天然细胞中的功能性定点荧光测定法，用于研究骨骼肌兴奋性

摘要

功能性定点荧光测定法是一种实时研究蛋白质结构域运动的方法。该技术在天然细胞中的应用修改现在允许检测和跟踪来自小鼠分离骨骼肌纤维中电压门控Ca²⁺ 通道的单电压传感器运动。

摘要

功能性定点荧光测定法一直是研究许多膜蛋白（包括电压门控离子通道）的结构-功能关系的首选技术。这种方法主要用于异源表达系统，以同时测量膜电流、通道活性的电表现和荧光测量，报告局部结构域重排。功能性定点荧光测量将电生理学、分子生物学、化学和荧光结合到一个广泛的技术中，允许分别通过荧光和电生理学研究实时结构重排和功能。通常，这种方法需要一个工程电压门控膜通道，其中包含可以通过硫醇反应性荧光染料测试的半胱氨酸。直到最近，用于蛋白质的定点荧光标记的硫醇反应化学仅在非洲爪蟾卵母细胞和细胞系中进行，将该方法的范围限制在原代不可兴奋细胞上。本报告描述了功能性定点荧光测定法在成人骨骼肌细胞中的适用性，以研究激发-收缩耦合的早期步骤，即肌纤维电去极化与肌肉收缩激活相关的过程。本协议描述了使用体内电穿孔将半胱氨酸工程的电压门控Ca^{2 +}通道（Ca_V1.1）设计和转染到成年小鼠短指屈肌纤维中的方法，以及功能性定点荧光测量所需的后续步骤。这种方法可以适用于研究其他离子通道和蛋白质。使用哺乳动物肌肉的功能性定点荧光测定法与研究兴奋性的基本机制特别相关。

引言

响应活细胞中已知电刺激而跟踪离子通道构象重排的能力是分子生理学有价值的信息来源¹。电压门控离子通道是感知跨膜电压变化的膜蛋白，其功能也受^{电压变化的影响}2。上个世纪电压钳技术的发展使生理学家能够实时研究电压门控离子通道响应膜去极化而携带的离子电流³。电压钳技术的使用对于理解可兴奋细胞（如神经元和肌肉）的电特性至关重要。在 1970 年代，电压钳优化允许检测电压门控钙 （Ca V） 和钠 （Na_V） 通道^4，5 中的门控电流（或电荷移动）。门控电流是非线性电容电流，由电压传感器的运动产生，以响应细胞膜⁶上的电场变化。门控电流被认为是分子重排的电表现形式，在离子^{通道打开之前}或伴随7。虽然这些电流测量提供了有关通道功能的宝贵信息，但离子电流和门控电流都是电压门^控通道7的分子间和分子内构象重排的间接读数。

功能性定点荧光测定法（FSDF;也称为电压钳式荧光测定法，VCF）是在1990年代初开发的⁸，并且首次提供了直接查看局部构象变化和通道蛋白功能的能力实时。使用通道诱变、电生理学和异源表达系统的组合，可以荧光标记和跟踪特定通道或受体的运动部分，以响应激活刺激^9，10。该方法已被广泛用于研究电压门控离子通道⁸，¹⁰，11，^12，13，14，15，¹⁶，¹⁷，^18，19中的电压传感机制。权威评论见^10，20，²¹，^22，23。

Ca V和Na_V通道对于电信号的启动和传播至关重要，由一个主α1亚基组成，该亚基具有一个中心孔和四个不相同的电压传感域²。除了它们独特的一级结构外，Ca V和Na_V通道还表示为具有辅助亚基²⁴的多亚基复合物。电压依赖性钾通道（K V）由四个亚基组成，看起来像Na_V或Ca_V²⁵的单个结构域。Ca V 和 Na_V 通道的孔形成和电压感应 α1 亚基由单个多肽编码六个独特跨膜段的四个独立结构域（S1-S6;图1A）24^，26.由S1至S4跨膜段组成的区域形成电压传感域（VSD），S5和S6跨膜段形成孔域²⁶。在每个VSD中，S4 α螺旋含有带正电荷的精氨酸或赖氨酸（图1A，B），它们响应膜去^极化而移动7。数十年的研究和高度多样化的实验方法的结果支持这样一个前提，即S4段向外移动，产生门控电流，以响应膜去极化⁶。

