功能位点定向荧光法是一种实时研究蛋白质结构域运动的方法。对该技术进行改良并应用于天然细胞后， now allows the detection and tracking of single voltage-sensor motions from voltage-gated Ca2+ 小鼠分离骨骼肌纤维中的通道。
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摘要
摘要
功能位点定向荧光测定法一直是研究多种膜蛋白（包括电压门控离子通道）结构与功能关系的首选技术。该方法主要应用于异源表达系统，可同时测量膜电流（通道活性的电学表现）和荧光信号（报告局部结构域的构象变化）。功能位点定向荧光测定法将电生理学、分子生物学、化学与荧光技术结合为一种综合性技术，分别通过荧光和电生理手段实现对实时结构变化与功能的检测。通常，该方法需要构建含有可被巯基反应性荧光染料标记的半胱氨酸残基的工程化电压门控膜通道。直至最近，用于蛋白质位点特异性荧光标记的巯基反应化学仅在 非洲爪蟾 卵母细胞和细胞系，限制了该方法在原代非兴奋性细胞中的应用。本报告描述了功能位点定向荧光测定法在成年骨骼肌细胞中研究兴奋-收缩耦联早期步骤的适用性，兴奋-收缩耦联是指肌纤维电去极化与肌肉收缩激活相联系的过程。本实验方案详细介绍了设计和转染半胱氨酸定点突变的电压门控Ca2+ 通道（CaV1.1）利用成年小鼠趾短屈肌的肌纤维 体内 电穿孔及后续功能位点定向荧光测量所需步骤。该方法可适用于研究其他离子通道和蛋白质。对哺乳动物肌肉进行功能位点定向荧光测量在研究兴奋性基本机制方面具有重要意义。
引言
在活细胞中，通过已知的电刺激来追踪离子通道构象重排的能力，为分子生理学提供了宝贵的信息1。电压门控离子通道是一类膜蛋白，能够感知跨膜电压的变化，其功能也受到电压变化的影响2。上个世纪电压钳技术的发展，使生理学家得以实时研究电压门控离子通道在膜去极化过程中所介导的离子电流3。电压钳技术的应用对于理解神经元和肌肉等可兴奋细胞的电学特性至关重要。20世纪70年代，电压钳技术的改进使得研究人员能够在电压门控钙（CaV）通道和钠（NaV）通道中检测到门控行电流（或称电荷移动）4,5。门控行电流是由细胞膜电场变化引起电压传感器移动所产生的非线性电容性电流6。门控行电流被认为是离子通道开放之前或伴随开放过程发生的分子构象重排的电学表现7。尽管这些电流测量为通道功能提供了重要信息，但离子电流和门控行电流均为电压门控通道分子间和分子内构象重排的间接读数7。
功能位点特异性荧光测定法（FSDF；也称为电压钳位荧光测定法，VCF）于20世纪90年代初期开发8，首次实现了实时直接观察通道蛋白的局部构象变化及其功能。结合通道蛋白的定点诱变、电生理学技术以及异源表达系统，可对特定通道或受体在激活刺激下发生运动的结构域进行荧光标记并追踪其动态过程9,10。该方法已被广泛应用于研究电压门控离子通道中的电压感应机制8,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19。有关权威综述，请参见10,20,21,22,23。
CaV 和 NaV 通道对于电信号的起始与传导至关重要，它们由一个主要的 α1 亚基组成，该亚基具有一个中央孔道和四个非相同的电压感应结构域2。除了各自独特的初级结构外，CaV 和 NaV 通道还以多亚基复合物的形式表达，并包含辅助亚基24。电压门控钾通道（KV）由四个亚基组成，每个亚基类似于 NaV 或 CaV 的单个结构域25。CaV 和 NaV 通道中形成孔道和感知电压的 α1 亚基由一条单一多肽链编码，该多肽链包含四个独立的结构域，每个结构域含有六个独特的跨膜节段（S1–S6；图 1A）24,26。S1 至 S4 跨膜节段组成的区域形成电压感应结构域（VSD），而 S5 和 S6 跨膜节段则构成孔道结构域26。在每个 VSD 中，S4 α-螺旋含有带正电荷的精氨酸或赖氨酸（图 1A、B），这些残基会响应膜去极化而发生移动7。数十年的研究以及来自多种不同实验方法的结果均支持以下观点：在膜去极化时，S4 节段向外移动，从而产生门控电流6。
