利用双光子显微镜对小鼠胸腺进行原位成像

摘要

我们提供了生成新生嵌合体的逐步操作说明，以及为进行双光子显微镜离体成像而进行的胸腺解剖与制备方法。

摘要

双光子显微镜（TPM）使我们能够深入胸腺内部成像，记录对胸腺细胞发育至关重要的事件。为了在大量胸腺细胞中追踪单个细胞的迁移行为，我们构建了新生期嵌合体，其中少于百分之一的胸腺细胞来源于一种转基因供体，该供体普遍表达一种荧光蛋白。为了生成这类部分造血嵌合体，我们在新生受体出生后3至7天内向其注射骨髓细胞。4至6周后，处死小鼠，小心解剖并沿中线切开胸腺，以保持待成像组织的原有结构。将胸腺组织用胶固定在盖玻片上，为TPM的离体成像做准备。成像过程中，胸腺组织被置于不含酚红的DMEM培养基中，并持续灌流含95%氧气和5%二氧化碳的气体，同时将温度维持在37°C。利用该方法，我们可以研究生成多样化T细胞受体库所需的关键事件。

方案

过继性转移

在出生后前3至7天内，使用胰岛素注射器对新生小鼠进行2至4次骨髓注射，每次50-100 µL，最终达到供体与受体比例为1:1。注射部位应位于胸骨和肋骨下方，但高于肠道和胃部。进针深度应足以穿透腹膜，注意避免刺破膈肌。注射过程中部分骨髓流失是常见现象。注射时可适当放松对幼鼠的抓握，使皮肤得以伸展，从而减少流失，并在注射完成后缓慢拔出针头。

胸腺的解剖

沿中线做切口，剪开或撕开皮肤以暴露肋骨。抓住胸骨，切开腹膜和膈肌。沿肋骨两侧向上剪开，以暴露胸腔。胸腺位于心脏上方。为保持胸腺结构完整，在分离胸腺时应握住周围组织。用PBS冲洗胸腺，防止其在解剖过程中干燥。轻轻剥离胸腺被膜表面的多余组织，并将两个叶分开。

准备组织以进行成像

使用兽用组织粘合剂将胸腺粘附到方形盖玻片上。用移液器滴加微量粘合剂，将胶水涂抹至与胸腺大致相同的长度和宽度。固定胸腺位置，使其紧贴盖玻片，并将其拖动至合适位置。

双光子成像

将组织浸没在不含酚红的DMEM中，用95%氧气和5%二氧化碳灌流，并加热至37°C。双光子激发采用调谐至900 nm的Spectra-Physics MaiTai激光器实现，CFP、GFP、YFP和Texas Red的发射光通过495、515、560二向色镜分离，并使用PMT检测器收集。

讨论

通过胸腺中的双光子成像，我们能够在活体、完整的器官中观察胸腺内选择事件所依赖的细胞相互作用与迁移过程。