FSDF 测量与离子通道或其他蛋白质上的特定半胱氨酸残基（即 S4 α-螺旋）偶联的硫醇反应性染料的荧光变化，通过定点诱变工程，因为通道响应膜去极化或其他刺激起作用¹⁰。事实上，FSDF最初是为了研究K_V通道中的S4段（被提议为通道的主要电压传感器）是否在门控电荷响应^膜电位8^，10的变化而移动时移动。在电压门控离子通道的情况下，FSDF可以解析四个VSD的独立构象重排（在任何给定时间跟踪一个VSD），同时进行通道函数测量。事实上，使用这种方法，已经表明单个VSD似乎在通道激活和失活的特定方面存在差异性参与¹²，^{27，28，29，30}。确定每个VSD对通道功能的贡献具有高度相关性，可用于进一步阐明通道操作并潜在地确定药物开发的新靶点。

FSDF在异源表达系统中的使用对于我们从还原论的角度进一步理解通道功能非常有帮助^10，23。像许多还原论方法一样，它有优点，但也有局限性。例如，一个主要的限制是异源系统中通道纳米环境的部分重构。通常，离子通道与许多辅助亚基和许多其他改变其功能的蛋白质相互作用³¹。原则上，使用多个蛋白质编码构建体或多顺反子质粒可以在异源系统中表达不同的通道及其附属亚基，但它们的天然环境不能完全重建^30，32。

我们小组最近在天然解离的骨骼肌纤维中发表了FSDF的变体，用于研究激发 - 收缩耦合（ECC）的早期步骤³³，³⁴，肌肉纤维电去极化与肌肉收缩的激活相关的过程^35，36。这种方法首次允许在成人分化肌纤维³⁷的天然环境中对来自电压门控L型Ca²⁺通道（Ca_V1.1，也称为DHPR）的单个S4电压传感器进行运动跟踪。这是通过考虑这种细胞类型的多种特征来实现的，包括细胞的电活动允许快速刺激诱导的自我传播去极化，通过体内电穿孔表达cDNA质粒的能力，细胞内通道的自然高表达和区室组织，以及它与高速成像和电生理记录设备的兼容性。以前，我们使用高速线扫描共聚焦显微镜作为检测设备³⁷。现在，使用光电二极管进行信号采集，介绍了该技术的变体。这种基于光电二极管的检测系统可以促进该技术在其他实验室中的实施。

本文描述了一种在天然电池中利用FSDF研究Ca_V1.1的单个电压传感器运动的分步协议。虽然Ca_V1.1通道在整个手稿中被用作一个例子，但该技术可以应用于其他离子通道，受体或表面蛋白的细胞外可访问结构域。

方案

该协议已获得马里兰大学机构动物护理和使用委员会的批准。以下协议分为多个子部分，包括（1）分子构建体设计和半胱氨酸反应染料选择，（2） 体内 电穿孔，（3）肌肉解剖和纤维分离，（4）采集设置说明，（5）评估增强绿色荧光蛋白（EGFP）阳性纤维电活性和半胱氨酸染色，以及（6）信号采集和处理。此外，在每节的开头，在骨骼肌纤维中应用FSDF时，会详细介绍一些相关的注意事项。所有方案部分都应使用适当的个人防护设备进行，包括实验室外套和手套。

1. 分子构建体设计及半胱氨酸反应染料选择

1. 结构设计是实验成功的关键部分。首先，生成野生型荧光标记的 Ca_V1.1 cDNA 构建体，并评估其在适当细胞类型中的表达。对于肌纤维，通过使用携带巨细胞病毒（CMV）启动子的质粒可以实现强大的转染效率。在该协议中，使用了已经表征的兔EGFP-Ca_V1.1质粒³⁸。
   注意:当设计cDNA构建体以将半胱氨酸残基引入电压门控离子通道时，半胱氨酸位置至关重要，应仔细考虑。半胱氨酸应可从细胞外空间进入，以允许硫醇偶联染料反应（图1C，D），并且应靠近S4区域以精确跟踪其响应去极化的运动。然而，为了允许染料荧光猝灭响应蛋白质运动，引入的半胱氨酸偶联荧光团应位于两种不同环境的界面（例如，膜和细胞外液; 图 1E）。此外，确保插入的半胱氨酸不会干扰蛋白质功能至关重要。
2. 为了获得有关正确半胱氨酸定位的想法，请收集有关通道结构的信息或从其他相关通道蛋白的其他荧光测定实验中收集信息。对于半胱氨酸工程Ca V 1.1构建体的设计，评估通道²⁶的分离冷冻电子显微镜（cryo-EM）结构，并比较来自相关通道（如Ca_V1.2 12）或其他通道（如振动筛¹¹和NaChBac³⁹）的先前工作的半胱氨酸插入。
3. 一旦选择了适当的半胱氨酸位置，使用商业定点诱变试剂盒引入半胱氨酸替代。在本协议中，在Ca_V1.1的S4电压传感段的每个胞质端独立设计了以下半胱氨酸修饰:VSD-I（L159C），VSD-II（L522C），VSD-III（V893C），VSD-IV（S1231C）和UniProtKB:P07293（图1B）。
4. 对于骨骼肌纤维，使用5-羧基四甲基罗丹明甲硫代磺酸盐（MTS-5-TAMRA），其表现出适当和快速扩散到横小管膜系统，这是表面膜的内陷和Ca_V1.1通道的主要位置。MTS-5-TAMRA在从脂质膜过渡到水性环境时显示荧光降低（图1E）。
   注意:Dylight或Alexa-马来酰亚胺衍生物染色表面膜，但不染色横向小管系统。

