本文介绍了一种利用高通量系统检测和量化聚焦超声对人诱导多能干细胞（HiPSC）神经元神经调节作用的实验方案。
本文内容
摘要
摘要
聚焦超声（FUS）的神经调节作用已在动物模型中得到证实，且FUS已成功用于治疗人类的运动障碍和精神疾病。然而，尽管FUS取得了成功，其作用机制仍不明确 神经元上的作用机制仍不清楚，这使得通过调节FUS参数来优化治疗变得困难。为弥补这一知识空白，我们研究了人类神经元 体外 利用人诱导性多能干细胞（HiPSCs）培养的神经元进行研究。使用HiPSCs可实现对人生理及病理状态下特异性神经元行为的探究。本报告介绍了一种高通量系统的应用方案，可用于监测和量化聚焦超声（FUS）对HiPSC来源神经元的神经调节作用。通过调整FUS参数，并结合药物处理与遗传修饰手段对HiPSC神经元进行干预，研究人员可评估神经元的响应特性，进而阐明FUS对HiPSC神经元的神经调节效应。该研究可能对开发安全有效的基于FUS的神经及精神疾病治疗策略具有重要意义。
引言
聚焦超声（FUS）是一种有前景的神经调控技术，能够以亚毫米级分辨率实现厘米级深度的无创刺激1,2,3。尽管具有这些优势，FUS 的临床应用仍受到一定限制，部分原因在于对其作用机制的认识尚不充分。缺乏坚实的理论基础使得研究人员和临床医生难以根据不同情况为个体患者量身定制治疗方案。Yoo 等人提出的主流理论4认为，机械敏感性离子通道是神经元激活的原因。然而，该理论无法解释缺乏此类通道的人脑神经元中的 FUS 激活现象5。这种不确定性限制了 FUS 在临床中的应用，因为它阻碍了对 FUS 参数的优化调节，从而难以实现最佳治疗效果。
先前的相关研究已采用多种方法来探究聚焦超声（FUS）背后的生理机制 并确定最佳刺激参数。该过程中的关键步骤是将神经元反应作为反馈进行监测，这可以通过涉及离子门控监测的方法实现，例如钙离子成像。4，光学成像1，以及 离体 电生理记录（例如，肌电图）6 或皮肤-神经电生理学7）。然而，大多数这些研究使用的是非人类神经元或 体内 方法，由于控制条件次优，可能会引入额外的变异。相比之下，使用电极记录神经元信号 体外 人诱导多能干细胞（HiPSC）神经元可提供更敏感的测量结果以及对实验环境的更精确控制。在本研究中，一种 体外 已采用微电极阵列（MEAs）系统来检测高强度聚焦超声（FUS）刺激后人诱导多能干细胞来源神经元（HiPSC神经元）的电生理反应，如图所示 图1该系统使研究人员能够通过改变超声参数（如频率、脉冲长度和强度）来监测神经元的响应。此外，该系统还能高度控制神经元对物理刺激（如温度、压力和空化效应）的敏感性。8,9，因为可以通过遗传学和药物学方法（例如使用钆抑制离子通道）来调控神经元的离子通道功能10,11,12这种分子水平的调控可能有助于阐明聚焦超声神经调节作用的机制。
方案
1. 材料准备
- 吸去培养基，并用其填充含有微电极阵列（MEA）的24孔神经元培养板中的单个孔（图2A）。按照Taga等人的已发表方案进行神经元的培养与诱导13。
- 使用70%乙醇对Parafilm界面、橡胶圈以及带有橡胶膜的FUS探头锥形耦合器进行10分钟的灭菌处理，随后置于超净台中备用，以供后续组装使用。
- 对300 mL去离子水和50 mL耦合凝胶进行脱气处理。将水和凝胶在160 × g 条件下离心5分钟，以避免在耦合介质中产生空化效应。
注意：HiPSCs的原始来源为GM01582和CIPS细胞系。通常每孔可达到约5 × 104个运动神经元和2.5 × 104个星形胶质细胞的密度14。
2. 外设的连接与设置
- 使用螺丝将FUS锥体固定到换能器上，并在通风的无菌罩内用柔性橡胶膜密封锥体。从步骤1.3中取脱气去离子水（DG-DI水）注入锥体内，确保锥体内无气泡，以避免空化效应。
- 使用定制的螺纹杆将3D打印的支架固定到支架框架上（图2B）。调整框架位置，使FUS换能器的头部位于待刺激孔的正上方。
