅骨之间应至少保留 1–2 mm 的间隙。
7. 使用 18 G 针头或外科钻头，在已确定的坐标处钻穿颅骨，形成用于插入套管针的孔洞。
8. 利用立体定位仪臂，将套管针缓慢下降至目标背腹（D/V）坐标。
   注意：套管针植入的 D/V 坐标需考虑假性套管和治疗用套管的突出长度，因此可能比肿瘤细胞原位注射的坐标更浅表（图 1）。
9. 在瓷质 12 孔板中，取一孔加入丙烯酸树脂粉末（约 0.3 g）和 10–15 滴丙烯酸树脂液体（约 0.5–0.75 mL）。混合后形成白色粘稠物质。用 1 mL 注射器吸取混合物，涂抹并覆盖颅骨表面，填充套管针和螺钉周围的空隙。
   注意：该粘稠材料会随时间逐渐硬化成水泥状，因此应在混合后尽快完成此步骤。
10. 在水泥尚未凝固时，松开立体定位仪臂上的螺丝，使用刮刀从底部开口处轻轻将套管针从夹持器中释放，并缓慢向上撤回立体定位仪臂，远离小鼠。
11. 待水泥完全干燥后，将假性套管插入导向套管中，并顺时针旋转以牢固固定。
12. 手术完成后，将小鼠放回预热的饲养笼中，密切监测其恢复情况，确保其充分苏醒，并记录任何术后观察结果（包括确认小鼠已完全恢复意识），然后再送回动物房。
    注意：通常建议仅将笼子的一半置于加热垫上，以便动物可移动至较冷的一侧，避免 过热。
13. 若小鼠术后出现提示疼痛的行为（如活动减少、弓背等），可根据需要追加镇痛药物，例如皮下注射美洛昔康（meloxicam）5 mg/kg，每日一次，最多连续使用 3 天。

3. 制备CAR T细胞

1. 使用细胞计数器测定转染前CAR T细胞的浓度。
2. 在室温（RT）下，以200 × g 离心转染前T细胞5分钟。
3. 使用真空抽吸系统上的无菌巴斯德吸管吸除上清液，并将沉淀重悬于磷酸盐缓冲液（PBS）中，调整至所需浓度。典型的递送体积为2–5 µL，典型的细胞剂量为0.5–5 × 10⁶ 个细胞。

4. CAR T细胞输注

1. 将处理套管的顶端穿过一小段 PKG 套管，以制备处理用套管。
2. 用 CAR T 细胞悬液填充处理用注射器，并将其从 PKG 套管的另一端插入，插入深度需足以覆盖处理套管的顶端。
3. 使用异氟烷（2–4%）对小鼠进行麻醉，氧气流速为 1 L/min。
4. 用镊子夹住导向套管基部以固定，然后小心拧下并取出假性套管，以便进入导向套管。
   注意：无需使用立体定位装置，但可选用该装置以稳定头部以便给药。
5. 持续输注 CAR T 细胞 1 分钟，输注结束后继续留置处理套管 1 分钟。
6. 取出处理套管，并将假性套管重新拧紧复位。
7. 皮下注射美洛昔康（5 mg/kg），用于可选的镇痛处理。

结果

小鼠中枢神经系统成功植入套管
成功插管的小鼠其引导套管位置准确且固定良好，不影响日常活动（图2A），并能顺利插入给药套管并注入液体而无阻力（图2B）。根据我们的经验，大多数套管可维持在位超过4周，但随时间推移，有0–25%的套管可能发生移位。正确放置的位置可通过向套管内注射伊文思蓝染料进行验证。例如，插入侧脑室的套管会使伊文思蓝染料随脑脊液循环分布至整个脑室系统，从而确认位置正确（图2C）。插入肿瘤内的套管则会在肿瘤接种部位观察到伊文思蓝染料的分布。