图1:跨膜α螺旋界面处的硫醇-半胱氨酸反应示意图。 （A）L型Ca_V1.1膜拓扑结构。加号表示S4 α螺旋内的基本残基，橙色星星表示半胱氨酸通过定点诱变引入的位置。（B）兔Ca_V1.1的S4_I到S4_IV的序列比对（UniProtKB:P07293）。对电压检测至关重要的带正电荷的精氨酸和赖氨酸残基以红色突出显示，而工程半胱氨酸替代品以橙色表示。该面板改编自参考^文献37。（C）半胱氨酸-硫醇荧光分子反应。（D）说明跨膜电压敏感α螺旋内半胱氨酸诱变插入的图表。半胱氨酸应在休息时埋在膜中，并在去极化后可通过细胞外进入（ΔV;如果去极化（II）之前已经可以从细胞外空间获得目标半胱氨酸，或者在去极化后无法从细胞外空间进入半胱氨酸（III），则半胱氨酸示踪通常不太可能发生。（E）与硫醇荧光分子反应后，响应去极化的α螺旋运动降低了MTS-5-TAMRA荧光发射。荧光信号由S4螺旋的运动以及随后的染料相对于膜平面和水环境的运动产生。请点击此处查看此图的大图。

2. 体内 电穿孔

注意:电穿孔实验如前所述进行³⁸ ，并进行修改。在下一节中，该协议设计用于鼠标单脚垫的电穿孔。如果准备了两个爪子，则需要调整体积。

1. 将 25-100 μL 质粒溶液以 2-5 μg/μL 分装在置于冰上的 1.5 mL 管中。
2. 在无菌盐水中制备 0.5 mL 2 mg/mL 透明质酸酶溶液，并通过安装在 1 mL 注射器的低结合蛋白 0.2 μm 无菌过滤器过滤溶液。在室温下储存在 1.5 mL 管中。
3. 使用校准的麻醉装置，通过将小鼠放入麻醉室，在O₂ （1L / min）中使用3%-4.5%异氟醚麻醉小鼠。通过使用镊子捏尾巴尖端来确认动物的充分麻醉。达到最佳麻醉时不应观察到任何反应。
4. 将鼠标从麻醉室中取出，然后将麻醉鼻罩放在鼠标上。将动物仰卧在覆盖有无菌台垫的等温加热垫上。使用啮齿动物面罩在O₂ （1L / min）中使用含有3%异氟醚的啮齿动物面罩继续麻醉。
5. 为防止手术过程中眼睛干燥，请用无菌棉尖在动物的眼睛上涂抹一层细薄的人造泪霜。使用浸有乙醇的无菌湿巾对动物的爪子进行消毒。
6. 使用 0.5 英寸长的 29 G 无菌胰岛素针，吸出 20 μL 透明质酸酶溶液。在脚跟水平处穿透皮肤，并将针头皮下滑向脚趾根部（图2A）。慢慢注入溶液，同时逐渐向后移动针头。应在爪子下方观察到推注或肿块（图2B）。
   注意:根据动物的年龄和爪子的大小，可能无法注射全部溶液。通常，可能会发生通过注射点的小泄漏。
7. 如果需要，在适当的爪子消毒后使用另一根无菌针头用另一只爪子重复步骤2.6，如步骤2.5所示。
8. 通过将动物从鼻罩上取下来断开麻醉，然后将鼠标放回笼子中，随意获取食物 和水。应在~5分钟内观察到从麻醉中完全恢复。将含有质粒溶液的试管放在工作台上，使其达到室温。
9. 1小时后，第二次麻醉动物，将其放在加热垫上，并按照步骤2.3-2.5中所述对爪子进行消毒。
10. 使用步骤2.6中描述的相同技术注入10-20μL的cDNA构建体。注入的构建物总量为每爪50-100μg。如果需要，使用另一个无菌注射器对侧爪重复该过程。
11. 将动物在等温加热垫上麻醉5分钟，以使cDNA溶液均匀地分散在组织中。
12. 按照制造商的建议，打开电穿孔设备并将其连接到双电极阵列。