- 使用橡皮筋将Parafilm膜固定在含有培养基和HiPSCs的24孔MEA板的孔上。
- 通过将超声换能器的后端驱动电子设备（本例中为换能器功率输出端TPO；图3A）连接至100–240 V电源插座（图3B，连接6），并将匹配网络分别连接至TPO和FUS换能器（图3B，连接1和连接2），以完成FUS系统的准备。匹配网络可确保换能器与TPO之间的高效电耦合。
- 将MEA系统连接至电源插座（100–240 V）（图3B，连接5）。将MEA系统的同步端口连接至TPO（图3B，连接3）。此连接将实现MEA系统数据采集与FUS刺激的同步。
- 将24孔MEA板放入MEA系统中，并取下盖子，以确保换能器与孔板直接接触。将换能器置于孔板上方5–10 mm处，为后续步骤3.2所述的脱气耦合凝胶预留空间（图3A和图2B）。
3. 刺激与神经元信号采集
- 在TPO控制面板上设置FUS参数 （表 1）。
- 将耦合凝胶涂于石蜡膜表面，并将FUS换能器浸入耦合凝胶中，确保与凝胶充分接触且气泡最少（图2A）。
- 在用户界面中点击开始按钮，启动MEA系统记录。
- 按下TPO右下角的按钮启动FUS超声照射（图3A，标签7），每次超声照射之间至少等待5分钟，以使神经元恢复至基线状态。
- 利用FUS系统生成的触发脉冲，将FUS刺激序列与MEA记录对齐（图3B，连接3）。
4. 数据处理与分析
- 通过 USB 连接将 MEA 系统中的数据传输至计算机（图 3B，连接 4）。首先点击 实验设置 面板开始操作。接着选择需要记录的数据类型，此处建议选择原始尖峰信号。最后为文件命名，并选择磁盘中的目标存储位置以完成传输。
注意：以下步骤可通过运行发布于 https://github.com/Rxliang/FUSNeuromod 的 Python 脚本来实现。 - 读取来自全部 16 个电极的数据。
- 应用八阶巴特沃斯带通滤波器，通带范围为 5 Hz 至 3 kHz。
注意：为优化这些参数，必须考虑特定细胞的放电频率以及参与的细胞数量。将这两个 数值相乘，可估算出实验中细胞群体的总体放电率。 - 应用高斯滤波器（σ = 3）对信号进行平滑处理。
注意：该参数可根据 MEA 系统推荐值进行优化，过度平滑可能导致采集后数据失真，而平滑不足则会引入不必要的噪声。 - 设定检测潜在尖峰信号的阈值，取高斯平滑后信号标准差的 5 倍。
- 通过将 16 个通道在 50 ms 时间窗内记录的尖峰总数除以时间窗长度（即 50 ms），计算放电率。将时间窗沿信号滑动至下一帧，并重复放电率计算（补充图 1）。
- 通过分析传输数据中与聚焦超声（FUS）相关的放电率变化，读取 FUS 声刺激时间，进而分析信号。
5. 多孔微电极阵列板的清洗与重复使用
- 实验完成后，使用移液器小心地从多孔板的各孔中移除培养基，注意避免触碰电极表面。
- 每孔加入 2 mL 去离子双蒸水（DG-DI 水），吸除后重复一次。
- 为去除任何残留细胞和碎片，向板中加入 1 g 酶型清洁剂 Terg-A-Zyme 与 10 mL 无菌 DG-DI 水的混合液（每孔 0.3 mL）。于室温（RT）孵育过夜。
- 次日，从各孔中移除溶液，并用 1 mL 无菌 DG-DI 水冲洗各孔。
- 将多孔板孵育 5–7 分钟后吸除液体，重复此步骤 5 次。
- 每孔加入 0.5 mL 无菌 DG-DI 水，记录清洁后多孔板的基线信号，以验证 MEA 板是否清洁。清洁合格的板应呈现低强度的高斯噪声模式。
- 将清洁后的多孔板储存于 4 °C，直至再次使用。每月至少更换一次 MEA 储存用水。
结果
总之，我们提出了一种能够实现 体外 利用由人诱导多能干细胞（HiPSCs）培养的神经元进行FUS神经调控监测。用于刺激HiPSC诱导神经元并记录相应电反应以进行分析的整体系统平台如图所示。 图1本研究聚焦于利用FUS刺激神经元，并在MEA系统中记录其电学响应，如图所示 图2FUS 和 MEA 系统的外周组件及其连接方式如图所示 图3.