FSDF 测量的是与离子通道或其他蛋白质上特定半胱氨酸残基（即 S4 α-螺旋）结合的巯基反应性染料的荧光变化，该蛋白经过基因工程改造 通过 定点突变，因为该通道在膜去极化或其他刺激下发挥功能10事实上，FSDF最初是为了研究K通道中的S4片段是否V 通道中被提议作为通道主要电压感受器的部分，会在门控电荷随膜电位变化而移动时发生运动8,10对于电压门控离子通道，FSDF 能够在测量通道功能的同时，解析四个电压感应结构域（VSD）各自独立的构象重排（在任意给定时间追踪一个 VSD）。事实上，利用该方法已发现，各个 VSD 在通道激活与失活的特定过程中似乎发挥着不同的作用。12,27,28,29,30明确每个电压感应结构域（VSD）对通道功能的贡献具有重要意义，可用于进一步阐明通道的工作机制，并可能为药物开发提供新的靶点。
在异源表达系统中使用FSDF对于从还原论的角度进一步理解通道功能极为有益10,23。与许多还原论方法一样，该方法具有优势，但也存在局限性。例如，其中一个主要局限在于异源系统中通道纳米微环境的重建仅是部分实现。通常情况下，离子通道会与多种辅助亚基及其他多种蛋白质相互作用，从而调节其功能31。原则上，可通过使用多个蛋白编码载体或双顺反子质粒在异源系统中共同表达不同的通道及其辅助亚基，但其天然微环境无法被完全重建30,32。
我们课题组近期发表了一种在原代分离的骨骼肌纤维中应用的FSDF变体，用于研究兴奋-收缩耦联（ECC）的早期步骤33,34肌肉纤维电去极化与肌肉收缩激活相偶联的过程35,36首次利用该方法实现了对电压门控L型Ca通道中单个S4电压传感器的运动追踪2+ 通道（CaV1.1，也称为二氢吡啶受体（DHPR），在成年分化肌纤维的天然环境中37。这是通过考虑该细胞类型的多种特性实现的，包括细胞的电活动性，使其能够快速响应刺激并产生自传播的去极化，以及表达cDNA质粒的能力 在体 电穿孔、通道在细胞内的天然高表达和区室化分布，以及其与高速成像和电生理记录设备的兼容性。此前，我们采用高速线扫描共聚焦显微镜作为检测设备37现在介绍一种采用光电二极管进行信号采集的技术变体。这种基于光电二极管的检测系统有助于在其他实验室中推广应用该技术。
本文介绍了一种在天然细胞中利用FSDF技术研究CaV1.1电压感受器单个运动的逐步实验方案。尽管本文通篇以CaV1.1通道为例进行说明，但该技术也可应用于其他离子通道、受体或膜表面蛋白的细胞外可及结构域的研究。
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方案
本方案已获得马里兰大学机构动物护理与使用委员会的批准。以下方案分为多个子部分，包括（1）分子构建设计与半胱氨酸反应性染料的选择，（2） 体内 电穿孔，（3）肌肉解剖与肌纤维分离，（4）信号采集系统设置，（5）增强型绿色荧光蛋白（EGFP）阳性肌纤维电活动及半胱氨酸染色的评估，以及（6）信号采集与处理。此外，在各部分开始时，均详细说明了在骨骼肌纤维中应用FSDF时需注意的相关事项。所有实验步骤均须佩戴适当的个人防护装备，包括实验服和手套。
1. 分子构建设计与半胱氨酸反应性染料的选择
- 构建设计是实验成功的关键部分。首先，构建一个野生型、荧光标记的 CaV1.1 cDNA 质粒，并在合适的细胞类型中评估其表达情况。对于肌纤维，使用携带巨细胞病毒（CMV）启动子的质粒可实现高效的转染。在本方案中，使用了已表征的兔源 EGFP-CaV1.1 质粒38。
注意：在对 cDNA 构建体进行工程化以在电压门控离子通道中引入半胱氨酸残基时，半胱氨酸的位置至关重要，需仔细考虑。该半胱氨酸应从细胞外空间可及，以便进行巯基偶联染料反应（图 1C、D），并且应靠近 S4 区域，以精确追踪其在去极化过程中的运动。然而，为了使偶联的荧光团在蛋白运动时发生荧光淬灭，所引入的半胱氨酸偶联荧光团应位于两种不同环境的界面处（例如，膜与细胞外液之间；图 1E）。此外，必须确保插入的半胱氨酸不会干扰蛋白功能。 - 为确定合适的半胱氨酸定位位置，需收集有关通道结构的信息，或参考其他相关通道蛋白的荧光测定实验数据。在设计半胱氨酸工程化的 CaV1.1 构建体时，应分析该通道已解析的冷冻电子显微镜（cryo-EM）结构26，并比较先前在相关通道（如 CaV1.212）或其他通道（如 Shaker11 和 NaChBac39）中半胱氨酸插入的研究结果。