13. 使用饱和乙醇的湿巾对双电极阵列进行消毒。用一只手稳定爪子，首先在脚后跟的皮肤下插入一个电极。然后，将第二个电极插入脚趾的底部，确保两个电极的方向垂直于脚的轴线（图2C）。将探头定向到不会将脚或腿限制在极端角度方向的位置。
    注意:使用镊子和定期锐化电极尖端可以促进电极插入。根据动物的年龄，爪子的大小可能会有所不同，电极间距应相应地调整。
14. 通过以 1 Hz 施加 20 个脉冲（持续时间为 20 毫秒）来电穿孔肌肉。对于间隔为 1 cm 的电极针，将电压设置为 ~100 V。如果电极间距修改为达到~100 V/cm，则应进行调整。如果电极位置正确，则应在脉冲传递过程中观察到手指的轻微弯曲。
15. 如果需要，用对侧爪子重复步骤2.13和2.14。
16. 断开麻醉并将动物置于笼子中，与其非电穿孔柜台伴侣隔离， 随意获取食物 和水2小时。应在~10分钟内观察到麻醉完全恢复。将动物放回笼子内。
    注意:cDNA构建体的表达高度依赖于编码的蛋白质。蛋白质周转率、cDNA、质粒启动子的数量和质量以及其他变量都会影响构建体的表达。在该实验中，使用CMV启动子的Ca_V1.1的α1S亚基的最佳表达需要4至6周，但可以在2周内检测到长达12-15个月。

图 2:cDNA 注射和电穿孔电穿孔电极在用于电穿孔的小鼠脚垫中的定位图。 （A）透明质酸酶和cDNA注射的针头位置在小鼠脚垫下。箭头表示通过皮肤插入的点。（B）注射后应暂时观察皮肤轻微变色和爪子尺寸略有增加。（C） 电穿孔的电极阵列定位。请点击此处查看此图的大图。

3. 肌肉解剖和纤维隔离

注意:骨骼肌纤维解离按照前面描述的^37，40，41 进行修改。在下一节中，该协议适用于鼠标的两个脚垫。

1. 在纤维解离之前，通过在60mm塑料培养皿中将一份固化剂添加到10份弹性体（% w / w）中以达到~5mm的厚度来制备sylgard覆盖的板。使用前让弹性体覆盖板固化过夜。如果在使用前后正确储存并用70%乙醇消毒，可以多次重复使用。
2. 在 2 mL 的旋转器最小必需鹰培养基 （S-MEM） 中制备 4 mg I型胶原酶，并补充有 10% 胎牛血清 （FBS;终浓度为 2 mg/mL）。将溶液转移到35mm无涂层塑料板上，并将培养皿置于37°C，5%CO₂的培养箱中。
   注意:S-MEM是一种改性MEM配方，不含谷氨酰胺和Ca²⁺。在此步骤中没有Ca²⁺ 可减少酶消化和研磨过程中的纤维挛缩。
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结果

当响应于重复场刺激而触发传播动作电位时，可以跟踪特定电压传感器的运动以响应特定的去极化频率。 如图6A所示，可以跟踪VSD-II标记螺旋的运动，以响应在10 Hz（即间隔100 ms）施加的两个连续去极化中的每一个。信号漂白可以通过减去迹线的基线来校正（图6B）。对第一和第二响应的进一步时间放大（图6C）可以精确观察这些快速发展的VSD-II螺旋运动。来自场刺激触发器的时间标记允许以10 μs的精度对第一和第二响应进行相对时间对齐。两个信号都可以通过它们各自的最小值（即最小峰值）进行归一化，以便在两个响应之间进行动力学比较（图6D）。从这些相对荧光记录中可以观察到，该电压传感器的连续去极化之间的峰值时间相当。

这种方法可用于跟踪具有各种去极化频率和多个动作电位的单个电压传感器的运动，以研究它们的激活以及与电荷运动、钙电流或钙瞬变的关系，这些可以在...