在进行神经元实验之前，需先完成对焦点的表征，以确保微孔板底部完全被聚焦超声（FUS）的焦点覆盖。应通过热致变色片对焦点位置进行可视化观察，如图4所示，以评估FUS系统的性能。在完成焦点表征后，应进行包括滤波、阈值设定和发放率计算在内的后处理步骤，这些步骤在图5和图6中进行了总结。这些步骤对于通过滤除环境噪声来提取有用的信号至关重要，从而深入了解由FUS引起的神经元活动变化。图6A-B中的点阵图展示了在各个通道中检测到的动作电位。由于微孔板的整个底部均处于FUS换能器的焦点范围内，因此预期FUS将改变所有电极上的发放率。这种发放率的变化在图6C所示的发放率图中得以体现，结果显示所选的刺激参数导致神经元发放率升高。具体而言，FUS前（即基线）的发放率为140 Hz ± 116.7 Hz，而在连续波FUS作用后，发放率上升至786 Hz ± 419.4 Hz。此外，图6C还显示，改变FUS参数（例如，使用脉冲波FUS替代连续波FUS）可影响发放率变化的幅度，并改变神经元恢复至基线状态所需的时间。低强度聚焦超声（LIFU）不会引起培养物显著升温，尤其是与旨在产生热消融效应的高强度聚焦超声相比更是如此。理论上计算和模拟结果支持了其不会引起具有临床意义的温度变化这一结论（补充图2）。即使在表1所列实验FUS参数的极端情况下，也仅能观察到约0.04 °C的微小温升。
使用放电率图可以量化FUS的神经调节效应，并可用于区分兴奋性和抑制性反应。多孔MEA板的一个显著优势在于，它可以被重复使用多次，以高通量的方式研究不同的神经元状态和刺激参数。
图1：概述 体外 一种用于在微孔板中对神经元进行聚焦超声（FUS）神经调控，并利用微电极阵列测量其神经活动的平台。 每个电极（红色、绿色和蓝色线条）记录来自单个孔内一群神经元的信号。通过实施一个处理流程，将原始的神经元电信号转化为神经元放电模式的检测。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图2：结合多孔微电极阵列（MEA）的聚焦超声（FUS）神经调控。 （A）结合多孔MEA进行FUS神经调控的实验装置示意图。FUS换能器产生的声波穿过充满脱气水的FUS声锥，并通过超声耦合凝胶传导。使用橡皮筋将石蜡膜固定在孔上，以防止污染。MEA板将神经元的电信号记录传输至MEA系统。（B）置于MEA系统内多孔板上的FUS换能器实物照片。请点击此处查看该图的高清版本。
图 3：体外平台设置。（A）体外平台设置的正面。换能器功率输出（TPO；左侧）用于设定FUS参数。MEA系统（右侧）记录来自孔板中神经元的电活动，这些神经元由FUS换能器进行神经调节。（B）体外平台设置的背面，显示匹配网络（1）至TPO以及（2）至换能器的连接。（3）MEA系统与TPO之间的连接用于同步数据采集。（4）MEA系统与计算机之间的连接用于数据传输。（5）MEA系统的电源连接。（6）FUS系统的电源连接。（7）超声照射按钮。请点击此处查看此图的放大版本。
图4：FUS换能器的表征。（A）使用AMPLITUDE系统15测量的、基于表1中详述的FUS参数所获得的焦点压力分布图。（B）利用图3所示实验装置，在孔板底部放置热致变色片进行超声照射前后的图像。热致变色片随温度变化而发生颜色改变，从而在神经元所在位置直观验证了有效刺激的成功实现。通过设定最大空间峰值脉冲平均强度（ISPPA）为30 W/cm2，并持续超声照射3分钟，以显著改变局部温度，便于更清晰地观察该焦点区域。请点击此处查看此图的放大版本。
图 5：信号处理流程。步骤 1：从 N = 16 个通道采集原始电信号记录。后续步骤以通道 16（红色框出）为例展示处理过程。步骤 2：对每个通道应用 Butterworth 带通滤波器（5 Hz 至 3 kHz 带通），随后应用高斯滤波器（σ = 3）。阈值设定为聚焦超声开始时刻前后 2 秒时间窗内信号标准差的 5 倍。步骤 3：高于或低于该阈值的信号被识别为尖峰信号。请点击此处查看该图的放大版本。
图6：点阵图与放电率图。（A）各通道在不同超声照射时间下检测到的尖峰活动点阵图。红色竖线标注了聚焦超声（FUS）刺激的时间点。（B）在不同FUS参数设置下的神经元点阵图，并以连续FUS作为对照。（C）使用50 ms滑动窗口计算放电率。FUS神经调控前后的平均放电率分别为140 Hz和786 Hz；在脉冲FUS条件下，平均放电率分别为230 Hz和540 Hz。该组变化的FUS刺激诱导的激活时间更短，放电率变化幅度更小。放电率的计算过程详见补充图1。请点击此处查看该图的放大版本。
| 参数 | 数值 |
| 最大功率/通道 | 1.200 W |
| Pactual | 0.749 W/通道 |
| ISPPA | 10.79 W/cm2 |
| ISPTA | 0.05 W/cm2 |
| 脉冲持续时间 | 0.100 ms |
| 频率 | 250.00 kHz |
| 焦点 | 39.800 mm |
| 周期 | 20.000 ms |
| 定时器 | 60.000 s |
表1：本研究中在TPO上设定的聚焦超声（FUS）参数 图4.