- 一旦选定合适的半胱氨酸位置，使用商业化的定点突变试剂盒引入半胱氨酸替换。在本方案中，分别在 CaV1.1 的 S4 电压感应节段的每个胞质端独立构建了以下半胱氨酸突变：VSD-I（L159C）、VSD-II（L522C）、VSD-III（V893C）、VSD-IV（S1231C），以及 UniProtKB: P07293（图 1B）。
- 对于骨骼肌纤维，使用 5-羧基四甲基罗丹明甲硫基磺酸盐（MTS-5-TAMRA），该试剂可有效且快速地扩散进入横小管膜系统——这是细胞表面膜的内陷结构，也是 CaV1.1 通道的主要分布区域。MTS-5-TAMRA 在从脂质膜环境转移至水相环境时，荧光强度会下降（图 1E）。
注意：Dylight 或 Alexa-马来酰亚胺衍生物仅标记细胞表面膜，无法标记横小管系统。
图1跨膜α螺旋界面处巯基-半胱氨酸反应示意图 (AL型CaV1.1 膜拓扑结构。加号代表 S4 α-螺旋中的碱性残基，橙色星号表示引入半胱氨酸的位置 通过 定点突变。BS4序列比对I 至 S4IV 兔CaV1.1（UniProtKB: P07293）。参与电压感应的关键带正电荷的精氨酸和赖氨酸残基以红色标出，而人工引入的半胱氨酸替换位点以橙色标出。本图改编自参考文献37. (C) 半胱氨酸巯基荧光分子反应。D) 图示在跨膜电压敏感性α-螺旋中进行半胱氨酸突变插入。在静息状态下，半胱氨酸应埋藏于膜内，去极化后（ΔV；I）可从细胞外侧接触。若目标半胱氨酸在去极化前已可从细胞外空间接触（II），或去极化后仍无法从细胞外空间接触（III），则通常难以实现半胱氨酸追踪。E与巯基荧光分子反应后，去极化引起的α螺旋运动导致MTS-5-TAMRA荧光发射减弱。荧光信号由S4螺旋的运动及其后染料相对于膜平面和水环境的移动所产生。 请点击此处以查看此图的放大版本。
2. 体内 电穿孔
注意：电穿孔实验参照先前所述方法38并加以修改。以下部分所述方案适用于小鼠单侧足垫的电穿孔。若需处理双侧足垫，则需调整体积。
- 在冰上放置的 1.5 mL 离心管中，分装 25–100 µL 质粒溶液（浓度为 2–5 µg/µL）。
- 制备 0.5 mL 含透明质酸酶（2 mg/mL）的无菌生理盐水溶液，并使用安装在 1 mL 注射器上的低蛋白吸附性 0.2 µm 无菌滤器过滤该溶液。将滤后溶液储存于 1.5 mL 离心管中，室温保存。
- 使用校准的麻醉装置，将小鼠置于麻醉舱内，通过吸入 3%–4.5% 异氟烷（O2 流速为 1 L/min）进行麻醉。用镊子夹捏小鼠尾尖以确认麻醉深度；当达到理想麻醉状态时，不应出现反应。
- 将小鼠从麻醉舱中取出，并在其鼻部覆盖麻醉面罩。将动物仰卧于覆盖无菌实验垫的等温加热垫上。通过啮齿类动物专用面罩继续给予 3% 异氟烷（O2 流速为 1 L/min）维持麻醉。
- 为防止手术过程中眼睛干涩，使用无菌棉签在动物眼部涂抹一层人工泪液软膏。用浸有乙醇的无菌擦拭巾对动物足部进行消毒。
- 使用一支长 0.5 英寸、29 G 的无菌胰岛素针头吸取 20 µL 透明质酸酶溶液。在足跟水平处刺入皮肤，并将针头沿皮下向脚趾基部推进（图 2A）。一边缓慢注射溶液，一边逐步将针头向后退出。可见足部皮下形成一个隆起或肿块（图 2B）。
注意：根据动物年龄和足部大小，可能无法完全注入全部溶液。注射点处常可能出现少量液体渗漏。 - 如需处理另一只足部，请在按步骤 2.5 完成足部消毒后，使用另一支无菌针头重复步骤 2.6。
- 移除鼻罩以终止麻醉，将小鼠放回笼中，并自由提供食物和饮水 ad libitum。约 5 分钟内应观察到小鼠完全从麻醉中恢复。将含有质粒溶液的离心管置于实验台，使其升至室温。
- 1 小时后，再次对动物实施麻醉，将其置于加热垫上，并按照步骤 2.3–2.5 的方法对足部进行消毒。
- 使用步骤 2.6 所述相同技术，注射 10–20 µL cDNA 构建物。每只足部注射总量为 50–100 µg。如需处理对侧足部，请使用另一支无菌注射器重复操作。
- 将动物继续置于等温加热垫上维持麻醉状态 5 分钟，以使 cDNA 溶液在组织中均匀扩散。
- 开启电穿孔仪设备，并按照制造商建议将其连接至双电极阵列。
- 使用浸有乙醇的擦拭巾对双电极阵列进行消毒。用一只手固定足部，先将一个电极从足跟后方插入皮下，再将第二个电极插入脚趾基部，确保两个电极的方向均垂直于足部的长轴（图 2C）。调整探头位置，避免使足部或腿部处于极端角度而受限。