讨论

本文描述了在肌纤维中进行FSDF的分步协议，以研究来自Ca_V1.1通道的单个电压传感器运动。尽管该技术中组合的步骤数量和方法的多样性可能看起来很复杂，但大多数这些技术通常用于生物物理学家/细胞生物学家实验室。因此，明显的复杂性主要在于将所有各种方法组合在一个单一的集成技术中。通常，在执行多步骤方法时，开始时进行的微小修改的影响只能在后续步骤的后面检测到。通过每个步骤的严格开发以及精确的包含和排除标准，可以从同一制备甚至同一纤维中获得多个记录。

这里描述的方法可以适用于其他细胞类型，包括心脏细胞和神经元。此外，可以使用不同的检测系统，例如高速摄像机。目前，由于这些技术固有的额外复杂性，电压钳（膜片钳或双电极电压钳）的使用受到限制⁴⁴。对本文介绍的方法（例如更亮、更光稳定性的探头）的改进将有助于FSDF与电压钳位方法的并行使用。

天然解离骨骼肌纤维中的场刺激具有比电压钳更高的通量的优点，并且可以应用于其他信号的研究，例如动作电位传播

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
透明质酸酶	SIGMA ALDRICH	H3884-50mg
0.5 mL Eppendorf 管	Millipore Sigma	EP022363719-500EA
1 mL 注射器	Millipore Sigma	Z683531-100EA	结核核滑尖
1/2" 长 29 号无菌胰岛素针头和注射器	Becton Dikinson	324702
35 mm 无涂层塑料板	Falcon， 康宁	353001
60 mm 无涂层塑料板	Falcon， 康宁	351007
酒精鞭	PDI	B60307
Alexa-533 立方体 LP	Chroma	49907	Ex： 530/30x;BS：532;Em： 550lp
弧光灯	萨特仪器	LB-LS 672
人工泪液霜	Akorn	NDC 59399-162-35
硼硅酸盐玻璃 巴斯德移液管 5 3/4"	VWR	14672-200
BTS（N-苄基-对甲苯磺酰胺）	SIGMA ALDRICH	203895
I型胶原酶	SIGMA ALDRICH	C0130-1g
棉签	VWR	VWR-76048-960-BG
双电极阵列 （用于电穿孔）	BTX 哈佛仪器	45-0120	10 毫米 2 针阵列尖端
EGFP 立方体	Chroma	39002AT	Ex： 480/30x;BS 505;Em： 535/40m
电穿孔仪设备	BTX 哈佛仪	ECM 830
EPC10	HEKA Elektronik GmbH （哈佛生物科学）	895000
FBS	Biotechne， 研发&D Systems	RND-S11150H	胎牛血清 - 高级，热灭活
玻璃盖玻片 35 毫米培养皿	MatTek Life Science	P35G-1.5-14-C
异氟醚	氟醚（异氟醚）吸入液	502017-250ml
等温加热垫	Braintree scientific inc	39DP
层粘连蛋白	Thermo Fisher	INV-23017015	层粘连蛋白小鼠蛋白，天然
乳胶灯泡	VWR	82024-554
LED 530 nm	萨特仪器	5A-530
低结合蛋白 0.2 &μ;m 无菌过滤器	颇	FG4579	acrodisk  注射器过滤器 0.2um 超膜 低蛋白结合 非热原
MEM	Invitrogen	INV-11380037
MTS-5-TAMRA	Biotium	89410-784	MTS-5-TAMRA
OriginPro 分析软件	OriginLab Corporation	OriginPro 2022（64 位）SR1
光电二极管	定制
PlanApo 60x 油  1.4 N.A/∞/0.17	奥林巴斯	BFPC2
铂丝 0.5 毫米，99.9% 金属基	SIGMA	267228-1G	制造场刺激电极
脉冲发生器	WPI	Pulsemaster A300
快门驱动控制器	Uniblitz	100-2B
Shuttter	Uniblitz	VS2582T0-100
S-MEM	Invitrogen	INV-11380037
无菌工作台垫	VWR	DSI-B1623
无菌盐水	SIGMA ALDRICH	S8776
Sylgard 184 硅胶弹性体套件	道康宁	1419447-1198
麻醉蒸发器	Parkland Scientific	V3000PK
电压发生器	Custom Made	NA