补充图1：从点阵图到放电频率的处理过程。 步骤1：统计所有通道中的峰电位数量，以获得给定滑动窗口内的计数值。注意：此处选择较大的滑动窗口（设定为0.1 s）以便更清晰地展示。步骤2：将每个窗口长度内的峰电位数转换为每秒峰电位数（例如，此处将计数值乘以10转换为赫兹 [Hz]，再除以1,000得到千赫兹 [kHz] 的值）。步骤3：由此获得的放电频率曲线。一个开源工具包及示例数据可在GitHub上获取（https://github.com/Rxliang/FUSNeuromod）。请点击此处下载该文件。
补充图2：LIFU的K波模拟结果温度分布图16。根据图4所示的声强分布图，采用表1中列出的实验FUS参数的极端情况，K波模拟结果显示在焦区中心区域（半径：2 mm）内的最大温度升高为0.04 °C。请点击此处下载该文件。
讨论
本文描述了一种可用于记录在聚焦超声（FUS）神经调控期间人诱导多能干细胞（HiPSCs）神经元活动的新方法。该方案可推广应用于不同的FUS换能器和微电极阵列（MEA）系统。为重现本文所述方案中观察到的结果，研究人员应确保换能器的焦点区域大于MEA孔底部的面积。此外，若使用不同的神经细胞系，则必须根据孔内细胞预期的频率响应调整滤波参数。如果无法获得代表性结果，应考虑修改上述参数（例如脉冲持续时间、强度、占空比等）。
尽管本研究显示聚焦超声刺激后神经元放电频率有所增加，但在得出任何结论之前，仍需收集更多数据以验证该发现的可重复性。本实验方案继承了多电极阵列（MEA）系统的局限性，这类系统通常因直接记录微电极电流信号而存在缺陷。虽然与神经元的直接接触可提高检测灵敏度，但也可能改变细胞状态，从而影响测量的准确性。此外，由于培养孔尺寸较小，本系统未包含外周组织，而外周组织可能在神经调节过程中发挥一定作用。17这可能会限制从该实验装置中得出的结论的适用性 体内 环境。为了研究更复杂的网络响应，必须设计更高通道密度的MEA系统以提高其灵敏度18已确定该提议系统的多个未来发展方向，包括使用三维龙门架来固定换能器并确保其精确定位19. 关于后处理算法，还可进行进一步改进，包括采用脉冲排序算法20 对单个神经元进行分类。该过程将有助于在未来关于FUS机制的研究中解析多单元神经元的反应。最重要的是，必须结合其他类型的刺激方式，如化学、电和光刺激，以阐明其潜在机制。这些方法可以通过抑制特定离子通道等方式改变神经元的特性和行为15 或改变膜的特性21通过调控假设信号通路中的主要因子，研究人员能够在受控环境中确定各因子的贡献，最终阐明其中复杂的相互作用。
电刺激22 是神经调节中最成熟的技术之一，在临床和科研领域已有长期成功的应用历史。相比之下，聚焦超声（FUS）和光遗传学23 是近年来才受到关注的较新技术手段。FUS 的主要优势在于其非侵入性，以及能够刺激其他技术（包括电刺激和光遗传学）难以到达的深层神经元。然而，与光遗传学24 类似，FUS 在模拟声波传播及其引发的神经元反应方面存在一些局限性。在活体（in vivo）条件下准确表征组织异质性声学特性的复杂性具有挑战性，这会导致声压场的不确定性，进而影响神经元反应的可预测性。这些特性在建模上的困难，给该技术在特定实际应用中的优化带来了挑战。上述固有的复杂性凸显了体外（in vitro）系统的重要性，例如本研究中所采用的系统，可在受控的声强条件下直接研究神经元的响应特性。
总之，该系统提供了一种高通量的 体外 研究聚焦超声（FUS）对人类神经元神经调节作用的平台。利用该系统，可在受控环境中通过测量人类神经元在不同强度和类型刺激下的电生理反应，探究FUS的作用机制。因此，该系统为该领域常用的人体和动物模型提供了一种有价值的补充工具。
披露
作者声明，本研究在无任何可被视为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行。Amir Manbachi 为 BK Medical（GE Healthcare）和 Neurosonics Medical 提供教学和咨询服务，并且是多项正在申请专利的聚焦超声（FUS）技术的发明人。Betty Tyler 获得美国国立卫生研究院（NIH）的研究资助，是 Accelerating Combination Therapies 公司的共同所有人（包括股权或期权）。Ashvattha Therapeutics 公司已获得她的一项专利授权， 她同时也是 Peabody Pharmaceuticals 的股东。
致谢