注意：可使用镊子辅助插入电极，并定期打磨电极尖端以提高操作便利性。根据动物年龄不同，足部大小存在差异，应相应调整电极间距。 - 施加 20 次脉冲，每次持续 20 ms，频率为 1 Hz，对肌肉组织进行电穿孔。当电极针间距为 1 cm 时，设定电压约为 100 V。若电极间距改变，应相应调整电压，以达到约 100 V/cm 的电场强度。若电极位置正确，在脉冲施加期间应可观察到脚趾轻微屈曲。
- 如需处理对侧足部，请重复步骤 2.13 和 2.14。
- 停止麻醉，将动物单独饲养于笼中，与未经电穿孔处理的配对动物分开，并自由提供食物和饮水 ad libitum，持续 2 小时。约 10 分钟内应观察到动物完全恢复。之后将动物重新放回笼中。
注意：cDNA 构建物的表达水平高度依赖于其所编码的蛋白质。蛋白周转率、cDNA 的数量与质量、质粒启动子类型及其他变量均可能影响构建物的表达。在本实验中，使用 CMV 启动子驱动的 CaV1.1 α1S 亚基的最佳表达需 4 至 6 周，但最早可在 2 周时检测到表达，可持续长达 12–15 个月。
图 2：小鼠足垫中 cDNA 注射与电穿孔电极定位示意图。 （A）透明质酸酶和 cDNA 注射时针头在小鼠足垫下的位置。箭头指示穿刺皮肤的进针点。（B）注射后应短暂观察到皮肤轻微变色及足部轻微肿大。（C）电穿孔用的电极阵列定位。请点击此处查看此图的放大版本。
3. 肌肉解剖与肌纤维分离
注意：骨骼肌纤维的分离按照先前描述的方法37,40,41稍作修改进行。以下方案适用于小鼠的两个足垫组织。
- 在纤维解离前，准备一个表面覆盖Sylgard的培养皿：在直径60 mm的塑料培养皿中，按10:1的质量比（w/w）将固化剂与弹性体混合，铺成厚度约为5 mm的层。将覆盖弹性体的培养皿静置过夜使其充分固化后再使用。若妥善保存，并在使用前后用70%乙醇消毒，该培养皿可多次重复使用。
- 将 4 mg I 型胶原酶溶于 2 mL 添加 10% 胎牛血清（FBS；终浓度为 2 mg/mL）的旋转瓶最低必需培养基（S-MEM）中。将溶液转移至 35 mm 未包被的塑料培养皿中，并将培养皿置于培养箱内 37 °C，5% CO2.
注：S-MEM 是一种不含谷氨酰胺和 Ca 的改良型 MEM 培养基2+。钙的缺失2+ 此步骤可减少酶消化和吹打过程中的纤维收缩。 - 在60 mm未包被的塑料培养皿中加入5 mL添加10% FBS的S-MEM，置于培养箱中孵育 37 °C，5% CO₂2.
- 通过窒息法对动物实施安乐死 通过 CO2 随后进行颈椎脱位。为减少原代细胞分离过程中的污染，将动物尸体浸入70%乙醇中约10秒。取出后用吸水纸擦干尸体，并用剪刀在踝关节与膝关节之间剪去足部。图3A).
- 在解剖显微镜下（10倍放大），将动物的一只脚掌朝上，用解剖针固定在覆盖有弹性体的板上。
- 使用解剖剪和精细镊子去除足垫皮肤，以暴露趾短屈肌（FDB 肌肉）图3B）。为防止组织干燥，使用移液器向肌肉组织中加入一滴 S-MEM 10% FBS 1,000 µL 移液器
- 在足跟水平切开肌腱，并从足跟到足趾仔细分离趾短屈肌（FDB）肌肉（图3B）。解剖过程中应尽量避免对肌肉施加张力，过度用力会导致肌肉纤维损伤。立即将肌肉置于胶原酶溶液中。
- 用对侧足重复步骤 3.5–3.7。将解剖出的肌肉置于胶原酶溶液中 37 °C，5% CO2 置于培养箱中孵育2小时45分钟至3小时15分钟。根据胶原酶的酶活性及动物年龄调整孵育时间。
- 在肌肉组织孵育的同时，加入 300 µL 在35 mm玻璃底培养皿中央加入无血清无抗生素的冷MEM。添加 2 µL 将1.20 mg/mL的冷层粘连蛋白直接加入MEM中。根据所需培养皿数量重复该操作。将培养皿放入细胞培养箱中 37 °C，5% CO₂2 至少 1 小时，以使层粘连蛋白聚合。
- 当酶消化完成后，使用大口径（5 mm）火焰抛光玻璃巴斯德吸管和乳胶吸球，将肌肉转移至含有 S-MEM 10% FBS 的 60 mm 细胞培养皿中。
- 使用较小口径（2 mm）的火焰抛光玻璃巴斯德移液管和橡胶吸头，在解剖显微镜下轻轻吹打肌肉组织图 3C分离的肌纤维应开始从组织上脱落并释放到溶液中。
注意：通常情况下，应尽量减少吹打次数（15–30 次移液操作），因为过度且长时间的吹打可能会对纤维造成应力甚至损伤。 - 使用一对精细镊子，去除任何非肌肉组织，例如神经、肌腱或血管（图3D).