CAR T细胞有效递送至中枢神经系统以治疗异种移植肿瘤
颅内套管系统的效果以及CAR T细胞在小鼠模型中的治疗效果可通过多种机制进行评估，包括生物发光成像和总体生存率。针对GPC2的CAR T细胞通过重复给药方式，分别在小鼠髓母细胞瘤模型7316-4509和弥漫性中线胶质瘤模型7316-3058中进行了测试 通过 所述颅内套管系统¹⁴通过生物发光成像确认原位肿瘤的植入与移植，随后使用与原位肿瘤植入相同的坐标将套管置入肿瘤床。治疗方案为每周一次至两次给予GPC2 CAR T细胞输注，持续2至4周，共计四到六次剂量。治疗结束后，靶向GPC2的CAR T细胞疗法在髓母细胞瘤模型7316-4509中诱导了显著的肿瘤消退p < 0.01) (图3A) 并显著延长了丘脑弥漫性中线胶质瘤7316-3058的生存期p < 0.05) (图3B)¹⁴.

图1：带突出假体和治疗用套管的导向套管。（A）安装有0.5 mm突出和2 mm突出假体套管的导向套管。（B）安装有0.5 mm突出和2 mm突出治疗用套管的导向套管。请点击此处查看该图的放大版本。

图2用于重复给予CAR T细胞的治疗导管递送系统 (A) 小鼠颅骨植入导管，不使用时配有保护帽。B) 将CAR T细胞注入脑桥肿瘤 通过 在小鼠麻醉状态下插入治疗套管。C通过伊文思蓝染料验证套管在侧脑室中的位置。经套管注入染料后实施安乐死并切除脑组织，可见染料分布于整个脑室系统。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图3靶向 GPC2 的 CAR T 细胞介导抗肿瘤反应并延长儿童脑瘤患者的生存期 体内 (A) 对经GPC2或CD19靶向mRNA CAR T细胞治疗的原位移植组4型髓母细胞瘤异种移植模型7316-4509的生物发光进行定量分析。图中箭头指示给药剂量。数据以均值±标准差表示，每组n = 9–11只小鼠。B) 接种丘脑弥漫性中线胶质瘤异种移植瘤7316-3058并接受六次重复剂量2 x 10的 小鼠的总生存期⁶ CAR T细胞。图中箭头指示给药剂量。每组 n = 7 只小鼠。**p < 0.01; *p < 0.05；ns = 无显著性差异。本图已获Foster等人许可转载。¹⁴. 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

CAR T细胞疗法彻底改变了血液系统恶性肿瘤的治疗，并在治疗实体性脑肿瘤方面展现出良好的应用前景^6,7,8。本实验方案旨在支持对局部区域递送CAR T细胞治疗儿童中枢神经系统（CNS）肿瘤进行临床前评估。该导管系统模拟了目前在儿童CNS肿瘤CAR T细胞治疗的多项临床试验中正在使用的Ommaya或Rickham储液囊——一种脑室内导管系统^6,7,8，突显了本方法的相关性和转化潜力。该系统可实现CAR T细胞的多次重复递送，绕过血脑屏障，这一点也与当前临床试验中采用的方法相似。局部区域递送可在中枢神经系统内实现最大治疗效果⁹，同时可能降低因T细胞从循环系统迁移所导致的全身性毒性的风险¹⁵。尽管立体定向注射可实现单次向中枢神经系统给药，但本系统的优势在于无需多次手术，即可对中枢神经系统的特定部位进行多次重复给药。该操作的局限性包括给药部位固定，一旦导管置入后无法更改位置或进行调整，以及存在导管移位的可能性。

本方案中的一个关键步骤是将固定导管套管植入考虑了治疗套管延伸长度的D/V坐标位置。治疗套管将从导管套管尖端向外延伸，因此必须谨慎操作，确保其定位能够将CAR T细胞准确递送至目标区域。治疗套管的延伸长度可根据需要定制，根据作者经验，0.5 mm是一个较为合适的延伸长度。该长度可确保治疗物质在给药时不会滞留在导管套管内，同时也不需要对导管套管的D/V坐标进行大幅调整即可准确到达目标区域。本方案中另一个重要步骤是在CAR T细胞输注完成后，治疗套管需在原位保留一定时间。在输注结束后，治疗套管应至少保留1分钟，以防止液体渗漏并确保CAR T细胞治疗的局部区域递送效果。