Amir Manbachi 和 Nitish Thakor 承认获得美国国防高级研究计划局（Defense Advanced Research Projects Agency, DARPA）的资助，项目合同编号：N660012024075。此外，Amir Manbachi 承认获得美国国家转化科学促进中心（National Center for Advancing Translational Sciences, NCATS）下属的美国国立卫生研究院（National Institutes of Health, NIH）管理的约翰斯·霍普金斯临床与转化研究所（Johns Hopkins Institute for Clinical and Translational Research, ICTR）临床研究学者项目（KL2）的资助。Nitish Thakor 承认获得美国国立卫生研究院（NIH）的资助：项目编号 R01 HL139158-01A1 和 R01 HL071568-15。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| MEA 系统 | Axion Biosystem Inc. | Maestro Edge | 采样率：11500 Hz |
| MEA 培养板 | Axion Biosystem Inc. | CytoView MEA | 电极与孔数：每24孔含16个电极 |
| 培养板密封接口 | Amcor Inc. | Parafilm PM996; P7793 | 厚度：127 µm |
| 细胞培养用 CO2 气瓶及减压阀 | AirGas Inc./ Harris Inc. | 9296NC | 浓度：5% |
| 培养基 | ThermoFisher Inc. | 层粘连蛋白；23017-015 | 浓度：1 µg/mL |
| 人诱导多能干细胞来源神经元（HiPSC 神经元） | Peprotech | CIPS 和 GM01582 来源；450-10 | 浓度：10 ng/mL（参见 Taga 等 [2021]13） |
| 换能器 | Sonic Concepts Inc. | CTX250; 008 | 中心频率：250 kHz |
| 匹配网络 | Sonic Concepts Inc. | CTX250; NFS102v2 | 阻抗：50 Ω |
| 换能器输出功率（TPO） | Sonic Concepts Inc. | 版本 4.1; 020 | 频率范围：250 kHz 至 2.5 MHz |
| 膜材料 | McMaster Inc. | 硅橡胶；5542N115 | 厚度：0.0127 cm |
| 耦合凝胶 | Parker Laboratory Inc. | Aquasonic 100; B08DDWG GXB | 黏度：130,000–185,000 cops |
| 探头支架连接件 | McMaster Inc. | 钢制螺纹杆；90322A661 | 长度：1–1/2" 长 |
| 离心机 | ThermoFisher Inc. | Sorvall Legend X1R; 75004261 | 最大加速度：10–25,830 ×g |
| 水听器 | Sonic Concepts Inc. | Y-104; 009 | 频率范围：50 kHz–1.9 MHz |
| 水槽 | Sonic Concepts Inc. | WT | 尺寸：30 cm × 30 cm × 30 cm |
| 水循环调节装置 | Sonic Concepts Inc. | WCU; SN006 | 最大流速：50 mL/s |
| 示波器 | Rohde-Schwarz Inc. | RTC1002 | 采样率：最高 50 MHz |
| 显微定位平台 | Sonic Concepts Inc. | MicroStage; 2 | 精度：1 µm |
| 热致变色片 | TIPTEMP Inc. | 液晶片；TLCSEN337 | 响应温度范围：22–24 °C |
| 计算机 | Microsoft Surface | Surface Pro | CPU i5 1035G4：3.7 GHz |
| 数据传输软件 | Mathworks Inc. | MATLAB | 版本 2021b |
| 数据处理软件 | Python Software Foundation | Python | 版本 3.7.10 |
参考文献
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