- 向每个35 mm的层粘连蛋白包被的玻璃底培养皿中加入2 mL温热的含2% FBS的MEM。使用 200 µL 使用移液器和无菌塑料移液头，将解离的肌纤维转移至35 mm经层粘连蛋白包被的玻璃底培养皿中（图3E).
注意：实现较低的纤维密度并使纤维彼此充分分离，对于防止纤维重叠至关重要。 - 将35 mm玻璃底培养皿放入培养箱中 37 °C，5% CO2纤维可在 2-20 h 的时间范围内使用。
图3；FDB肌肉纤维的解剖与分离。（A）在踝关节上方（虚线）进行足部解剖后，沿虚线去除足底皮肤以暴露FDB肌肉（B）。将肌肉组织解剖取出并置于胶原酶溶液中。（C）孵育后，通过吹打使肌肉组织解离，获得单根肌纤维。（D）使用精细镊子去除非肌肉组织和碎片，随后将肌纤维转移至经层粘连蛋白包被的玻璃底培养皿中。请点击此处查看此图的放大版本。
4. 采集设置说明
注意：采集设置与之前描述的类似42，但有所修改（图4A）。
- 打开所有组件：计算机、AD/DA 转换器和膜片钳放大器、显微镜、电动载物台、操纵器、光电二极管电源、光源、光快门、脉冲发生器以及实验协议编辑器。
- 从 AD/DA 激活晶体管-晶体管逻辑（TTL）触发输出信号，以控制脉冲发生器、光快门和协议编辑器。
- 使用脉冲发生器的TTL输出信号并将其连接至放大器的AD通道，以验证精确的时间触发。应在实验前仔细评估触发一致性的充分控制，以确保设备同步的可靠性。
注意：对于 CaV1.1 预期在刺激后不到 4–10 ms 内观察到最大信号（达到最大电荷运动所需时间）5）。信号具有快速特性，精确的时间分辨率对于与其他测量方法（如钙瞬变或电荷移动）进行比较至关重要 通过 电压钳 - 将激发光聚焦于光纤的特定区域或光斑图4B），在激发光路中使用一个孔径光阑，从而仅在EGFP-CaV1.1 信号达到最大值（图 4B).
图4记录系统描述。 (A) 示意图展示了记录系统各组件之间的连接方式。该装置由一台带有电动载物台的倒置显微镜、一个发光二极管（LED）光源、一个光快门，以及一个定制的基于光电二极管的光监测电路组成，该电路具有跟踪与保持功能43，一个模数/数模转换器（来自膜片钳放大器）、一个模拟脉冲发生器、一个连接至场刺激电极的外部场刺激装置、电机驱动的操纵器，以及用于数据采集、同步和协议生成的商业软件。场刺激电极由两根铂丝制成，铂丝焊接在连接至脉冲发生器的铜缆上 通过 一个BMC连接器。使用特定的激发和发射滤光片来检测EGFP和MTS-5-TAMRA信号。激发EGFP时，采用氙灯配合488 nm（± 20 nm）激发（Ex）滤光片和LP510 nm发射（Em）滤光片；对于MTS-5-TAMRA，则使用530 nm LED光源和LP550 nm发射（Em）滤光片。B) 表达 EGFP-Ca 的纤维的视野V1.1-半胱氨酸构建体与双场刺激电极（黑色圆圈）在纤维主轴（虚线）方向上正确（左）与错误（右）的放置方式。黑色空心圆圈表示由光源前方光圈开口控制直径的成像采集区域。 请点击此处以查看此图的放大版本。
5. EGFP阳性纤维电活动及半胱氨酸染色的评估
注意：骨骼肌纤维电刺激按照先前所述方法进行，并稍作修改41。该方法用于：（1）识别健康、功能完整且对电信号有反应的肌纤维；（2）用巯基反应性荧光染料对肌纤维染色；（3）记录肌纤维在动作电位传播过程中产生的荧光信号。本节及下一节的每一步操作均应在避光环境中进行，以减少荧光染料的光漂白。
- 将含有解离肌纤维的 35 mm 玻璃底培养皿置于显微镜载物台上。用 1,000 µL 移液器小心吸除培养基，并加入 2 mL 室温的任氏液（成分见表 1）。可能需要多次更换培养基，以彻底去除含有游离半胱氨酸的原始细胞培养基。
- 使用机械或电动操纵器，将两根铂丝垂直放置于培养皿底部。确保电极终端相对于肌纤维的长轴对齐，并距离纤维两端几毫米，且电极之间的间距为 5 mm（图 4B）。可通过旋转培养皿或将每个电极安装在独立的微操纵器上来进一步调整电极位置（图 4B）。