该方法的故障排除较为直接，大多数问题涉及难以取出假性套管或难以将给药套管插入固定的导向套管，这可能是由于导向套管内部有干涸的血液所致。可通过轻柔地将假性套管反复穿过导向套管，直至阻力减小并清除残留物，从而轻松解决此问题。丙烯酸树脂偶尔会从颅骨上脱落，导致套管系统丢失。根据我们的经验，通过使用手术刀在颅骨表面划痕以及植入两枚固定螺钉，通常可有效避免这一问题。此外，还需移除小鼠笼中可能在小鼠活动时意外对套管施加外力的物品，例如带有小开口的特定小鼠环境丰富化小屋。

综上所述，本文介绍了一种在中枢神经系统肿瘤小鼠模型中植入套管系统的方案，用于重复递送CAR T细胞。套管的位置可根据需要调整至多个局部区域，以测试不同递送部位的疗效。此外，该系统还可用于除CAR T细胞以外的其他治疗药物，评估其在绕过血脑屏障时的治疗效果，同时也可能适用于非肿瘤性疾病的其他小鼠模型中对治疗药物的评价。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
18 G 针头	BD	511097	1 1/2 英寸金属接头
丙烯酸树脂液体	Lang Dental	B1323
丙烯酸树脂粉末	Lang Dental	B1323
酒精棉片	BD	326895
Centrifuge 5240	Eppendorf	5420000040	离心机
棉签	Puritan	826-WC	手柄宽度 = 2.11 mm (0.083)，头部宽度 = 1.27 mm (0.050)，手柄长度 = 147.62 mm (5.812)，总长度 = 152.4 mm (6)，头部长度 = 12.7 mm (0.500)
钻头夹持器	P1 Technologies	DH-1	D56-D70 钻头专用夹持器
钻头	P1 Technologies	D58	1.07 mm
假性套管	P1 Technologies	C315DCS-5/SPC	配置：小帽； 长度：底座下方截短至 5.00 mm；突出长度：0.50 mm
平头螺丝刀	P1 Technologies	SD-80	螺丝刀
Graefe 镊子	Fine Science Tools	11051-10	镊子
引导套管	P1 Technologies	C315GS-5/SPC	配置：底座高度 5.00 mm；长度：底座下方截短至 5.00 mm
含消旋肾上腺素的止血棉球	Pascal	1151602
MOXI Z Mini 自动细胞计数仪试剂盒	Moxi	MXZ001	细胞计数仪
NOD scid gamma (NSG) 小鼠	Jackson Laboratory	5557	6 至 12 周龄雄性和雌性
巴斯德移液管	VWR	14673-043
PKG 管路	P1 Technologies	C313CT	直径：0.58 mm × 1.27 mm
瓷质 12 孔板	Flinn Scientific	AP6064
聚维酮碘	Medline	MDS093943
手术刀	World Precision Instrument	50-822-457	一次性手术刀，10 号，无菌，10 把/盒，塑料手柄带 6" 尺子
螺钉	P1 Technologies	0-80 X 3/32	2.4 mm
立体定位仪	David Kopf Instruments	940	940 型小型动物立体定位仪，带数字显示控制台
学生用精细剪刀	Fine Science Tools	91460-12	剪刀
给药套管	P1 Technologies	C315IS-5/SPC	33GA； 配置：标准内管；长度：底座下方截短至 5.00 mm；突出长度：0.50 mm
给药注射器	Hamilton	87908	5 µL，75 型固定针头特殊注射器 (SN)，型号 75SN/22/0.5"/PT3
Vactrap XL	Foxx Life Sciences	305-4401-FLS	真空系统