- 打开透射光，使用 20x 物镜在视野中找到肌纤维。将 EGFP 滤光立方体移入光路。
注：使用配备落射荧光装置和低倍率（2x）物镜的显微镜，可在肌纤维解离前通过检测 EGFP 表达评估构建体的转染效率（图 5A）。 - 使用遥控光闸，开启 488 nm 激发光以识别 EGFP 阳性纤维。使用电动显微镜载物台记录纤维在培养皿上的 x-y 位置。EGFP 信号在纤维内部通常呈异质性分布（图 4B）。将保存的位置对准 EGFP 信号最强的区域。
- 在识别出 EGFP 阳性纤维后，返回第一个保存的位置。使用手动触发开关，施加两个持续时间为 1 ms、幅值为 20 V 的连续刺激脉冲。将脉冲极性设置为交替。
- 刺激后，观察肌纤维对两个相反极性脉冲产生的两次同心且均匀的收缩。若对交替极性脉冲的反应表现为局部收缩或无收缩，则表明存在局部非传播性被动反应或不可兴奋性41。此类纤维应排除在后续实验之外。
- 直接向培养皿中加入 2 µL 的 10 mM MTS-5-TAMRA 溶液，并用 1,000 µL 移液器轻轻混匀（终浓度为 10 µM）。注意不要移动培养皿，否则将丢失已保存的纤维位置。孵育 4–5 分钟，使荧光硫醇分子扩散进入横小管系统腔内。
- 施加双极性重复刺激，以每秒一次的频率在 5 分钟内诱发速率为 50 Hz、持续 300 ms 的动作电位序列。
注：脉冲序列使插入 EGFP-CaV1.1 S4 区域的半胱氨酸暴露，从而与 MTS-5-TAMRA 发生反应。肌纤维对刺激产生机械收缩的能力对于横小管腔内容物与胞外环境之间的循环至关重要。 - 用 1,000 µL 移液器从培养皿中移除染色液，并替换为 2 mL 室温任氏液。可能需要 2–3 次更换，以彻底清除未结合的 MTS-5-TAMRA。让染色后的肌纤维至少恢复 10 分钟。
- 同步骤 5.6 一样，通过观察肌纤维对交替极性刺激产生的对称性收缩，重新评估纤维的健康状态和电活动。对两次刺激均无反应的纤维应排除在后续实验之外。
- 将 MTS-5-TAMRA 滤光立方体移入光路。使用遥控光闸，开启 533 nm 激发光，以确认纤维上 MTS-5-TAMRA 染色的均匀性。
注：MTS-5-TAMRA 染色后，工程化引入的和内源性的半胱氨酸均可与马来酰亚胺衍生物发生反应（图 5B）。因此，难以单独评估目标半胱氨酸的特异性反应。CaV1.1 主要在横小管中表达，形成可区分的双带状模式。使用共聚焦或落射荧光显微镜，可通过 x-y 图像确认 MTS-5-TAMRA 染色的正确性及其进入并扩散至横小管腔的情况（图 5C）。
6. 信号采集与处理
注意：在进行荧光测量之前，必须仔细设计信号采集参数，以获得最佳的信噪比。较慢的采样速率可增加光信号的检测量，但会减少在蛋白质构象重排过程中采集到的数据点数量。对于 EGFP-CaV1.1-cys，由动作电位波形诱导的电荷移动发生在约 1-10 ms 内37。为了获取足够多的时间点以追踪运动过程的动态变化，采集时间设定为每点 50 µs。
- 使用合适的放大系统将纤维置于视野中央。本实验采用60倍油镜，数值孔径（NA）为1.4的倒置物镜。通过电动载物台和光圈优化照明和纤维位置，使照明区域为直径等于纤维的圆形区域，且EGFP信号最强（图4B）。
- 确定纤维定位用于采集后，将两个独立安装的场刺激铂电极分别置于纤维两端。将电极沿纤维主轴对齐成一条直线，并使其相距5 mm，纤维位于中心（图4B）。
- 将采集系统的激发和发射滤光片设置为适用于MTS-5-TAMRA的参数。运行采集软件中编写的实验程序以启动实验。此步骤将同步触发所有下游设备（即协议编辑器、光闸、脉冲发生器）。
注意：该程序在施加场刺激前允许短暂的基线信号采集（例如10 ms），以便后续测量静息荧光。 - 使用0.5或1 ms、20 V的方波脉冲引发单个或一连串动作电位。尽可能缩短总采集时间，以避免信号漂白。
注意：即使在纤维中心进行记录，也可能出现与运动相关的荧光信号，该信号可能与蛋白-荧光团构象变化引起的荧光信号混淆（图5D）。由收缩引起的信号应晚于刺激后电荷移动的预期时间出现37。 - 为进一步区分源自S4运动的信号与纤维收缩产生的信号，向记录液中加入1 µL 100 mM的N-苄基对甲苯磺酰胺（BTS；终浓度为50 µM），以最小化收缩反应，并重复步骤6.4。在使用BTS进行药理学固定后再次检测到的信号，对应于标记S4螺旋的分子运动（图5D）。
注意：在不含工程化半胱氨酸的对照EGFP-CaV1.1中，经BTS抑制运动后不应检测到任何信号。 - 使用相同设置，在培养皿中无肌纤维或碎片的位置采集类似的信号，以获得背景荧光值。
- 将包含纤维原始荧光时间过程[Fr(t)]和背景荧光[Fb(t)]的文件导入数据分析软件。对包含Fb(t)的列取平均值，获得均一的Fb值。从Fr(t)中减去Fb，得到绝对荧光[F(t)]值。如有需要，使用平滑函数对所得信号进行平滑处理。
注意：基于本检测系统及采集频率，我们选择使用窗口为50个点的邻近平均函数进行平滑。 - 在刺激前10 ms的时间区间内对基线F(t)值取平均，获得静息荧光值（F0）。从平滑后的F(t)中减去F0，得到荧光绝对变化值[ΔF(t)]。然后，为表示相对于静息荧光的荧光随时间变化（ΔF/F0），将ΔF(t)除以F0。
- 为评估信号漂白程度，从ΔF/F0随时间变化的信号中选取刺激前和刺激后远离荧光信号的两个点。对这两个点拟合线性函数，获得基线轨迹。从ΔF/F0随时间变化的信号中减去该基线，以校正信号漂白。
- 从时间列中减去采集启动与刺激反馈信号之间的延迟，使t = 0对应电刺激的起始时刻。
注意：为便于多个信号之间的比较，通常需要对信号幅度进行归一化。可根据实验目的采用不同方法。在以下结果部分中，我们关注信号动力学，因此采用简单方法，即以每个信号达到的最小值（即负向峰值）进行归一化。
图5成像表达 EGFP-Ca 的肌纤维V1.1-cys 在未加和添加 MTS-5-TAMRA 染色条件下的代表性原始荧光记录。 (A) 解剖后未解离肌肉组织表达EGFP-Ca的透射（左）与荧光（右）图像示例V1.1 VSD-III 构建体。比例尺： 100 µm. (B表达 EGFP-Ca 的肌纤维代表性图像V1.1 VSD-III 构建体在 MTS-5-TAMRA 染色前（左）和染色后（右）。非转染纤维的内源性半胱氨酸也被染料染色。比例尺： 30 µm. (CEGFP-Ca的共聚焦图像V1.1 VSD-III 构建体（左）与 MTS-5-TAMRA 染色（右）显示典型的钙离子通道特征性双条带模式V1.1 肌纤维横管系统上的定位（底部）。比例尺： 25 µm. (D) 使用光电二极管记录的代表性荧光信号，显示在N-苄基-对甲苯磺酰胺（BTS）固定纤维前后对两次刺激的反应（蓝色轨迹为固定前，红色轨迹为固定后）。上方的黑色线条表示纤维去极化刺激方案。 通过 外加电场刺激 请点击此处以查看此图的放大版本。
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结果
当重复的场刺激引发传播的动作电位时，可以追踪特定频率去极化条件下电压传感器的运动。如图6A所示，可追踪VSD-II标记螺旋在10 Hz（即间隔100 ms）连续两次去极化刺激下的运动响应。通过从信号轨迹中减去基线，可校正信号漂白效应（图6B）。对第一次和第二次响应进行进一步的时间放大（图6C），可精确观察这些快速发生的VSD-II螺旋运动。场刺激触发信号提供的时间标记，可使第一次和第二次响应实现精度达10 µs的相对时间对齐。两个信号可通过各自最小值（即最低峰值）进行归一化处理，从而实现两种响应之间的动力学比较（图6D）。从这些相对荧光强度的记录中可以观察到，对于该电压传感器，连续去极化过程中达到峰值的时间具有可比性。
该方法可用于追踪单个电压传感器在不同频率去极化和多个动作电位下的运动，以研究其激活过程以及与电荷移动、钙电流或钙瞬变之间的关系；...
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讨论
本文介绍了一种在肌肉纤维中进行荧光停流检测（FSDF）的分步实验方案，用于研究来自CaV1.1通道的单个电压感受器的运动。尽管该技术结合了多个步骤和多种方法，看似复杂，但其中大多数技术在生物物理学家或细胞生物学家的实验室中通常都是常规使用的。因此，这种复杂性主要源于将各种方法整合为一种综合技术的过程。在执行多步骤实验方法时，初始阶段所做的微小改动往往要到后续步骤中才能显现其影响。只要在每一步操作中保持严谨，并制定明确的纳入与排除标准，就有可能从同一样本甚至同一根肌纤维中获得多次记录数据。
本文所述方法可适用于其他细胞类型，包括心肌细胞和神经元。此外，也可采用不同的检测系统，例如高速相机。目前，由于膜片钳（如膜片钳或双电极电压钳）技术本身具有较高的复杂性，其应用受到一定限制44。随着本方法的进一步改进（例如更明亮且光稳定性更强的探针），将有助于FSDF与电压钳技术的联合使用。
在原代分离的骨骼肌纤维中进行场刺激的优势在于，其通量高于电压钳技术，并且可用于研究其...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢加州大学洛杉矶分校的 J. Vergara 博士分享 EGFP-CaV1.1（兔）野生型质粒。我们感谢耶鲁大学生理学系电子实验室，特别是 Henrik Abildgaard，在带采样保持电路的光电二极管设计与构建方面提供的支持。本研究得到了美国国立卫生研究院基金 R01-AR075726 和 R01-NS103777 的资助
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 透明质酸酶 | SIGMA ALDRICH | H3884-50mg | |
| 0.5 mL Eppendorf 管 | Millipore Sigma | EP022363719-500EA | |
| 1 mL 注射器 | Millipore Sigma | Z683531-100EA | 结核菌素滑动针头 |
| 1/2” 长 29 号无菌胰岛素针头和注射器 | Becton Dikinson | 324702 | |
| 35 mm 未包被塑料培养皿 | Falcon, Corning | 353001 | |
| 60 mm 未包被塑料培养皿 | Falcon, Corning | 351007 | |
| 酒精棉签 | PDI | B60307 | |
| Alexa-533 长通滤光片组 | Chroma | 49907 | 激发：530/30x；分光镜：532；发射：550lp |
| 弧光灯 | Sutter Instrumets | LB-LS 672 | |
| 人工泪液软膏 | Akorn | NDC 59399-162-35 | |
| 硼硅酸盐玻璃巴斯德吸管 5 3/4" | VWR | 14672-200 | |
| BTS（N-苄基-对甲苯磺酰胺） | SIGMA ALDRICH | 203895 | |
| I 型胶原酶 | SIGMA ALDRICH | C0130-1g | |
| 棉签 | VWR | VWR-76048-960-BG | |
| 双电极阵列 （用于电穿孔） | BTX harvard apparatus | 45-0120 | 10 mm 2 针阵列尖端 |
| EGFP 滤光片组 | Chroma | 39002AT | 激发：480/30x；分光镜：505；发射：535/40m |
| 电穿孔装置 | BTX harvard apparatus | ECM 830 | |
| EPC10 | HEKA Elektronik GmbH (Harvard Bioscience) | 895000 | |
| FBS | Biotechne, R&D Systems | RND-S11150H | 胎牛血清 - 优质，热灭活 |
| 35 mm 玻璃盖玻片培养皿 | MatTek Life Science | P35G-1.5-14-C | |
| 异氟烷 | Fluriso（异氟烷）吸入用液体 | 502017-250ml | |
| 恒温加热垫 | Braintree scientific inc | 39DP | |
| 层粘连蛋白 | Thermo Fisher | INV-23017015 | 小鼠天然层粘连蛋白 |
| 橡胶吸头 | VWR | 82024-554 | |
| 530 nm LED | Sutter Instrumets | 5A-530 | |
| 低蛋白吸附 0.2 μm 无菌滤器 | Pall | FG4579 | Acrodisk 注射器滤器 0.2 μm Supor 膜，低蛋白吸附，无热原 |
| MEM | Invitrogen | INV-11380037 | |
| MTS-5-TAMRA | Biotium | 89410-784 | MTS-5-TAMRA |
| OriginPro 分析软件 | OriginLab Corporation | OriginPro 2022 (64-bit) SR1 | |
| 光电二极管 | 定制 | NA | |
| PlanApo 60x 油镜 1.4 数值孔径/∞/0.17 | Olympus | BFPC2 | |
| 铂丝 0.5 mm，99.9% 金属纯度 | SIGMA | 267228-1G | 用于制造场刺激电极 |
| 脉冲发生器 | WPI | Pulsemaster A300 | |
| 快门驱动控制器 | Uniblitz | 100-2B | |
| 快门 | Uniblitz | VS2582T0-100 | |
| S-MEM | Invitrogen | INV-11380037 | |
| 无菌操作台垫 | VWR | DSI-B1623 | |
| 无菌生理盐水 | SIGMA ALDRICH | S8776 | |
| Sylgard 184 硅橡胶弹性体试剂盒 | Dow Corning | 1419447-1198 | |
| 麻醉用挥发器 | Parkland Scientific | V3000PK | |
| 电压发生器 | 定制 | NA |
参考文献
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